本發(fā)明涉及microrna分子作為分子標(biāo)記物預(yù)后非小細(xì)胞肺癌中的用途，具體地，本發(fā)明涉及microrna分子作為分子標(biāo)記物用于預(yù)測非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險的用途，其中所述microrna分子選自microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270中的一個或多個。
背景技術(shù)：
：：利用分子生物學(xué)技術(shù)，能夠有效地通過分子水平的檢測來判斷惡性腫瘤患者腦轉(zhuǎn)移的危險性，進(jìn)而為個體化治療這些疾病提供便利。世界范圍內(nèi)，肺癌是癌癥死亡的首要因素。非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的80％，約25％的非小細(xì)胞肺癌患者會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。局部晚期非小細(xì)胞肺癌約占非小細(xì)胞肺癌的40％，并且腦轉(zhuǎn)移是局部晚期非小細(xì)胞肺癌綜合治療后最常見的失敗之一。早期非小細(xì)胞肺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險為10％。然而，局部晚期非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險要高得多，約30-50％。腦轉(zhuǎn)移嚴(yán)重危害患者的生存和生活質(zhì)量。手術(shù)和放射技術(shù)的進(jìn)步提高了局部晚期非小細(xì)胞肺癌的局部控制。系統(tǒng)化療降低了顱外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。綜合治療顯著延長了生存。近來的研究報道：局部晚期非小細(xì)胞肺癌綜合治療后的中位生存為20-43月，3年生存為34-63％。盡管如此，血腦屏障的存在致使化療對腦轉(zhuǎn)移的作用有限，從而使腦的治療相對不足。腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險隨著生存的提高而上升。研究顯示：局部晚期非小細(xì)胞肺癌患者的生存和腦轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān)，腦轉(zhuǎn)移對生存的危害逐漸上升。隨著局部和顱外遠(yuǎn)處控制的改善，降低腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險變得越來越重要。預(yù)防性腦照射能夠改善小細(xì)胞肺癌患者的生存。然而，隨機(jī)分組研究顯示：盡管預(yù)防性腦照射降低了非小細(xì)胞肺癌的腦轉(zhuǎn)移率，但是不能改善其生存。局部和顱外進(jìn)展導(dǎo)致的死亡可能掩蓋了預(yù)防性腦照射帶來的可見獲益。在綜合治療的現(xiàn)代，rtog0214的結(jié)果又一次提示并非所有的局部晚期非小細(xì)胞肺癌患者應(yīng)該接受預(yù)防性腦照射，這促使我們尋找腦轉(zhuǎn)移的高危因素，以辨別最可能獲益于預(yù)防性腦照射的腦轉(zhuǎn)移高危亞組。microrna是長約19-22個核苷酸的小片段單鏈非編碼rna。它通過有缺陷的堿基配對綁定其靶基因的3’非翻譯區(qū)的互補序列來控制基因表達(dá)，從而使靶基因在轉(zhuǎn)錄或者翻譯水平表達(dá)下調(diào)。近來microrna成為從生長發(fā)育到癌癥等很多病理生理過程的重要和革命性的保守調(diào)節(jié)因素。在不同的惡性腫瘤中，同一microrna的作用可能不同。一個microrna可以有很多屬于不同通路的靶基因，而一個基因可以被幾個microrna調(diào)控?？茖W(xué)家發(fā)展技術(shù)來識別與腫瘤分期和患者預(yù)后相關(guān)的特異的基因表達(dá)標(biāo)記，以改善預(yù)后和治療。人們使用全面轉(zhuǎn)錄研究來識別以基因表達(dá)為基礎(chǔ)的預(yù)后標(biāo)識，但是，目前為止無一能應(yīng)用于臨床。與經(jīng)典的mrna表達(dá)譜相比，microrna腫瘤表達(dá)譜似乎能夠更準(zhǔn)確地確定腫瘤亞型的分類。越來越多的證據(jù)支持實體腫瘤有特異的microrna標(biāo)記。與此同時，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的microrna的靶基因在肺癌發(fā)生中起重要作用，例如let-7、mir-34家族和mir-17-92簇。目前，科學(xué)家對microrna的靶基因的識別仍然有限。在分子框架中，成熟microrna帶電后成為microrna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(mirisc)。該復(fù)合體含有argonaute家族(一類龐大的蛋白質(zhì)家族)，與通常位于靶基因3’端非翻譯區(qū)的互補位點反應(yīng)。目前的模型認(rèn)為microrna和其靶基因的反應(yīng)起源于位于microrna的5’端的一段被稱為“種子序列”的6至8個核苷酸短片段。microrna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體能夠?qū)谢蛟倥渲贸商貏e間隔，在其中處理翻譯阻滯和mrna衰變。許多研究證實了microrna誘導(dǎo)的mrna失穩(wěn)。聯(lián)合計算預(yù)測，mrna表達(dá)譜的測量代表了識別功能microrna-靶關(guān)系的有效方法。在非小細(xì)胞肺癌中，許多不同的microrna調(diào)節(jié)異常，可能有致癌或抑癌作用，并預(yù)測預(yù)后。識別能夠預(yù)測肺癌患者預(yù)后的microrna是一項重要發(fā)現(xiàn)，這表明microrna可能在腫瘤進(jìn)展中起重要作用?，F(xiàn)行的臨床病理分期在預(yù)測患者腦轉(zhuǎn)移上有其局限性。具有相似臨床病理特點或者相同分期的肺癌患者的腦轉(zhuǎn)移預(yù)后可能明顯不同。分子標(biāo)記物可以幫助醫(yī)生鑒別高?；颊?，以便給予患者個體化治療，從而改善生存。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的自然進(jìn)程包括：腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落、對趨化因子的應(yīng)答、侵入并降解胞外基質(zhì)、血管再生、最終在靶器官內(nèi)成功生長。盡管近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，更加深入了解惡性腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制成為可能，但與其他器官轉(zhuǎn)移相比，我們對介導(dǎo)肺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還不十分清楚，這主要因為腦組織具有一些不同于其他組織器官的特性，包括：存在血腦屏障、自我血流調(diào)節(jié)、缺乏淋巴引流及受損神經(jīng)元無法再生等。轉(zhuǎn)移至腦的腫瘤細(xì)胞必須先黏附至微血管內(nèi)皮細(xì)胞，穿過血腦屏障，進(jìn)入腦實質(zhì)，生成血管。肺癌，特別是腺癌，是腦轉(zhuǎn)移的主要來源，部分原因是肺癌細(xì)胞很容易通過由肺至腦的動脈循環(huán)到達(dá)腦。腦轉(zhuǎn)移是肺腺癌治療失敗的重要原因。目前僅有3項研究涉及到非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的microrna表達(dá)差異，然而，這些研究的樣本量太少，并且缺乏完整的機(jī)制研究。目前為止，沒有較成熟的分子標(biāo)記物可以或預(yù)期可能應(yīng)用于臨床來預(yù)測非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移高危亞群。技術(shù)實現(xiàn)要素：我們的前期研究聚焦于217名完全切除術(shù)后病理ⅲa-n2期非小細(xì)胞肺癌患者，評價該組人群的腦轉(zhuǎn)移的臨床危險因素。在多因素分析中，非鱗狀細(xì)胞癌(rr:4.13,95％ci:1.86—9.19和p＝0.001)和淋巴結(jié)比率≥30％(rr:3.33,95％ci:1.79—6.18和p＝0.000)與腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險升高顯著相關(guān)。腺鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌的腦轉(zhuǎn)移率分別為41.7％(5/12)、35.7％(40/112)、16.7(1/16)和8.0％(7/87)。所以，我們選擇了其中腺癌/腺鱗癌的患者的福爾馬林固定石蠟包埋的手術(shù)腫瘤標(biāo)本，采用高通量microrna表達(dá)譜芯片技術(shù)研究腦轉(zhuǎn)移的microrna標(biāo)記，為將來深入研究microrna在肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制和臨床應(yīng)用篩選可能獲益于預(yù)防性腦照射的腦轉(zhuǎn)移高危亞組打下良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明人運用microrna基因芯片及qrt-pcr技術(shù)對我國非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行了研究，出人意料的發(fā)現(xiàn)，microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p在腦轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯上調(diào)，而microrna-4270在腦轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯下調(diào)。這6個microrna的表達(dá)水平和腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險顯著相關(guān)，它們組成的microrna標(biāo)記是腦轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素。本發(fā)明涉及一組標(biāo)志基因microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270在用于預(yù)測非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險中的用途。具體的，基因microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270表達(dá)情況可作為非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移判斷的標(biāo)志。通過該預(yù)后模型，可以將非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移分為低危險性、高危險性兩種類型，不同類型采用不同治療方案，低危險性病變可以采用局部手段如手術(shù)、局部放療等，而對于高危險性病變，治療則相對激進(jìn)，在手術(shù)、放化療同時，則需要輔以全腦放療。從而對非小細(xì)胞肺癌治療模式的改變具有劃時代意義。本發(fā)明涉及的檢測方法包括microrna提取、基因芯片制作、雜交及qrt-pcr驗證?；蛐酒瑱z測主要用于篩選與腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，篩選出的基因通過qrt-pcr進(jìn)行結(jié)果驗證。鑒于發(fā)明人已經(jīng)找到和非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，在今后臨床應(yīng)用中，僅運用microrna提取及qrt-pcr兩種技術(shù)即可。這兩種方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員為常規(guī)操作。因此，該模型在臨床中容易被推廣。一方面，本發(fā)明提供了一種或多種特異地檢測microrna分子表達(dá)譜的引物和/或探針在制備用于預(yù)測非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險的試劑中的用途，其中所述microrna分子表達(dá)譜包含選自microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270中的一個或多個。另一方面，本發(fā)明提供了一種或多種特異地檢測microrna分子表達(dá)譜的引物和/或探針在制備用于預(yù)測非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險的試劑中的用途，其中所述microrna分子表達(dá)譜由microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270組成。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明以上所述的用途，其中所述的非小細(xì)胞肺癌選自腺鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌。另一方面，本發(fā)明提供了一種或多種特異地檢測microrna分子表達(dá)譜的引物和/或探針在制備用于預(yù)后非小細(xì)胞肺癌的試劑中的用途，其中所述microrna分子表達(dá)譜包含選自microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270中的一個或多個。本發(fā)明還提供了一種或多種特異地檢測microrna分子表達(dá)譜的引物和/或探針在制備用于預(yù)后非小細(xì)胞肺癌的試劑中的用途，其中所述microrna分子表達(dá)譜由microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270組成。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中，根據(jù)預(yù)后結(jié)果確定是否采用選自放療或化療的輔助性治療。本發(fā)明還提供了一種用于測定microrna分子表達(dá)譜的試劑盒，其中所述表達(dá)譜包含或由以下組成：microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，其包含a)特異性擴(kuò)增表達(dá)譜的引物和/或探針，或者b)特異性檢測表達(dá)譜的核酸微陣列。附圖說明圖1a至圖1f表示為根據(jù)腦轉(zhuǎn)移模型表達(dá)情況，分析芯片組中非小細(xì)胞肺癌患者腦轉(zhuǎn)移情況。圖1a－1f分別表明microrna-193a-5p,microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p、microrna-4270的表達(dá)和腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系。圖2-1-a至圖2-6-b顯示為定量pcr驗證的microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270的表達(dá)和腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系。bm，腦轉(zhuǎn)移組；nbm，非腦轉(zhuǎn)移組。具體實施方式在本發(fā)明的一個具體實施方案中，尋找檢測待測樣品中腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)情況的大致方法如下：患者和標(biāo)本我們回顧了2003年1月至2005年12月，在我院完全切除術(shù)后病理ⅲa-n2期肺腺癌或腺鱗癌并且術(shù)前未接受放化療或其他針對腫瘤的治療的患者。分期標(biāo)準(zhǔn)為第六版美國癌癥分期聯(lián)合委員會(greene,2002)。同時患有其它原發(fā)腫瘤或之前有肺癌病史的患者排除在本研究之外。入組患者具有療前的腦磁共振或ct檢查。我們回顧了患者的病歷和隨訪資料，以記錄患者和治療特點及復(fù)發(fā)模式。全部患者均知情同意。病例篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：醫(yī)學(xué)病案記錄完備；患者術(shù)后生存大于4個月；隨訪完整；福爾馬林固定石蠟包埋的手術(shù)腫瘤標(biāo)本完好，并且標(biāo)本腫瘤含量大于75％。最后我們共篩選出87例標(biāo)本，包括腦轉(zhuǎn)移組32例和非腦轉(zhuǎn)移組55例。與非腦轉(zhuǎn)移組比較，腦轉(zhuǎn)移組有更多的患者接受過術(shù)后放療，并有更多的患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個數(shù)和切除淋巴結(jié)個數(shù)的比率(淋巴結(jié)比率)≥1/3。除此之外，兩組間性別、年齡、病理類型及分化、吸煙史、t分期和是否接受過輔助化療等特點都是相匹配的。通過基因芯片檢測腫瘤組織標(biāo)本，篩選出以下腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因：microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270。芯片數(shù)據(jù)處理采用sam(significanceanalysisofmicroarrays)軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選：上調(diào)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)q-值≤5％；(2)差異倍數(shù)≥2；下調(diào)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)q-值≤5％；(2)差異倍數(shù)≤0.5。聚類分析軟件為cluster3.0，采用hierarchical，mediancenter(gene)，averagelinkage算法。將腦轉(zhuǎn)移組和非腦轉(zhuǎn)移組表達(dá)顯著差異的microrna表達(dá)值按照其中位值分為低表達(dá)和高表達(dá)，隨后進(jìn)行單因素cox回歸分析腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險。保護(hù)性microrna的風(fēng)險比<1，危險性microrna的風(fēng)險比>1。之后，將每個腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的microrna表達(dá)值乘以其單因素cox回歸系數(shù)，b，而后線性相加作為每名患者的腦轉(zhuǎn)移危險分?jǐn)?shù)。公式如下：危險分?jǐn)?shù)＝b1gl+b2g2+b3g3+…+bngn(b：回歸系數(shù)，g：mirna表達(dá)值，n：mirna個數(shù))。然后基于危險分?jǐn)?shù)中位值將患者分為高危組和低危組，利用log-rank方法比較兩組腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險。多因素cox回歸分析影響腦轉(zhuǎn)移的獨立變量。所有統(tǒng)計檢驗為雙向，p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。統(tǒng)計分析應(yīng)用spss18.0。預(yù)后模型驗證利用根據(jù)microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270基因序列設(shè)計的引物行pcr擴(kuò)增。取2～4微升pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％非變性(不加甲醛)瓊脂糖凝膠電泳檢測。pcr數(shù)據(jù)收集及處理采用u6rna作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行歸一化處理。利用芯片所得模型評價預(yù)后。本發(fā)明將在下面的實施例中進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。實施例、rna提取、質(zhì)量檢測、芯片雜交及數(shù)據(jù)處理一、檸檬油精脫蠟處理石蠟包埋組織石蠟包埋組織樣品的預(yù)處理：石蠟包埋組織如果已經(jīng)切片，可選需厚度不大于50μm的切片十片左右，盡量除去周圍石蠟，置于1.5ml離心管中。石蠟包埋組織如果是一整塊，可用鋒利刀片將組織輕輕刮下來并置于1.5ml離心管，盡量避免刮下石蠟。刮下的組織量控制在100mg以內(nèi)。檸檬油精脫蠟處理：離心管中加入1ml檸檬油精(limonen)，55℃震蕩混勻5min。13,200rpm室溫離心2min，棄上清。此步驟總共進(jìn)行3次。加入1ml無水乙醇至離心管中，55℃震蕩混勻2min，13,200rpm室溫離心2min，棄上清。重復(fù)此步驟一次。棄上清，室溫短暫離心，用移液器將剩余的無水乙醇吸出。將離心管置于真空干燥儀中，抽干至組織呈干燥的粉末狀。肺組織標(biāo)本的rna、microrna的提取組織rna的提取全部過程嚴(yán)格按照trizol試劑盒說明書進(jìn)行，在無rna酶環(huán)境下操作，所用試管吸頭及溶液均常規(guī)用1％depc水處理(tris除外)，室溫過夜。(1)分別取凍存的肺癌組織、癌旁正常組織各50～loomg，置入預(yù)先加入0.5mltrizol裂解液的1.5mleppendorf中，用勻漿器不斷研磨成漿液狀，并添加trizol裂解液至1ml。(2)15～30℃下孵育5分鐘使核蛋白復(fù)合物完全溶解，每1mltrizol反應(yīng)液加氯仿0.2ml，強烈震蕩15秒，15～30℃孵育2～3分鐘。(3)4℃12,000g離心15分鐘，移上清至另一eppendorf管中，體積約為加入trizol反應(yīng)液體積的60％。(4)沉淀rna：每1mltrizol加0.5ml異丙醇，15～30℃下孵育lo分鐘。(5)2～8℃≤12，000g離心10分鐘。(6)棄上清，70％乙醇(用depc處理的三蒸水配制)≥lml漂洗2次。(7)2～8℃≤7，500g離心5分鐘。(8)真空抽干rna，溶解于50μldepc水中。-70℃保存?zhèn)溆谩?9)rna定量及電泳鑒定a.取lμlrna溶液加100μl水，混勻后用紫外可見分光光度計測定a260、a280及a260/a280比值，并讀出rna濃度。應(yīng)為1.8～2.0。b.1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定rna質(zhì)量：①電泳槽用0.3％的h202浸泡30分鐘，用depc水沖洗晾干。②制膠(20ml)，含瓊脂糖0.24g、無rnaase水17.4ml、10×mops2ml、37％甲醛0.6ml、eblml，將瓊脂糖加水微波爐加熱融化后，加10×mops，待凝膠冷卻至60℃再加甲醛和eb。然后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固后使用。③將凝膠預(yù)電泳5min，電壓降為5v/cm。④取適量的rna，加入電泳緩沖液(10×)2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺l0μl混勻，置60℃保溫10min，冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻，取適量加樣于凝膠點樣孔內(nèi)。同時點rna標(biāo)準(zhǔn)品。⑤電泳結(jié)束后在紫外燈下拍照。電泳后應(yīng)見28s及18s兩條條帶，且28s：18s比值大于2，說明rna未降解。細(xì)胞小rna的提取細(xì)胞系小分子rna(≤200nt)的提取用mirvanatmmirna提取試劑盒按照說明書提取。方法簡述如下：細(xì)胞(<107)收集后用600μl裂解/結(jié)合緩沖液裂解(取適量組織(<250mg)，于液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至600μl裂解/結(jié)合緩沖液中裂解)，再加入60μlmirna勻漿液，在冰上放置lomin。加入600μl酸酚/氯仿，劇烈混勻30-60s后于室溫以10000rpm離心5min(完全分層)。小心吸取上清轉(zhuǎn)移至新的無rnase1.5ml離心管中。加入l/3體積的無水乙醇，完全混勻后加入到裝在收集管中的離心柱中(每次最多700μl)，室溫以10000rpm離心lmin，收集流出液。在收集的流出液中再加入其2/3體積的無水乙醇，完全混勻后再加入到裝在收集管中的另一新的離心柱中，室溫以l0000rpm離心lmin，棄掉流出液。離心柱中加入700μlmirna洗液1，離心5-10s漂洗。再按上述方法用500μl洗液2/3漂洗兩次。再離心lmin以完全去掉乙醇。加100μl室溫的洗脫液，l0000rpm離心lmin，回收rna。rna稀釋25倍后，紫外分光光度計測其od260及od280的值，并計算od260/d280，比值大于1.8時，表明rna純度較好。同時根據(jù)od260計算rna的濃度。affxmirna表達(dá)譜芯片實驗(1)稀釋atpmix以totalrna起始量為1μg為例，取一1.5mlep管，加入500μl1mmtriscl，再加入1μlatpmix(vial3),充分混勻，瞬時離心(～5sec)收集溶液于管底，放置于冰上。(2)poly(a)tailinga.取一支0.2mlep管，加入1ugtotalrna。如果樣品體積超過8μl，使用真空濃縮儀濃縮至8μl以下，用rnase-freewater定容至8μl。b.加入2μlrnaspikecontrololigos(vial8)，置于冰上。c.制備poly(a)加尾mix。d.將5μlpoly(a)tailingmix轉(zhuǎn)移至上述10μlrna/spikecontrol混合物中，終體積為15μl；輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻，瞬時離心(～5sec)收集溶液于管底。e.37℃溫育15min，之后置于冰上進(jìn)行下一步。(3)生物素標(biāo)記mirnaa.加4μl5xflashtagligationmixbiotin(vial5)至上述15μl反應(yīng)體系中。b.加2μlt4dnaligase(vial6)，至終體積21μl輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻。瞬時離心(～5sec)收集溶液于管底。c.25℃溫浴30min。d.加2.5μlstopsolution(vial7)終止反應(yīng)，輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻。瞬時離心(～5sec)收集溶液于管底，置于冰上。(4)芯片雜交a.取出芯片平衡芯片至室溫。b.配制雜交液。輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻，瞬時離心(～5sec)收集溶液于管底。c.取81.7μl雜交液加入到標(biāo)記好的mirna體系中，輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻，瞬時離心(～5sec)收集溶液于管底。d.將雜交液置于加熱塊上，99℃溫育5min。e.將99℃已溫育5min的雜交液轉(zhuǎn)移到另一加熱塊上，45℃溫育5min。f.從加熱塊上取出雜交液，微型離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心5min，以除去雜交混合液中的不溶性物質(zhì)。g.注入100μl雜交液至芯片中。h.將芯片平衡放置于雜交爐中，48℃，60rpm旋轉(zhuǎn)雜交16hr。(5)芯片清洗染色、掃描a.雜交結(jié)束前，打開gcos軟件，建立實驗信息，包括輸入芯片的barcode。b.準(zhǔn)備fluidicsstation，運行prime。c.從stainmodule,box1中分裝以下試劑，體積足夠為一張芯片使用：600μlstaincocktail1到1.5ml棕色ep管600μlstaincocktail2到1.5mlep管800μlarrayholdingbuffer到1.5mlep管。d.雜交結(jié)束后，吸走雜交液，注入100μlarrayholdingbuffer。e.在fluidics對話框中，選擇experimentname即fs450_0003，根據(jù)芯片類型不同選擇相應(yīng)的protocol，各個protocol所對應(yīng)的詳細(xì)過程如表1所示，點擊運行，開始芯片清洗染色，這個過程大約需要90min完成。f.芯片掃描，如果不馬上進(jìn)行掃描，芯片可以在4℃避光貯存直至掃描。結(jié)果定量pcr的驗證結(jié)果表明，microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p水平在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯上調(diào)，而microrna-4270表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯下調(diào)。證明了這些microrna分子可用于預(yù)測非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生。表1、microrna標(biāo)記的低危組和高危組的腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險比較。參考文獻(xiàn)al-nedawi,k.,meehan,b.,micallef,j.,lhotak,v.,may,l.,guha,a.,andrak,j.(2008).intercellulartransferoftheoncogenicreceptoregfrviiibymicrovesiclesderivedfromtumourcells.naturecellbiology10,619-624.arora,s.,ranade,a.r.,tran,n.l.,nasser,s.,sridhar,s.,korn,r.l.,ross,j.t.d.,dhruv,h.,foss,k.m.,andsibenaller,z.(2011).microrna‐328isassociatedwith(non‐small)celllungcancer(nsclc)brainmetastasisandmediatesnsclcmigration.internationaljournalofcancer.baek,d.,villen,j.,shin,c.,camargo,f.d.,gygi,s.p.,andbartel,d.p.(2008).theimpactofmicrornasonproteinoutput.nature455,64-71.calin,g.a.,ferracin,m.,cimmino,a.,dileva,g.,shimizu,m.,wojcik,s.e.,iorio,m.v.,visone,r.,sever,n.i.,fabbri,m.,etal.(2005).amicrornasignatureassociatedwithprognosisandprogressioninchroniclymphocyticleukemia.nengljmed353,1793-1801.calin,g.a.,liu,c.g.,sevignani,c.,ferracin,m.,felli,n.,dumitru,c.d.,shimizu,m.,cimmino,a.,zupo,s.,dono,m.,etal.(2004a).micrornaprofilingrevealsdistinctsignaturesinbcellchroniclymphocyticleukemias.procnatlacadsciusa101,11755-11760.du,l.,andpertsemlidis,a.(2010).micrornasandlungcancer:tumorsand22-mers.cancerandmetastasisreviews29,109-122.favaro,e.,ramachandran,a.,mccormick,r.,gee,h.,blancher,c.,crosby,m.,devlin,c.,blick,c.,buffa,f.,andli,j.l.(2010).microrna-210regulatesmitochondrialfreeradicalresponsetohypoxiaandkrebscycleincancercellsbytargetingironsulfurclusterproteiniscu.plosone5,e10345.foekens,j.a.,sieuwerts,a.m.,smid,m.,look,m.p.,deweerd,v.,boersma,a.w.m.,klijn,j.g.m.,wiemer,e.a.c.,andmartens,j.w.m.(2008).fourmirnasassociatedwithaggressivenessoflymphnode-negative,estrogenreceptor-positivehumanbreastcancer.proceedingsofthenationalacademyofsciences105,13021.giannakakis,a.,huang,j.,greshock,j.,liang,s.,katsaros,d.,weber,b.l.,sandaltzopoulos,r.,simon,c.,coukos,g.,andzhang,l.(2008).mir-210linkshypoxiawithcellcycleregulationandisdeletedinhumanepithelialovariancancer.cancerbiology&therapy7,255.huang,x.,ding,l.,bennewith,k.l.,tong,r.t.,welford,s.m.,ang,k.k.,story,m.,le,q.t.,andgiaccia,a.j.(2009).hypoxia-induciblemir-210regulatesnormoxicgeneexpressioninvolvedintumorinitiation.molecularcell35,856-867.komaki,r.,scott,c.b.,sause,w.t.,johnson,d.h.,andtaylor,s.g.(1997).inductioncisplatin/vinblastineandirradiationvs.irradiationinunresectablesquamouscelllungcancer:failurepatternsbycelltypeinrtog88-08/ecog4588.intjradiatoncolbiolphys39,537-544.lawrie,c.h.,chi,j.,taylor,s.,tramonti,d.,ballabio,e.,palazzo,s.,saunders,n.j.,pezzella,f.,boultwood,j.,andwainscoat,j.s.(2009).expressionofmicrornasindiffuselargebcelllymphomaisassociatedwithimmunophenotype,survivalandtransformationfromfollicularlymphoma.journalofcellularandmolecularmedicine13,1248-1260.lebanony,d.,benjamin,h.,gilad,s.,ezagouri,m.,dov,a.,ashkenazi,k.,gefen,n.,izraeli,s.,rechavi,g.,pass,h.,etal.(2009).diagnosticassaybasedonhsa-mir-205expressiondistinguishessquamousfromnonsquamousnon-small-celllungcarcinoma.jclinoncol27,2030-2037.mack,m.,kleinschmidt,a.,bruhl,h.,klier,c.,nelson,p.j.,cihak,j.,plachy,j.,stangassinger,m.,erfle,v.,andschlondorff,d.(2000).transferofthechemokinereceptorccr5betweencellsbymembrane-derivedmicroparticles:amechanismforcellularhumanimmunodeficiencyvirus1infection.naturemedicine6,769-775.ortholan,c.,puissegur,m.p.,ilie,m.,barbry,p.,mari,b.,andhofman,p.(2009).micrornasandlungcancer:newoncogenesandtumorsuppressors,newprognosticfactorsandpotentialtherapeutictargets.currentmedicinalchemistry16,1047-1061.roybal,j.d.,zang,y.,ahn,y.h.,y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