本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，涉及一種生長(zhǎng)素調(diào)控蛋白o(hù)scole1、編碼基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生長(zhǎng)素(iaa)作為最重要的植物激素之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程作為生長(zhǎng)素相關(guān)研究中最熱門(mén)的組成部分之一，在生長(zhǎng)素實(shí)現(xiàn)其生理效應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮著決定性的作用。相比于在生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸機(jī)理及生理作用研究方面取得的大量成果，生長(zhǎng)素在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程鮮有研究涉及，使得人們對(duì)于這一重要的植物生理過(guò)程仍知之甚少。

生長(zhǎng)素最明顯的作用是促進(jìn)生長(zhǎng),但對(duì)莖、芽、根生長(zhǎng)的促進(jìn)作用因濃度而異。三者的最適濃度是莖>芽>根,大約分別為每升10-5摩爾、10-8摩爾、10-10摩爾。植物體內(nèi)吲哚乙酸的運(yùn)轉(zhuǎn)方向表現(xiàn)明顯的極性，主要是由上而下。生長(zhǎng)素活化氫離子泵，降低質(zhì)膜外的ph值，還大大提高細(xì)胞壁的彈性和可塑性，從而使細(xì)胞壁變松，并提高吸水力。生長(zhǎng)素還有促進(jìn)愈傷組織形成和誘導(dǎo)生根的作用。

在植物體內(nèi)吲哚乙酸可與其它物質(zhì)結(jié)合而失去活性，可與天冬氨酸結(jié)合為吲哚乙酰天冬氨酸，與肌醇結(jié)合成吲哚乙酸肌醇，與葡萄糖結(jié)合成葡萄糖苷，與蛋白質(zhì)結(jié)合成吲哚乙酸-蛋白質(zhì)絡(luò)合物等。結(jié)合態(tài)吲哚乙酸?？烧贾参矬w內(nèi)吲哚乙酸的50-90％，可能是生長(zhǎng)素在植物組織中的一種儲(chǔ)藏形式，它們經(jīng)水解可以產(chǎn)生游離吲哚乙酸。

生長(zhǎng)素有多方面的生理效應(yīng)，這與其濃度有關(guān)。低濃度時(shí)可以促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度時(shí)則會(huì)抑制生長(zhǎng)，甚至使植物死亡。生長(zhǎng)素可刺激形成層細(xì)胞分裂；促進(jìn)木質(zhì)部、韌皮部細(xì)胞分化，促進(jìn)插條發(fā)根、調(diào)節(jié)愈傷組織的形態(tài)建成。 吲哚乙酸可造成頂端優(yōu)勢(shì)，延緩葉片衰老；生長(zhǎng)素控制幼苗中胚軸伸長(zhǎng)的可逆性紅光抑制，當(dāng)吲哚乙酸轉(zhuǎn)移至枝條下側(cè)即產(chǎn)生枝條的向地性，而吲哚乙酸轉(zhuǎn)移至枝條的背光側(cè)產(chǎn)生枝條的向光性；生長(zhǎng)素可以促進(jìn)開(kāi)花，誘導(dǎo)單性果實(shí)的發(fā)育，延遲果實(shí)成熟等。

生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸過(guò)程的實(shí)現(xiàn)，離不開(kāi)在植物體內(nèi)存在的多種生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體或通過(guò)極性定位分布于細(xì)胞膜的頂部或基部，或非極性地分布于細(xì)胞膜的兩側(cè)，通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)素的單向輸入或輸出細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)素向特定組織器官中的運(yùn)輸。就已有的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究成果來(lái)看，共有3類(lèi)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體參與介導(dǎo)了生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸過(guò)程：pin-formed蛋白質(zhì)家族轉(zhuǎn)運(yùn)體(pins)，atp結(jié)合盒b家族蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(atp-bindingcassette(abc)-b)，auxin1/like-aux1蛋白質(zhì)家族轉(zhuǎn)運(yùn)體(auxs/laxs)，且這3類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體在雙子葉植物擬南芥與單子葉植物水稻中均同源存在。植物體內(nèi)除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素動(dòng)態(tài)平衡的作用外，近年來(lái)在擬南芥細(xì)胞中中，液泡也因被發(fā)現(xiàn)其含有大量的生長(zhǎng)素代謝產(chǎn)物及具有膜定位的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體，而被認(rèn)為同樣參與了細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)素代謝調(diào)控過(guò)程。被鑒定的定位于液泡膜上的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體為wallarethin1(atwat1)，該蛋白質(zhì)在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與atpin5具有高度的相似性。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)功能的鑒定表明：atwat1可以介導(dǎo)液泡內(nèi)的iaa轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，但其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程可能需要相因的調(diào)控體進(jìn)行調(diào)控。

此外，該蛋白質(zhì)在決定植株基部自由iaa含量，細(xì)胞壁中次生壁厚度，植株高度及植物的維管束病菌抗性上具有重要作用。atwat1的發(fā)現(xiàn)，暗示在植物細(xì)胞內(nèi)存在廣泛的細(xì)胞器參與的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)過(guò)程，且該種生長(zhǎng)素調(diào)控模式可能在進(jìn)化上要早于存在于細(xì)胞與細(xì)胞之間的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸過(guò)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及到一個(gè)調(diào)控植物體內(nèi)iaa含量的蛋白o(hù)scole1以及編碼該蛋白的基因oscole1，該基因在水稻中的抑制表達(dá)導(dǎo)致植物體內(nèi)的生長(zhǎng)素含 量降低，植株變矮，葉夾角變小，開(kāi)花提前，而過(guò)表達(dá)導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)素含量增加，生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，葉夾角變大。因此該基因可用于水稻株型及花期的調(diào)控。

本發(fā)明所提供的蛋白，名稱(chēng)為oscole1，來(lái)源于水稻-日本晴，屬于調(diào)控蛋白類(lèi)。

本發(fā)明采用rt-pcr擴(kuò)增的方法，獲得了oscole1基因的cds序列。其cdna序列全長(zhǎng)為822bp(序列1)，編碼產(chǎn)生長(zhǎng)度為273氨基酸的蛋白質(zhì)序列(序列2)。

本發(fā)明把oscole1基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，啟動(dòng)子為ubiqutin，分別得到oscole1過(guò)表達(dá)(圖1)及抑制表達(dá)rnai質(zhì)粒(圖2)，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌eha105中，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型植株在正常生長(zhǎng)發(fā)育條件下的比較，結(jié)果表明，oscole1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)素含量增加，植株變大，生長(zhǎng)期變長(zhǎng)。oscole1抑制表達(dá)可降低胞內(nèi)生長(zhǎng)素含量，植株變矮，葉夾角變小，開(kāi)花提前(圖3)。進(jìn)一步分析表明水稻的第一、第二節(jié)的長(zhǎng)度受到明顯影響(圖4)。以上結(jié)果表明oscole1參與了植物株高、株型和開(kāi)花的調(diào)控。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。附圖中：

圖1為oscole1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜；

圖2為oscole1rnai載體的構(gòu)建圖譜；

圖3為oscole1轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析；

圖4為oscole1轉(zhuǎn)基因水稻第1、2、3、4節(jié)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

實(shí)施例1oscole1基因cdna的克隆

1.1rna的提取及dna的去除：

1)取約200mg日本晴幼苗為材料，液氮研磨，用trizol試劑(invitrogen)提取rna。

2)將rna溶于85μl水中，加入10×buffer10μl和5μlrq1rnafreednase(1u/μl)，37℃，15min，以去除dna的污染。

3)加入100μl的酚氯仿抽提一次，取上清，用等體積的異丙醇沉淀rna，70％的乙醇洗一次，溶于50μl的水中。

4)定量rna的濃度為1μg/μl。

1.2逆轉(zhuǎn)錄：

按照promega公司的goscript^tmreversetranscriptionsystem(promegaa5000)試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)程序如下：

1)依次加入下列試劑，混勻后進(jìn)行反應(yīng)：

2)上述反應(yīng)結(jié)束后，加入下列試劑繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)：

3)最后加入m-mlv(200u/μl)1μl；42℃，50min；70℃，15min滅活，備用。

1.3pcr擴(kuò)增：

1)pcr引物如下：

oscole1-oe-f:

5’-gtcgactctagaggatccaccatgggcgacgagaagtctccgc-3’；

oscole1-oe-r:

5’-atggtctttgtagtcggtaccgcttctgcttgctcctgttctg-3’。

2)擴(kuò)增條件：

把擴(kuò)增出dna片段從瓊脂糖膠中回收，利用重組系統(tǒng)將pcr產(chǎn)物重組到載體pcambia1303上(bamhⅰ和sacⅰ線性化)，圖1為oscole1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜，轉(zhuǎn)化e.coli，酶切鑒定后測(cè)序；

測(cè)序結(jié)果表明：得到cdna為序列1所示的基因，將該基因命名為oscole1，全長(zhǎng)822bp，具體序列如下：

atgggcgacgagaagtctccgctgagccagatgggcagccgcgaccgggaccgggagctcctcatccccgtctccggcggcggctcggcccccggagacggcgacggggacggcgacagggcggcctcctcctccgcgtccgccgctctgtcctcctccagccgcgaggcttttcataaggtggtccgaagttgggcttcaaagaaattcatgactggatgtgtaattctcttccccatagcaataacattctacatcacatggtggttcattcattttgttgacggattcttctcgccaatctatgctcaactgggaatcaacatgtttggtcttggctttatcacttctgttaccttcatatttgtggttggagtcttcatgtcatcttgggttggagcatctgtccttagccttggtgagtggattattaagcgcatgccacttgtccgtcatatctacaatgcatccaagcaaataagtgctgcaatatcaccagatcagaacaaacaggcattcaaggaagtggtcatcataaggcatcctcgtattggagaatatgcatttggtttcattacatcatcagtctctctccagagttatactggtcaagaggaactgtactgcgtgtatgtcccaaccaaccatctttatattggtgatatcttcatggtaaattcgaaggatgttataaggccaaatctttctgtccgtgaaggcatcgaaattgttgtatctggtggcatgtcgatgc cccaaattctatcaactctggacccacagacaattcttggagacagaacaggagcaagcagaagctga

其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，編碼273個(gè)氨基酸(末端終止子未計(jì)入，即序列中***號(hào)未計(jì)入)，其編碼的蛋白的氨基酸序列如下：

1.4rnai載體的構(gòu)建：

以該cdna為模板進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，rnai載體構(gòu)建的發(fā)卡rna設(shè)計(jì)為正向鏈的287到815bp，以及互補(bǔ)鏈的99到532bp。

1)pcr引物如下：

oscole1-ri-f1:

5’-gcaggtcgactctagaggatccattcttctcgccaatctatgc-3’；

oscole1-ri-r1:

5’-ggtaccagcgctatcgctgcttgctcctgttctgtct-3’；

oscole1-ri-f2:

5’-cgatagcgctggtaccacaacaatttcgatgccttca-3’；

oscole1-ri-r2:

5’-acgatcggggaaattcgagctcattcttctcgccaatctatgc-3’。

2)擴(kuò)增條件是：

把擴(kuò)增出的dna片段從瓊脂糖膠中回收，利用重組系統(tǒng)將pcr產(chǎn)物重組到載體pcambia1303上(bamhⅰ和sacⅰ線性化)，圖2為oscole1rnai載體的構(gòu)建圖譜，轉(zhuǎn)化e.coli，酶切鑒定后測(cè)序。

實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

2.1水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將成熟的水稻日本晴種子去除穎殼后，置于75％的乙醇中浸泡1-2min。去除乙醇后，加入0.1％的升汞溶液浸泡種子30min(期間定時(shí)搖晃)。去除升汞溶液，以無(wú)菌水沖洗滅菌種子3-4次。將種子置于無(wú)菌濾紙上吸干水分后，轉(zhuǎn)移至成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26℃條件下暗培養(yǎng)約2周。將成熟胚盾片長(zhǎng)出的愈傷組織小心取下，轉(zhuǎn)移到成熟胚繼代培養(yǎng)基上。在相同條件下繼代培養(yǎng)。愈傷組織每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次。挑選繼代培養(yǎng)5-7d且色澤淡黃的愈傷組織用于共培養(yǎng)。

2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子侵染液的制備

將含有相應(yīng)轉(zhuǎn)化載體的eha105農(nóng)桿菌在含有50mg/l利福平及卡那霉素的yeb固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)3d。收集培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌菌體，懸浮于共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中。調(diào)整菌體濃度至od600＝0.5后，加入乙酰丁香酮溶液至終濃度為100mm。即得到用于轉(zhuǎn)化水稻的農(nóng)桿菌侵染液。

2.3水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織，置于無(wú)菌三角瓶中。加入適量農(nóng)桿菌侵染液剛好浸沒(méi)愈傷組織。室溫放置20min，期間不斷晃動(dòng)三角瓶。倒掉菌液后，用無(wú)菌濾紙吸去愈傷組織上的多余菌液，轉(zhuǎn)移愈傷組織到鋪有一層無(wú)菌濾紙 的固體共培養(yǎng)基上，26℃黑暗培養(yǎng)2-3d。

2.4抗性愈傷組織的篩選

將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有50μg/ml潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)兩周。而后將愈傷組織轉(zhuǎn)到新的篩選培養(yǎng)基上，繼續(xù)在相同條件下篩選培養(yǎng)兩周。

2.5抗性愈傷組織的選取及分化

從經(jīng)兩輪篩選后的愈傷組織中，挑取乳黃色致密的抗性愈傷組織。轉(zhuǎn)移抗性愈傷組織至含有50μg/ml潮霉素的分化培養(yǎng)基上。26℃暗培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)移到26℃，每天15h光照的條件下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)20d左右，抗性愈傷組織上出現(xiàn)綠點(diǎn)，30-40d后進(jìn)一步分化出小苗。

2.6抗性愈傷組織生根、壯苗和移栽

當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長(zhǎng)至約2cm時(shí)，轉(zhuǎn)移小苗至生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右后，選擇葉鞘及根系均發(fā)育茁壯的轉(zhuǎn)化苗，用于移栽及轉(zhuǎn)化鑒定。

實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

3.1dna的提?。?/p>

1)剪取100mg轉(zhuǎn)基因材料葉片于液氮中速凍，轉(zhuǎn)移到盛有液氮的研缽中研磨粉碎，將粉末轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中；

2)加入600μlsds溶液，顛倒混勻，65℃水浴中放置60min，每隔15min顛倒混勻一次)；

3)加入等體積氯仿：異戊醇(v:v＝24:1)，輕輕顛倒混勻，靜置5min后，12000rpm離心15min；

4)轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，靜置5min，12000rpm離心15min；

5)棄上清，以75％乙醇洗滌沉淀，干燥，加入30μl無(wú)菌水溶解dna(無(wú)菌水中加rnase以去除rna)，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

6)取1μl提取dna電泳檢測(cè)提取濃度和質(zhì)量。

3.2pcr鑒定：

1)以提取的轉(zhuǎn)基因材料dna為模板，進(jìn)行pcr鑒定，pcr引物如下：

oscole1fw：5’-actggtcaagaggaactgtac-3’；

nosrv：5’-gaccggcaacaggattcaatc-3’。

2)擴(kuò)增條件如下：

共獲得oscole1過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株20株；rnai植株10個(gè)。

實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻性狀考察

4.1株高統(tǒng)計(jì)：

各類(lèi)轉(zhuǎn)基因材料選取灌漿期的兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，每個(gè)轉(zhuǎn)化事件隨機(jī)選取5株，所測(cè)定的株高為第一節(jié)間與根部連接處到最高稻穗頂部處的長(zhǎng)度，選取典型材料進(jìn)行拍照，oscole1轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析如圖3。

4.2節(jié)間長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)：

各類(lèi)轉(zhuǎn)基因材料選取灌漿期的一個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，每個(gè)轉(zhuǎn)化事件隨機(jī)選取5株，每株選取株高最高的4個(gè)分蘗。圖4為oscole1轉(zhuǎn)基因水稻第1、2、3、4節(jié)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)，p1302ck為對(duì)照；oscole1-rnai-1為oscole1基因抑制表達(dá)植株；oscole1-oe-1為oscole1基因過(guò)表達(dá)植株。如圖4所示，按從下至上分別為第1、2、3、4節(jié)間的順序，對(duì)節(jié)間的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明oscole1過(guò)表達(dá)植株第1、2節(jié)的長(zhǎng)度明顯大于對(duì)照，而oscole1抑制表達(dá)的植株第1、2節(jié)的長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照。

實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因水稻iaa含量測(cè)定

選取灌漿期轉(zhuǎn)基因材料中差異最大的莖稈第一、二節(jié)間進(jìn)行iaa含量的測(cè)定，具體方法如下：

1)剪取的莖稈材料，使用液氮進(jìn)行研磨粉碎。液氮環(huán)境下，準(zhǔn)確稱(chēng)取200mg的樣品，加入含有內(nèi)標(biāo)2h2-iaa(cdnisotopes)及抗氧化劑的甲醇中，-20℃過(guò)夜萃??；

2)萃取后的混合物在18000rpm，4℃的條件下離心15min。收集得到的上清液，利用氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镆?％的氨溶液溶解；

3)得到的溶解粗產(chǎn)物，利用通過(guò)4ml甲醇，4ml水，以及4ml5％的氨溶液進(jìn)行預(yù)處理的oasismaxspe柱進(jìn)行純化。當(dāng)溶解粗產(chǎn)物被加至spe柱后，依次利用4ml5％的氨溶液，4ml水，4ml甲醇進(jìn)行洗滌，得到的iaa被溶于含有5％甲酸的甲醇溶液中；

4)iaa溶液在氮?dú)獯蹈珊螅罱K使用水/甲醇(v:v＝20:80)的溶液溶解，以用于uplc系統(tǒng)的分析。

測(cè)定結(jié)果表明，oscole1過(guò)表達(dá)植株中iaa的含量達(dá)到了4.4ng/g鮮重，顯著高于轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照2.1ng/g；rnai植株則為2.1ng/g鮮重，明顯低于。

顯然，上面描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。