本發(fā)明涉及一種dna銀納米團(tuán)簇檢測單堿基錯配位置的方法及其試劑盒，屬于生物分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

基因變異與許多人類遺傳疾病有著緊密的關(guān)系，其中發(fā)生頻率最高，包含信息最多的是單堿基多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)。單堿基基因突變的檢測對于癌癥病人的早期診斷是非常重要的。目前檢測單堿基基因突變的方法主要分為兩大類，一類是基于酶促反應(yīng)的精確基因測序，比如基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)的第二代測序技術(shù)。這類基于酶促反應(yīng)的檢測方法步驟復(fù)雜，耗時長和花費(fèi)高，更重要的是多數(shù)情況下，對于一條特定的dna基因序列，通過精確的基因測序檢測該條鏈上的所有堿基是不必要的，因?yàn)槲覀冎皇顷P(guān)心某些與疾病相關(guān)的特定基因點(diǎn)突變。另外一類是dna生物傳感器。最近幾年，dna生物傳感器引起了人們很大的關(guān)注，這類檢測方法對于特定基因點(diǎn)突變引起的疾病(如鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥、鼠類肉瘤病毒癌、地中海貧血等)的檢測是十分有效的。但是傳統(tǒng)的dna生物傳感器只能確定基因序列上是否存在基因突變，并不能準(zhǔn)確的檢測出突變堿基的位置。

以dna為模板合成的銀納米簇?fù)碛胁淮笥?nm的尺寸、接近于電子的費(fèi)米波長，展示出了分立的電子能級，并通常伴隨著熒光的發(fā)射，表現(xiàn)出很多“人工原子”的性質(zhì)。與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)相比，dna銀納米簇具有包括較寬的發(fā)射波長范圍和較大的斯托克斯位移在內(nèi)的突出的光學(xué)性質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種dna銀納米團(tuán)簇檢測單堿基錯配位置的方法及其試劑盒，該方法相比較與精確的dna測序技術(shù)，本發(fā)明整個過程不涉及酶促反應(yīng)，一次雜交反應(yīng)即可，步驟簡單，快速方便，價(jià)格低廉；相比較與傳統(tǒng)的dna生物傳感器，本發(fā)明不僅能確定是否存在單堿基錯配，而且還能精確檢測出單堿基錯配的位置。

本發(fā)明提供的一種用于檢測單堿基錯配位置的試劑盒，所述試劑盒為下述(1)或(2)：

(1)所述試劑盒包括dna銀納米簇探針ⅰ和dna銀納米簇探針ⅱ；所述dna銀納米簇探針ⅰ和所述dna銀納米簇探針ⅱ是分別以dna探針ⅰ和dna探針ⅱ為模板合成得到的帶有銀納米簇的探針；

所述dna探針ⅰ的序列自5’至3’的方向依次為銀納米簇模板序列和雜交序列ⅰ， 所述dna探針ⅱ的序列自5’至3’的方向依次為雜交序列ⅱ和銀納米簇模板序列，所述雜交序列ⅱ和所述雜交序列ⅰ自5’至3’的方向依次連接構(gòu)成的序列與完全匹配的目標(biāo)dna的序列反相互補(bǔ)且完全匹配；所述完全匹配的目標(biāo)dna為未發(fā)生任何單堿基錯配的dna；

(2)所述試劑盒包括dna探針ⅰ和dna探針ⅱ；所述dna探針ⅰ的序列自5’至3’的方向依次為銀納米簇模板序列和雜交序列ⅰ，所述dna探針ⅱ的序列自5’至3’的方向依次為雜交序列ⅱ和銀納米簇模板序列，所述雜交序列ⅱ和所述雜交序列ⅰ自5’至3’的方向依次連接構(gòu)成的序列與完全匹配的目標(biāo)dna的序列反相互補(bǔ)且完全匹配；所述完全匹配的目標(biāo)dna為未發(fā)生任何單堿基錯配的dna。

上述的試劑盒中，所述銀納米簇模板序列可為5’-ccctaactcccc-3’。

上述的試劑盒中，所述dna銀納米簇探針ⅰ和dna銀納米簇探針ⅱ的摩爾比可為1：1；所述dna探針ⅰ和所述dna探針ⅱ的摩爾比為1：1。

上述的試劑盒中，所述dna銀納米簇探針ⅰ和所述dna銀納米簇探針ⅱ均以水溶液的形式存在，所述水溶液中，所述dna銀納米簇探針ⅰ或所述dna銀納米簇探針ⅱ的摩爾濃度可為1～20um，具體可為15um，溶劑可為ph為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液。

上述的試劑盒中，具體地，所述雜交序列ⅰ的長度與所述雜交序列ⅱ的長度相等或相差一個堿基。

上述的試劑盒中，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為所述完全匹配的目標(biāo)dna自5’至3’的方向或自3’至5’的方向依次發(fā)生錯配的目標(biāo)dna，其數(shù)目由所述完全匹配的目標(biāo)dna的堿基數(shù)決定。

上述的試劑盒中，所述完全匹配的目標(biāo)dna的序列具體可為5’-aacttcttgctgtatcttctatgtcgttcttcaa-3’，所述dna銀納米簇探針ⅰ的序列可為5’-ccctaactccccagatacagcaagaagtt-3’；所述dna銀納米簇探針ⅱ的序列可為5’-ttgaagaacgacatagaccctaactcccc-3’。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用上述試劑盒檢測單堿基錯配位置的方法，包括如下步驟：

(1)按照所述完全匹配的目標(biāo)dna設(shè)計(jì)合成一系列不同錯配位置的目標(biāo)dna；

(2)將所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ與不同錯配位置的目標(biāo)dna雜交，激發(fā)測量得到的不同雜交體系的熒光強(qiáng)度，建立錯配位置和熒光強(qiáng)度的工作曲線；

(3)將所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ與待測目標(biāo)dna雜交，激發(fā)測量得到的雜交體系的熒光強(qiáng)度，根據(jù)所述工作曲線即可得到所述待測目 標(biāo)dna的錯配位置。

上述檢測方法，所述錯配為所述完全匹配的目標(biāo)dna中的堿基自5’至3’的方向或自3’至5’的方向依次錯配，得到各個錯配位置下的目標(biāo)dna，具體地，當(dāng)所述完全匹配的目標(biāo)dna為對稱結(jié)構(gòu)時，可將單堿基錯配的位置從目標(biāo)dna的中間位置依次向端側(cè)移動得到一系列不同錯配位置的目標(biāo)dna。

上述的檢測方法，當(dāng)所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ與不同錯配位置的目標(biāo)dna雜交后，兩個探針中的銀納米簇會靠近產(chǎn)生熒光增強(qiáng)，當(dāng)目標(biāo)dna上有錯配堿基時，熒光增強(qiáng)效果減弱，并且錯配堿基在目標(biāo)dna上不同的位置，會導(dǎo)致兩個銀納米團(tuán)簇之間距離的變化，利用表面等離子體共振增強(qiáng)熒光對距離變化的敏感性，產(chǎn)生不同強(qiáng)度的熒光信號。

上述的檢測方法，所述雜交時，所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ和所述完全匹配的目標(biāo)dna的摩爾比為1：1：1；所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ和所述不同錯配位置的目標(biāo)dna的摩爾比為1：1：1。

上述的檢測方法中，所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ與不同錯配位置的目標(biāo)dna形成的雜交體系中，所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ和所述不同錯配位置的目標(biāo)dna的摩爾濃度為1um～20um(具體可為7.28um)，溶劑為ph為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液；

所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ與待測目標(biāo)dna形成的雜交體系中，所述dna銀納米簇探針ⅰ、所述dna銀納米簇探針ⅱ和所述待測目標(biāo)dna的摩爾濃度為1um～20um(具體可為7.28um)，溶劑為ph為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液。

上述的檢測方法中，所述激發(fā)波長具體可為555nm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下特點(diǎn)：

1、通過熒光光譜檢測，操作簡單；

2、通過dna模板合成銀納米團(tuán)簇作為信號單元，不需要熒光團(tuán)的標(biāo)記與修飾，步驟簡單；

3、設(shè)計(jì)了三明治結(jié)構(gòu)的雜交方式，將兩個銀納米團(tuán)簇?cái)D壓在三明治結(jié)構(gòu)的中間，可通過銀納米團(tuán)簇之間的空間位阻效應(yīng)放大不同錯配位置的目標(biāo)dna與探針dna雜交過程中結(jié)合能的細(xì)微差別，導(dǎo)致從錯配堿基位置到銀納米團(tuán)簇位置的兩段dna序列不能正常雜交，兩個銀納米團(tuán)簇之間的距離產(chǎn)生變化；

4、利用表面等離子體共振效應(yīng)對于距離的變化很敏感，實(shí)現(xiàn)對由不同錯配堿基位置引起兩個銀納米團(tuán)簇之間距離細(xì)微變化的高靈敏度檢測；

5、相比較與精確的dna測序技術(shù)，本發(fā)明整個過程不涉及酶促反應(yīng)，一次雜交 反應(yīng)即可，步驟簡單，快速方便，價(jià)格低廉；相比較與傳統(tǒng)的dna生物傳感器，本發(fā)明不僅能確定是否存在單堿基錯配，而且還能精確檢測出單堿基錯配的位置。

附圖說明

圖1為本發(fā)明dna銀納米團(tuán)簇檢測單堿基錯配位置的方法的示意圖。

圖2為不同單堿基錯配位置目標(biāo)dna與探針雜交后的熒光光譜圖(左圖)和最大發(fā)射處的熒光強(qiáng)度與錯配位置的工作曲線(右圖)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

ph＝7.410mm的pb緩沖溶液和ph＝7.020mmpb緩沖溶液均從北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司購買。

dna從生工生物工程上海(股份)有限公司購買。

實(shí)施例1、利用本發(fā)明方法檢測單堿基的錯配位置

按照圖1所示的示意圖，檢測單堿基的錯配位置，步驟如下：

(1)按照完全匹配的目標(biāo)dna(pmdna)設(shè)計(jì)合成dna探針ⅰ(ncprobe-1)和dna探針ⅱ(ncprobe-2)，序列分別如下：

pmdna序列：aacttcttgctgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列1)

ncprobe-1序列：ccctaactccccagatacagcaagaagtt(序列2)

ncprobe-2序列：ttgaagaacgacatagaccctaactcccc(序列3)

下劃線表示用于合成銀納米團(tuán)簇的模板序列。

(2)分別以dna探針ⅰ和dna探針ⅱ為模板，制備dna銀納米簇探針ⅰ和dna銀納米簇探針ⅱ，具體步驟如下：

將dna探針ⅰ(dna探針ⅱ)溶解在10mmph＝7.4的pb緩沖溶液中，濃度為100um；將15ul上述dna探針ⅰ(dna探針ⅱ)溶液加到73ul20mmph＝7.0的pb緩沖溶液中，震蕩攪拌均勻后，向上述混合液中加入新配置的6ul1.5mm硝酸銀水溶液，快速劇烈震蕩30秒，避光冰浴保存30分鐘；進(jìn)一步向上述溶液中加入新配置的6ul1.5mm硼氫化鈉水溶液，快速劇烈震蕩30秒，得dna銀納米簇探針ⅰ和dna銀納米簇探針ⅱ，避光4℃保存6個小時待用。

(3)測量dna銀納米簇探針ⅰ、dna銀納米簇探針ⅱ與完全匹配的目標(biāo)dna雜交后得到的雜交體系的熒光強(qiáng)度，具體步驟如下：

將49uldna探針1和49uldna探針2的銀納米團(tuán)簇復(fù)合物等量混合，然后加入2.94ul250um(溶劑為10mmph＝7.4的pb緩沖溶液)完全匹配的目標(biāo)dna(即dna銀納米簇探針1、dna探針銀納米簇探針2和完全匹配的目標(biāo)dna的摩爾比為 1：1：1)，震蕩混合均勻后，放入37℃水浴30分鐘，555納米激發(fā)測量上述增強(qiáng)體系的熒光強(qiáng)度。

(4)建立目標(biāo)dna中單堿基錯配位置與體系熒光強(qiáng)度的工作曲線，具體步驟如下：

將49uldna探針1和49uldna探針2的銀納米團(tuán)簇復(fù)合物等量混合(摩爾比為1：1)，然后分別加入2.94ul250um(溶劑為10mmph＝7.4的pb緩沖溶液)錯配位置在1號至13號位置的含有單堿基錯配的13條目標(biāo)dnap1-p13(1號位置在目標(biāo)dna的中間位置，2號，3號至13號，依次從中間位置向目標(biāo)dna端側(cè)移動一個堿基位置)(即dna銀納米簇探針ⅰ、dna銀納米簇探針ⅱ和待測的目標(biāo)dna的摩爾比為1：1：1)，震蕩混合均勻后，放入37℃水浴30分鐘，555納米激發(fā)測量上述13個體系的熒光強(qiáng)度，建立單堿基錯配位置與熒光強(qiáng)度間的工作曲線。

含有單堿基錯配的13條目標(biāo)dnap1-p13的序列分別如下：

p1：aacttcttgctgtatcctctatgtcgttcttcaa(序列4)

p2：aacttcttgctgtattttctatgtcgttcttcaa(序列5)

p3：aacttcttgctgtagcttctatgtcgttcttcaa(序列6)

p4：aacttcttgctgtgtcttctatgtcgttcttcaa(序列7)

p5：aacttcttgctgaatcttctatgtcgttcttcaa(序列8)

p6：aacttcttgctatatcttctatgtcgttcttcaa(序列9)

p7：aacttcttgccgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列10)

p8：aacttcttggtgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列11)

p9：aacttcttactgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列12)

p10：aacttctagctgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列13)

p11：aacttcgtgctgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列14)

p12：aacttgttgctgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列15)

p13：aactgcttgctgtatcttctatgtcgttcttcaa(序列16)

p1-p13中的加粗堿基表示錯配的堿基。

如圖2中左圖所示，隨著堿基錯配位置向端側(cè)的移動，熒光強(qiáng)度逐漸減小，如圖2中右圖所示，堿基錯配位置與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，線性擬合方程為y＝-12.54x+221.28(r²＝0.98)。

(5)檢測待測目標(biāo)dna中的單堿基錯配位置

重復(fù)上述步驟(4)，僅將錯配位置在1號至13號位置的含有單堿基錯配的13條目標(biāo)dnap1-p13替換為dna序列為p4的待測目標(biāo)dna，得到的熒光曲線與圖2 左圖中的p4相同，根據(jù)圖2右圖中的工作曲線和該待測目標(biāo)dna的最大發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度，得到該待測目標(biāo)dna的錯配位置為4號位置，與預(yù)測結(jié)果一致。