一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃瓜幼葉黃化基因的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

二、技術(shù)背景

黃瓜(cucumissativusl.，2n＝2x＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一，在世界范圍內(nèi)廣泛地栽培。

葉色黃化突變體是研究研究植物光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的發(fā)育和遺傳控制機(jī)理的理想材料。同時，利用此種突變體可延伸至功能基因組學(xué)的分析，可用作基因功能組學(xué)研究和基因間互作的基礎(chǔ)材料。葉色突變在育種上也具有重要的應(yīng)用價值。葉色突變性狀極易識別并且通常在苗期表達(dá)，將葉色突變體作為標(biāo)記性狀用于良種繁育和雜交育種，不但可以測定種子純度還可在苗期剔除受外源花粉污染的種子和假雜種，節(jié)約成本和時間^[1]。由于某些葉色突變體具有特殊的優(yōu)良性狀，葉色黃化植株可在植物的遺傳改良中為作物遺傳育種提供優(yōu)秀的種質(zhì)資源。

近年來，葉色突變體的利用價值越來越受到關(guān)注，在糧食作物中已經(jīng)有不少關(guān)于葉色黃化基因定位及功能研究的報道。目前報道的水稻葉色突變的相關(guān)基因已超過80個，kunnengzhou等人利用⁶⁰co射線得到一個叫做ylc1的幼葉葉綠素缺失突變體，精細(xì)定位到22.6kb，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ylc1蛋白參與葉綠素及類胡蘿卜素合成以及幼葉的葉綠體發(fā)育^[2]。anqixing等人利用玉米黃化突變體發(fā)現(xiàn)控制幼葉黃化的基因存在一個同源的修飾基因，兩個基因互作完成葉色的調(diào)控作用^[3]。

然而，在黃瓜中雖然有不少葉色黃化突變體的報道，但是目前的研究大部分還停留在葉色黃化的機(jī)理研究，關(guān)于基因定位及功能研究的報道還不多見。因此，在黃瓜遺傳育種中，非常有必要開發(fā)一種與幼葉黃化緊密連鎖或完全連鎖的分子標(biāo)記，以便為后續(xù)的葉色基因功能研究提供基礎(chǔ)，同時連鎖分子標(biāo)記可為培育幼葉黃化新材料提供快速篩選的途徑。隨著生物技術(shù)水平的不斷發(fā)展，克隆目的基因的方法也層出不窮。圖位克隆方法利用分離群體的遺傳連鎖分析獲得位于該位點(diǎn)附近的緊密連鎖的分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高密度的分子連鎖圖譜，經(jīng)過染色體步移(跳躍)，開發(fā)新的更加緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)間進(jìn)而最終克隆該基因的方法。找到與幼葉黃化基因vyl緊密連鎖的分子標(biāo)記，可為進(jìn)一步克隆黃化基因vyl打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。還可以用黃化突變體作為親本材料進(jìn)行雜交，在苗期就可以用上述的分子標(biāo)記方法測定種子純度，或者在苗期剔除受外源花粉污染的種子和假雜種，簡便又快速。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(一)技術(shù)問題

本發(fā)明涉及一個與黃瓜幼葉黃化基因vyl共分離的分子標(biāo)記，目的是為后續(xù)的黃化基因的克隆與功能研究，以及幼葉黃化新材料的創(chuàng)制提供基礎(chǔ)，加快黃瓜優(yōu)良品種選育和基因功能組學(xué)的研究進(jìn)程。

(二)技術(shù)方案

本發(fā)明提供的與黃瓜幼葉黃化基因緊密連鎖的分子標(biāo)記方法的特征在于：該黃化基因?yàn)橥耆[性基因，有一個ssr標(biāo)記與之緊密連鎖，所述ssr分子標(biāo)記引物為下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，

ssr63：正向引物：5′gccttcatcctgtggcgt3′，

反向引物：5′ccagtcatgggtttgttgga3′。

上述提供的用于檢測黃瓜幼葉黃化基因的分子標(biāo)記方法為：

(1)提取待測黃瓜的基因組dna。

(2)將所述的分子標(biāo)記引物ssr63加入pcr反應(yīng)體系，并對黃瓜基因組的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：pcr擴(kuò)增反應(yīng)的總體系為20μl，包括：10×buffer(含mg²⁺)2.0μl，dntp2.0μl，正、反向引物各1μl，taq酶(5u·μl^-1)0.25μl、dna(10ng)1.0μl，ddh2o，12.75μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min20s，35個循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保存。

對引物ssr63pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)電泳，

將擴(kuò)增產(chǎn)物中1.5μl上樣于6％非變性聚丙烯酰胺膠；接通電極，在120v恒定電壓下電泳1.5小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色。如果只含有226bp條帶，則為含黃化基因vyl的純合體，如果只含有204bp條帶，則為含綠色基因的純合體，如包204bp和226bp兩個條帶，則為含綠色基因和黃化基因的雜合體。

(三)有益效果

(1)通過篩選獲得與黃瓜幼葉黃化基因vyl緊密連鎖的分子標(biāo)記ssr63，為分子標(biāo)記輔助育種和克隆vyl基因奠定了基礎(chǔ)。利用本發(fā)明與黃瓜幼葉黃化基因vyl緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)行幼葉黃化基因vyl的鑒定，在包含998個單株的樣品中選擇效率均為100％。

(2)通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的基因位點(diǎn)精確，鑒定方便。由于這個標(biāo)記與黃瓜幼葉黃化基因vyl的重組率為0，因此，用黃化突變體作為親本材料進(jìn)行雜交，在苗期就可以用上述的分子標(biāo)記方法測定種子純度，或者在苗期剔除受外源花粉污染的種子和假雜種，有效解決了表型鑒定結(jié)果可靠性低、費(fèi)時、成本高、難度大等問題，簡便又快速。

(3)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可廣泛應(yīng)用于分子輔助育種中vyl基因的分子檢測，實(shí)現(xiàn)基因的產(chǎn)業(yè)化分子育種。

四、附圖說明

圖1：黃化基因vyl初步定位結(jié)果。

用引物uw084200和ssr05515之間序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中12對引物有多態(tài)性，用400個f2群體對12對多態(tài)性引物進(jìn)行進(jìn)一步篩選，尋找標(biāo)記基因型與性狀表現(xiàn)型的差別，獲得標(biāo)記與黃化基因vyl的交換單株。位于基因兩側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記向交換單株逐漸減少的方向步移，將目標(biāo)區(qū)段縮小至引物ssr60和ssr113之間，標(biāo)記ssr60和ssr113之間的ssr63重組株為0。

圖2：引物ssr63檢測結(jié)果。

用雙親(黃化突變體為p1，綠葉親本hazerd為p2)、f1、f2群體黃化表型和綠葉表型dna作為模板，用本發(fā)明中的標(biāo)記引物ssr63f/ssr63r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果顯示在黃化親本(泳道2)和f2群體黃化表型單株(泳道5-14)中擴(kuò)增出226bp的單條帶，而在綠葉親本(泳道3)和f2群體綠葉純合個體(泳道15-19)中擴(kuò)增出204bp的單條帶，在f1(泳道4)和f2群體綠葉雜合個體(泳道20-24)中均擴(kuò)增出204bp和226bp的條帶。

注：泳道1：marker；泳道2：p1；泳道3：p2；泳道4：f1；泳道5-14：f2群體黃化表型個體；泳道15-24：f2群體綠葉表型個體，其中，15-19為綠葉純合個體，20-24為綠葉雜合個體。

五、具體實(shí)施方式

黃瓜幼葉黃化分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的：

(1)f2群體的構(gòu)建

黃瓜幼葉黃化突變體vyl是由ems誘變的‘長春密刺’突變體庫篩選得到的，表現(xiàn)為幼嫩葉片黃化，隨著葉齡的增加葉片逐漸轉(zhuǎn)綠。hazerd是一種歐洲溫室型黃瓜，葉片深綠色。利用這兩個親本配置f1，f1代自交產(chǎn)生f2代。統(tǒng)計(jì)998個f2群體的表型，并用卡方分析法進(jìn)行驗(yàn)證，得出黃瓜幼葉黃化為單基因控制的隱性性狀。

(2)黃瓜基因組dna的提取

按常規(guī)方法-ctab法提取親本，f1及全部f2分離群體的葉片總dna。

(3)幼葉黃化和綠葉基因池建立

利用群體分離法(bsa)從f2分離群體中分別隨機(jī)選取幼葉黃化株和綠葉株個體各10株，建立黃化(vv)和綠葉(v_)黃瓜的基因池。

(4)黃化基因的初步定位

隨機(jī)挑選已公布的分布在黃瓜7條染色體上的引物對親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，在271對引物中其中84對引物具有多態(tài)性。利用建立的黃化和綠葉基因池進(jìn)行進(jìn)一步篩選，將幼葉黃化基因初步定位在4號染色體長臂末端。隨機(jī)挑選90個f2群體對附近連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步篩選，獲得幼葉黃化基因vyl兩翼最近的分子標(biāo)記將uw084200和ssr05515，目標(biāo)區(qū)段縮小至1.7cm。

(5)ssr標(biāo)記開發(fā)

利用實(shí)驗(yàn)室生物信息學(xué)相關(guān)腳本對兩個引物間的序列進(jìn)行提取，用ssr軟件對獲得的序列進(jìn)行分析，對獲得的184個ssr位點(diǎn)用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在兩個親本間進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，其中12對引物有多態(tài)性。

用400個f2群體對12對多態(tài)性引物進(jìn)行進(jìn)一步篩選，尋找標(biāo)記基因型與性狀表現(xiàn)型的差別，獲得標(biāo)記與黃化基因vyl的交換單株。位于基因兩側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記向交換單株逐漸減少的方向步移，將目標(biāo)區(qū)段縮小至引物ssr60和ssr113之間，標(biāo)記ssr60和ssr113之間的ssr63重組株為0。用joinmap4軟件對ssr標(biāo)記的結(jié)果結(jié)合植株表型繪圖，結(jié)果表明黃化基因vyl和標(biāo)記ssr63共分離。

(6)標(biāo)記引物ssr63在黃瓜幼葉黃化與綠葉黃瓜構(gòu)建的f2中的分子檢測

利用標(biāo)記引物ssr63在雙親、f1和f2材料中進(jìn)行pcr擴(kuò)增檢測(條件和方法同上)。結(jié)果表明：對于引物ssr63，在幼葉黃化親本和幼葉黃化f2中都能擴(kuò)增出226bp的單條帶，而在綠葉親本擴(kuò)增出204bp的單條帶，在綠葉f2擴(kuò)增出204bp的單條帶或同時含有204bp和226bp的兩條帶(圖2)。

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