本發(fā)明涉及土壤細(xì)菌科學(xué)領(lǐng)域和細(xì)菌菌落的高通量測(cè)序分析方法，具體是關(guān)于高通量測(cè)序分析蔬菜栽培地土壤細(xì)菌群落多樣性的一種方法。

背景技術(shù)：

土壤是蔬菜植株生長(zhǎng)發(fā)育的重要場(chǎng)所。土壤質(zhì)量不僅取決于土壤的理化性質(zhì)，還與土壤的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。土壤中微生物的生物量對(duì)土壤意義重大。其中土壤中細(xì)菌種群的豐度及多樣性會(huì)影響蔬菜植株的生長(zhǎng)與發(fā)育，最終影響蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量。研究土壤中細(xì)菌種群的多樣性，有助于蔬菜生產(chǎn)中土壤管理措施的制定。

16srdna基因是原核微生物中常用的分子標(biāo)志，在微生物生態(tài)學(xué)研究中經(jīng)常用到，同時(shí)很多菌落的16srdna已經(jīng)公布，可用于土壤菌落的鑒定。高通量測(cè)序能夠有效快速、準(zhǔn)確地鑒定及分析多樣本，且不依賴基因組?；?6srdna基因的高通量測(cè)序能較為全面和準(zhǔn)確的反映蔬菜種植田塊土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，能在整體微生物群落水平分析物種遺傳多樣性，結(jié)合已公布的細(xì)菌16srdna基因序列，能夠快速而準(zhǔn)確的分析蔬菜種植田塊土壤中微生物情況。

不同的蔬菜種類對(duì)土壤的要求不同，但大多喜愛肥沃、疏松的土壤。土壤中存在的大量微生物對(duì)土壤的品質(zhì)的影響很大，其中以細(xì)菌的數(shù)量和種類最多。細(xì)菌在土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)、有機(jī)質(zhì)的形成和分解、保持和提高土壤肥力方面起著極其重要的作用。

本發(fā)明建立了一種快速、準(zhǔn)確分析蔬菜栽培地土壤中細(xì)菌群落多樣性的方法，可滿足對(duì)蔬菜栽培地土壤微生物多樣性研究的需要。

附圖說明

圖1.技術(shù)流程圖

圖2.微生物群落豐富度分析圖

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種快速而準(zhǔn)確檢測(cè)分析蔬菜栽培地土壤中細(xì)菌群落多樣性的方法?？捎糜诜治鍪卟嗽耘嗟赝寥牢⑸锏难芯?，研究結(jié)果對(duì)蔬菜栽培地土壤管理有一定的參考價(jià)值。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施步驟見圖1，具體如下

1.土壤樣品的采集：選擇蔬菜種植田塊，用5點(diǎn)取樣法。采樣時(shí)，用土壤采樣器(洛陽鏟)采集15cm表土，將每個(gè)區(qū)域中5個(gè)點(diǎn)的土壤樣品混合均勻，除去石塊、根系等雜物后過2mm篩，裝入滅菌的封口聚乙烯袋，在-70℃下保存，一周內(nèi)提取總dna。

2.提取總dna時(shí)使用dna提取試劑盒，具體提取步驟按試劑盒中的說明書進(jìn)行。

3.測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。將提取好的土壤基因組dna，基于illuminamiseq技術(shù)測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序(paired-end)的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)檢測(cè)得到的相應(yīng)序列進(jìn)行后續(xù)分析。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果。土壤中各種優(yōu)劣勢(shì)菌群豐富度見圖2，根據(jù)該圖研究者可以快速準(zhǔn)確地確定土壤中的優(yōu)劣勢(shì)菌群從而更快地發(fā)現(xiàn)問題。該方法不但靈敏度高、準(zhǔn)確性好，而且隨著技術(shù)的發(fā)展，該方法的成本也會(huì)越來越低。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種利用高通量測(cè)序的方法，該方法能夠有效分析蔬菜栽培地細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群種類的方法。該方法主要涉及蔬菜栽培地土壤的取樣、細(xì)菌DNA的提取、16S?rDNA高通量測(cè)序、細(xì)菌多樣性及豐度分析等。該方法對(duì)于了解蔬菜栽培地微生物種群，并快速、準(zhǔn)確分析土壤細(xì)菌多樣性具有重要意義，可為蔬菜栽培地選擇和管理提供參考。

技術(shù)研發(fā)人員：熊愛生;卻楓;祁石剛;張馨月;高學(xué)雙
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京農(nóng)業(yè)大學(xué);宿遷市農(nóng)業(yè)技術(shù)綜合服務(wù)中心
技術(shù)研發(fā)日：2016.01.08
技術(shù)公布日：2017.07.18