本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，涉及花側(cè)柏烷型倍半萜化合物及其制備方法和用途。具體涉及從百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）的樹皮中提取分離得到的兩個重排的花側(cè)柏烷型倍半萜新化合物及其制備方法。進一步經(jīng)生物活性測試證明該類化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）抑制活性，可用于制備預防、延緩或治療甲型流感及其并發(fā)癥和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。
背景技術：
：資料顯示，流行性感冒簡稱流感（influenza），是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒（influenzavirus）屬于正粘病毒科（orthomyxoviridae），根據(jù)流感病毒內(nèi)部核蛋白（nucleoprotein，np）和基質(zhì)蛋白（matrixprotein，m1）的抗原性分為甲型（a），乙型（b），丙型（c）流感病毒，目前有報道提出存在丁（d）型流感病毒（collinetal.,j.virol.2015,89:1036–1042）；其中甲型流感病毒感染的范圍最廣，常以急性呼吸道傳染病的形式出現(xiàn)，可引起世界大流行,對人類健康危害最為嚴重(baigentetal.,bioessays2003,25:657–671)，另外，由于其潛伏期短，經(jīng)呼吸道飛沫傳播，傳播迅速，抗原易發(fā)生變異，人群對變異株普遍易感，防控難度大。研究報道，h3n2是一種由粘病毒引起的嚴重的甲型流感病毒，可引起嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，通過多種動物的呼吸道傳播（狗，雞,鴨等），感染者多表現(xiàn)出普通流行性感冒的癥狀，有時會出現(xiàn)腹瀉和嘔吐，重者繼發(fā)肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。h3n2亞型流感病毒自1968年引起流感大流行以來一直是人群中存在的主要甲型流感病毒亞型，其通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換逃避宿主的免疫識別，不斷引起新的流行，近幾十年來，全世界已經(jīng)有數(shù)百萬人死于h3n2病毒引起的流感（rambautetal.,nature2008,453:615–619;johnsonetal.,bull.hist.med.2002,76:105–115）；另據(jù)報道，快速進化變異的甲型h3n2流感自產(chǎn)生后常年持續(xù)在人群中流行，每年季節(jié)性的暴發(fā)都造成全球大量的感染與死亡。實踐顯示，由于h3n2流感病毒的抗原變異能力強，加之個體免疫力的不同，有關疫苗的保護率并不高，并且h3n2病毒具有快速進化變異的特點，導致新型疫苗的研制常滯后于h3n2病毒變異的速度(bonhoefferetal.,vaccine2009,27:2289–2297)。目前用于預防和治療h3n2流感的藥物主要有金剛乙胺、奧司米韋和利巴韋林等，但是這些藥物不但具有嚴重的神經(jīng)及消化系統(tǒng)的毒副作用，而且在逐漸使用過程中產(chǎn)生了耐藥性，引起新的h3n2流感病毒耐藥株出現(xiàn)。中醫(yī)藥治療h3n2流感病毒的藥物有蓮花清瘟膠囊、清開靈口服液、雙黃連注射液、藿香正氣丸，參麥注射液等清熱解毒，增強人體免疫力的中成藥，這些藥毒副作用少，耐藥性低，綜合療效較好,但是成分和靶點不明確，導致在市場上的應用前景較少。所以開發(fā)新的治療效果好、靶點明確、副作用小的抗h3n2流感病毒的藥物已迫在眉睫。天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)復雜性和結(jié)構(gòu)多樣性的特點，是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來源。天然產(chǎn)物及其衍生物獨特的化學結(jié)構(gòu)，使其具有高藥效和對特定靶點高選擇性的優(yōu)點以及潛在的獨特的作用機制等優(yōu)點（newman,etal.,nat.prod.rep.2000,17:215–34;newmanetal.,j.nat.prod.2012,75:311–335）。研究統(tǒng)計表明瀕危植物次生代謝產(chǎn)物的成藥性較高，是發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構(gòu)和獨特作用機制的新藥物的重要來源，在國際上正引起高度重視（ibrahimetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2013,110:16832–16837;zhuetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2011,108:12943–12948）。百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）隸屬松科（pinaceae）冷杉屬（abies）植物，是一種常綠喬木，成年后高達30余米，是我國特有的面臨瀕危滅絕的珍稀樹種之一，于1992年10月被列為國家珍稀樹種第一批一級保護樹種（fuetal.,chinaplantreddatabook,sciencepress:beijing;newyork,1992）；其天然僅分布于我國浙江省慶元縣百山祖南坡海拔1740m的山脊懸?guī)r陡坡；1987年被國際自然保護聯(lián)盟（internationalunionforconservationofnature,iucn）列為全球最瀕危的12種植物之一。目前其化學成分和藥理活性尚未有任何報道。基于現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀，本發(fā)明的申請人基于即能能保護性地采集少許百山祖冷杉植物樣品，又將會積極促進利用這一瀕危珍稀資源為人類服務；擬從百山祖冷杉樹皮中分離得到具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性的花側(cè)柏烷型倍半萜新化合物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供新的花側(cè)柏烷型倍半萜化合物及其制備方法和用途，具體涉及從百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）的樹皮中提取分離得到的兩個重排的花側(cè)柏烷型倍半萜新化合物；進一步經(jīng)生物活性測試證明該類化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）抑制活性，可用于制備預防、延緩或治療甲型流感及其并發(fā)癥和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。本發(fā)明的另一目的是提供該類化合物的制備方法。本發(fā)明的重排的花側(cè)柏烷型倍半萜化合物具有如下式（?。┗瘜W結(jié)構(gòu)式：（ⅰ）本發(fā)明所述的化合物可通過從植物中分離純化得到；也可經(jīng)本領域技術人員熟知的化學方法合成獲得。本發(fā)明的實施例中，所述的化合物通過下述提取分離方法制得，其包括步驟：干燥粉碎的百山祖冷杉樹皮用甲醇室溫浸泡提取，提取液減壓回收溶劑，合并后得浸膏；浸膏用水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分；乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠、sephadexlh-20及反相半制備hplc分離制備，得到化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb。本發(fā)明對所制得的倍半萜化合物進行了生物活性測試，結(jié)果表明，所述的化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性，可進一步用于制備預防、延緩或治療甲型流感及其并發(fā)癥和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。本發(fā)明所述的化合物可單獨應用或者合用，亦可與藥學上可接受的載體或賦形劑結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服或者非口服劑型。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：所述目標化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb為非常罕見的重排的花側(cè)柏烷型倍半萜新化合物，首次從自然界種子植物門中分離得到；該類化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性，對甲型流感病毒導致的上呼吸道感染等癥狀具有預防或治療應用前景。具體實施方式下面實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將落在權利要求書的范圍內(nèi)。下述制備例中，比旋光測試通過jascop-1020旋光儀完成；紫外和紅外光譜數(shù)據(jù)分別通過shimadzuuv-2550紫外光譜儀和nicoletavatar360型紅外光譜儀獲得；nmr用brukeravanceii400型儀測定；lr-ms由agilent1100serieslc/msdg1946d型儀測定,hr-ms由absciextripletof5600型儀測定；所使用的硅膠和薄層板為煙臺康比諾公司生產(chǎn)，sephadexlh-20凝膠為瑞士gehealthcarebio-sciences公司生產(chǎn)；半制備hplc為waterse2695，配備2998pda和2424蒸發(fā)光散射雙檢測器以及sunfireods(5μm,250×10mm)半制備柱；所有試劑均為上海國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。實施例1：制備重排的花側(cè)柏烷型倍半萜新化合物取百山祖冷杉樹皮500g，粉碎后用90%甲醇室溫冷浸提取5次，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏30g。浸膏用水分散后依次用石油醚與乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部分12.0g。乙酸乙酯部分經(jīng)100-200目硅膠柱層析，以石油醚：乙酸乙酯15:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脫，得到6個組分（fr.1-fr.6）；亞組分fr.3（613mg）以石油醚：乙酸乙酯5:1-0:1梯度洗脫，得到3個組分（fr.3a-3c），其中fr.3b經(jīng)過半制備型hplc進一步分離，以45%甲醇和55%水等度洗脫（流速：3ml/min），分別得到化合物beshanzuenonea（3.5mg,tr=18.5min）和beshanzuenoneb（5.0mg,tr=21.5min）；化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb為重排的花側(cè)柏烷型倍半萜新化合物，它們的光譜及理化數(shù)據(jù)如下：beshanzuenonea:colorlessmonocliniccrystals(acetone-h2o,9:1);[α]d20–37(c0.04,meoh);uv(meoh)λmax(logε)226(0.92)nm;ecd(c1.5×10-3m,meoh),λmax(δε)214(+7.5),232(–10.3)nm;ir(kbr)νmax3426,2926,2882,2876,1726,1672,1652,1384,1261,1052,962,878cm?1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.20(3h,s,me-12),1.27(3h,s,me-14),1.45(3h,s,me-13),1.91(2h,m,h2-5),2.31(1h,m,h-4b),2.43(1h,dd,j=18.0,6.0hz,h-1a),2.45(1h,m,h-4a),2.53(1h,dd,j=18.0,3.6hz,h-1b),3.94(1h,s,h-10),6.00(1h,s,h-8),6.95(1h,m,h-2).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ39.0(c-1),138.7(c-2),130.3(c-3),22.6(c-4),33.6(c-5),39.3(c-6),193.1(c-7),126.1(c-8),208.6(c-9),84.2(c-10),50.3(c-11),26.2(c-12),25.4(c-13),24.7(c-14),170.4(c-15);(+)esimsm/z265[m+h]+,287[m+na]+,(–)esimsm/z263[m–h]－;hresimsm/z265.1435[m+h]+(calcdforc15h21o4,265.1434,δ=0.3ppm).beshanzuenoneb:colorlessmonocliniccrystals(meoh-h2o,9:1);[α]d20+25(c0.05,meoh);uv(meoh)λmax(logε)223(1.17)nm;cd(c1.9×10-3m,meoh):λmax(δε)214(+60.3),238(–36.6)nm;ir(kbr)νmax3422,2926,2882,2876,1724,1676,1652,1384,1261,1052,962,862cm?1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.14(3h,s,me-12),1.33(3h,s,me-14),1.48(3h,s,me-13),1.71(1h,m,h-5a),2.11(1h,m,h-5b),2.11(1h,m,h-4b),2.25(1h,brd,j=18.0hz,h-1a),2.35(1h,m,h-4a),2.70(1h,brd,j=18.0hz,h-1b),3.96(1h,s,h-10),5.94(1h,s,h-8),6.98(1h,brs,h-2).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ39.1(c-1),139.1(c-2),131.0(c-3),23.1(c-4),34.6(c-5),39.8(c-6),190.4(c-7),127.1(c-8),208.5(c-9),84.2(c-10),50.3(c-11),26.5(c-12),25.1(c-13),27.0(c-14),170.4(c-15);(+)esimsm/z265[m+h]+,287[m+na]+,(–)esimsm/z263[m–h]－;hresimsm/z265.1435[m+h]+(calcdforc15h21o4,265.1434,δ=0.3ppm).。實施例2：甲型流感病毒h3n2抑制活性測定細胞病變（cytopathiceffect,cpe）抑制試驗:狗腎（madin–darbycaninekidney,mdck）細胞按每毫升2.0x106個細胞的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，置37%、5%co2，培養(yǎng)24小時，形成細胞單層后，用不含血清的培養(yǎng)基（minimumessentialmedium,mem）液洗滌細胞2次，加入流感病毒液感染細胞2小時，然后換入對細胞最大無毒濃度（細胞活性＞＝95%時的濃度）以下的樣品稀釋液設置6個樣品濃度，分別為3.13,6.25,12.5,25.0,50.0和62.5μg/ml，再經(jīng)72小時培養(yǎng)后，顯微鏡下觀察細胞病變（cpe），確定樣品對流感病毒的抑制作用。每個劑量藥物設6孔加入，實驗同時設細胞對照組，陽性藥物對照組及病毒對照組與實驗組同時觀察cpe。以發(fā)生cpe細胞比例表示cpe的程度，按以下6級標準判斷：細胞正常生長，無病變出現(xiàn)(－)；病變細胞少于整個細胞單層的10％(±)；病變細胞少于整個細胞單層的25％(+)；25％－50％細胞產(chǎn)生病變(++)；50％～75％細胞產(chǎn)生病變(+++)；75％－100％細胞產(chǎn)生病變(++++)。根據(jù)cpe的程度，采用reed－muench法計算，確定藥物半數(shù)有效濃度(ic50)，實驗重復三次，結(jié)果取三次的平均值；其中陽性對照利巴韋林（ribavirin）的ic50值為15.0μg/ml；測試結(jié)果表明上述兩個化合物均表現(xiàn)出顯著的抑制活性，表明本發(fā)明所述化合物可用于制備預防、延緩或治療甲型流感及其并發(fā)癥和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。表1顯示了化合物beshanzuenonea和b抗流感病毒h3n2活性的ic50值。表1compoundic50(μg/ml)beshanzuenonea30.8±2.60beshanzuenoneb30.9±3.04ribavirin15.0±1.46當前第1頁12