本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，具體是涉及一株低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：
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氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種潛在致癌物，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，2007年國際癌癥研究機構(gòu)把EC重新分類，由2B組(或可能令人類患癌的物質(zhì))改為2A組(可能令人類患癌的物質(zhì))。EC廣泛存在于發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪和醬油等)和酒精飲料(如中國黃酒、日本清酒和葡萄酒)中。葡萄酒是世界上最古老的飲料之一，具有獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)保健功能。經(jīng)檢測，在葡萄酒中，EC含量較高。歐美發(fā)達國家已對市場銷售的葡萄酒制定了EC限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，降低葡萄酒中的EC含量，對促進葡萄酒行業(yè)健康發(fā)展和保障人類身體健康具有深遠的意義。

如何降低葡萄酒中EC的含量，一直都是國際葡萄酒企業(yè)和相關(guān)科研單位研究的重要課題。葡萄酒中的EC主要由尿素和乙醇自發(fā)反應(yīng)而形成，EC的主要前體物質(zhì)是尿素。因此，在降低EC含量的策略中，主要是通過降低EC的前體物質(zhì)——尿素來達到目的。目前降低葡萄酒中EC含量的主要方法有如下兩種：一是通過在葡萄酒發(fā)酵液中添加酸性脲酶降解尿素，從而減少EC的生成。但由于酸性脲酶的生產(chǎn)過程繁瑣，成本高，酸性脲酶的使用會大大增加企業(yè)生產(chǎn)成本，且外加酶的添加可能會有二次污染的風(fēng)險。二、是從釀酒工藝方面考慮，適當(dāng)改變一些工藝條件進而減少EC的生成。但該方式可能導(dǎo)致葡萄酒中風(fēng)味物質(zhì)的改變，葡萄酒質(zhì)量的下降。因此，要從根本上降低釀酒酵母的產(chǎn)尿素能力還是需要利用分子生物學(xué)育種技術(shù)構(gòu)建低產(chǎn)尿素的釀酒酵母工業(yè)菌株。

研究表明，葡萄酒中的尿素主要由精氨酸在CAR1基因編碼的精氨酸酶的作用下分解而產(chǎn)生。當(dāng)酵母需要氮源時，尿素被DUR1，2基因編碼的脲基酰胺酶分解為NH₃和CO₂，從而合成各種含氮化合物供自身需求。當(dāng)胞內(nèi)尿素含量過高時，可被由DUR4基因編碼的尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur4p轉(zhuǎn)運出細胞。當(dāng)酵母再次需要氮源時，發(fā)酵液中的尿素也可被細胞膜上DUR3基因編碼的尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p攜帶轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，被酵母細胞重吸收利用。因此，敲除精氨酸酶基因CAR1阻斷尿素的來源，過表達分解尿素為NH₃和CO₂的脲基酰胺酶基因DUR1，2促進尿素的分解是降低葡萄酒中尿素含量的有效措施。因此，本發(fā)明通過敲除一個拷貝的精氨酸酶基因CAR1，同時過表達脲基酰胺酶基因DUR1，2，選育低產(chǎn)EC釀酒酵母工業(yè)菌株，滿足釀酒酵母應(yīng)用相關(guān)領(lǐng)域?qū)湍傅妮^高要求，對促進葡萄酒行業(yè)健康發(fā)展和保障人類身體健康具有深遠的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明解決的技術(shù)問題之一是提供一株低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母。

所述低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母是在出發(fā)酵母菌株中敲除一個拷貝的精氨酸酶基因CAR1，同時過表達脲基酰胺酶基因DUR1，2所得。

所述CAR1基因其Gene ID為：855993，核苷酸序列如表中SEQ NO：1所示；所述DUR1，2基因其Gene ID為：852507，核苷酸序列如表中SEQ NO：2所示；所述啟動子PGK1其Gene ID為：850370，核苷酸序列如表中SEQ ID NO：3所示。

所述出發(fā)酵母菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3373，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，公眾可購買獲得。

本發(fā)明解決的另一個技術(shù)問題是提供一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)重組質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB的構(gòu)建

①以質(zhì)粒pPGK1為模板，PCR擴增強啟動子PGK1基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI對載體質(zhì)粒YEP352和PGK1基因片段進行酶切，再用Solution I連接酶將兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-P；

②以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，PCR擴增DUR1，2基因，用限制性內(nèi)切酶XhoI對質(zhì)粒Yep-P進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR1，2基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-P連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD_1，2；

③以質(zhì)粒pUG6為模板，PCR擴增KanMX基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI對質(zhì)粒Yep-PD_1，2進行酶切，再用Infusion連接酶將KanMX基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-PD_1，2連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD_1，2K；

④以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，PCR擴增DUR1，2基因的上游同源臂CUA，用限制性內(nèi)切酶SmaI對質(zhì)粒Yep-PD_1，2K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR1，2基因的上游同源臂CUA基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-PD_1，2K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD_1，2K；

⑤以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，PCR擴增DUR1，2基因的下游同源臂CUB，用限制性內(nèi)切酶SphI對質(zhì)粒Yep-APD_1，2K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR1，2基因的下游同源臂CUB基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-APD_1，2K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB。

(2)CAR1基因的敲除同時DUR1，2基因的過表達

①以質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB為模板，PCR擴增“CUA-KanMX-PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t-CUB”重組片段；

②用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將步驟(2)-①得到的PCR重組片段導(dǎo)入出發(fā)酵母菌株中，獲得敲除一個拷貝的CAR1基因，同時過表達DUR1，2基因的重組菌株1；

③用pGAP質(zhì)粒去除步驟(2)-②獲得菌株中的KanMX基因，獲得不含抗性基因，敲除一個拷貝的CAR1基因，同時過表達DUR1，2基因的重組菌株2，傳代得到不含pGAP質(zhì)粒的重組菌株2。

所述重組菌株可通過上述方法構(gòu)建，所涉及具體操作方法已有很多文獻報道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995。

本發(fā)明所述的釀酒酵母重組菌株2，在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，葡萄酒發(fā)酵試驗中，尿素的含量降低了40.38％，EC的含量降低了34.45％。

有益效果：

1、本發(fā)明提供了一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母菌株，降低了葡萄酒中EC的含量，克服了普通釀酒酵母由于產(chǎn)EC含量高而導(dǎo)致的對人體致癌風(fēng)險大的影響。

2、本發(fā)明提供的低產(chǎn)EC釀酒酵母在保持良好發(fā)酵性能的前提下，敲除了一個拷貝的精氨酸酶基因CAR1，同時脲基酰胺酶基因DUR1，2的表達量顯著提高，達到了低產(chǎn)EC的目的，為釀造出更有利于人體健康的葡萄酒奠定了理論基礎(chǔ)，具有廣闊的市場前景，同時為研究相關(guān)基因?qū)ζ咸丫浦心蛩睾虴C含量的影響奠定了基礎(chǔ)。

3、本發(fā)明選育得到的酵母菌株通過Cre/LoxP系統(tǒng)完全剔除了KanMX抗性基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)，有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1為Yep-APD_1，2KB質(zhì)粒構(gòu)建過程；

圖2為質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB的PCR驗證：

其中：(a)中M為marker；1為以Yep-APD_1，2KB為模板，PGK1-U/PGK1-D為引物PCR擴增PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t片段；

(b)中M為marker；1為以Yep-APD_1，2KB為模板，CU-U/CU-D為引物PCR擴增CUA-KanMX-PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t-CUB片段；

圖3為CAR1基因的敲除同時DUR1，2基因的過表達重組菌株的驗證：

(a)中M為marker；1為以重組菌株1的基因組為模板，U-S/KU-S為引物，PCR擴增驗證片段；2為以出發(fā)菌株的基因組為模板，U-S/KU-S為引物，PCR擴增驗證片段；3為以重組菌株1的基因組為模板，PU-X/U-X為引物，PCR擴增驗證片段；4為以出發(fā)菌株的基因組為模板，PU-X/U-X為引物，PCR擴增驗證片段；

(b)中M為marker；1為以重組菌株2的基因組為模板，2為以重組菌株1的基因組為模板，以Kan-U/Kan-D為引物，PCR擴增驗證片段；

(c)中M為marker；1為以傳代后的重組菌株2的基因組為模板，2為以傳代前的重組菌株2的基因組為模板，以Zeocin-U/Zeocin-D為引物，PCR擴增驗證片段；

圖4為9-羥基噸與尿素在酸性條件下衍生反應(yīng)示意圖。

具體實施方式：

下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明的一種低產(chǎn)EC釀酒酵母及其選育方法。下述實施例中所用的技術(shù)手段，如無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。

實施例1：低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母的構(gòu)建

本實例所用的出發(fā)菌株CGMCC No.3373。所述大腸桿菌DH5a購自Takara公司。所述YEPD培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基含2％進口瓊脂粉。

根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計了下述引物。

表1本實施例中所用到的引物

注：下劃線部分為酶切位點。

表2(a)本實施例中所用的Taq DNA聚合酶PCR擴增體系

表2(b)本實施例中所用的PrimeSTARGXLDNA聚合酶PCR擴增體系

表3(a)Solution I連接酶連接方法

注：反應(yīng)條件為16C水浴，過夜連接

表3(b)Infusion連接酶連接方法

注：反應(yīng)條件為50C水浴，連接30min

(1)重組質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB的構(gòu)建

重組質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB的構(gòu)建流程如圖1所示；

以質(zhì)粒pPGK1為模板，PGK1-U和PGK1-D為引物，Taq DNA聚合酶，PCR擴增強啟動子PGK1基因，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃105s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI對載體質(zhì)粒YEP352和PGK1基因片段進行酶切，再用Solution I連接酶將兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-P。

以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，DUR1，2-U和DUR1，2-D為引物，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，PCR擴增DUR1，2基因，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃335s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶XhoI對質(zhì)粒Yep-P進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR1，2基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-P連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD_1，2。

以質(zhì)粒pUG6為模板，Kan-U和Kan-D為引物，Taq DNA聚合酶，PCR擴增KanMX基因，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃100s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶BamHI對質(zhì)粒Yep-PD_1，2進行酶切，再用Infusion連接酶將KanMX基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-PD_1，2連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD_1，2K。

以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，UA-U和UA-D為引物，Taq DNA聚合酶，PCR擴增DUR1，2基因的上游同源臂CUA，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃60s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶SmaI對質(zhì)粒Yep-PD_1，2K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR1，2基因的上游同源臂CUA基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-PD_1，2K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD_1，2K。

以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，UB-U和UB-D為引物，PCR擴增DUR1，2基因的下游同源臂CUB，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃60s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶SphI對質(zhì)粒Yep-APD_1，2K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR1，2基因的下游同源臂CUB基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-APD_1，2K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB。

PCR驗證結(jié)果如圖2所示，其中：(a)中M為marker；1為以Yep-APD_1，2KB為模板，PGK1-U/PGK1-D為引物PCR擴增PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t片段；

(b)中M為marker；1為以Yep-APD_1，2KB為模板，CU-U/CU-D為引物PCR擴增CUA-KanMX-PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t-CUB片段。

(2)CAR1基因的敲除同時DUR1，2基因的過表達

以質(zhì)粒Yep-APD_1，2KB為模板，CU-U和CU-D為引物，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，PCR擴增“CUA-KanMX-PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t-CUB”重組片段，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃660s，30個循環(huán)；72℃10min。

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入釀酒酵母出發(fā)菌株得到重組菌株1，通過G418抗性篩選重組子進行PCR驗證，在DUR1，2基因的上游同源臂CUA外部設(shè)計引物U-S，KanMX序列內(nèi)部設(shè)計引物KU-S；在PGK1序列內(nèi)部設(shè)計引物PU-X，DUR1，2基因的下游同源臂CUB外部設(shè)計引物U-X，用于驗證CAR1基因敲除同時DUR1，2基因過表達。以U-S和KU-S為引物，可擴增出大小為1208bp的片段；以PD-X和D-X為引物，可擴增出大小為1336bp的片段，且PCR擴增出的片段與預(yù)期的目的產(chǎn)物大小一致，而出發(fā)菌株則不能擴增得到該片段，PCR驗證結(jié)果如圖3(a)所示。

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法將帶有Cre重組酶的pGAPza質(zhì)?；D(zhuǎn)于重組菌株1中獲得重組菌株2；挑取轉(zhuǎn)化子在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)4-5h，稀釋涂布，挑出單菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生長而在G418抗性平板上不生長的菌株，提取基因組進行PCR驗證，即以重組菌株2的基因組為模板擴增KanMX片段，無法得到1600bp左右的條帶，而重組菌株1則能擴增得到該片段，PCR驗證結(jié)果如圖3(b)所示。將驗證正確的酵母單菌落接到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，每12h轉(zhuǎn)接一次，傳數(shù)代之后pGAPza質(zhì)粒即可丟失，提取酵母質(zhì)粒進行PCR驗證如圖3(c)所示。

結(jié)果表明，在酵母細胞中實現(xiàn)了敲除一個拷貝的CAR1基因同時強啟動子PGK1過表達DUR1，2基因全序列。

實施例2：低產(chǎn)EC釀酒酵母菌株發(fā)酵實驗

(1)重組菌株與出發(fā)菌株的葡萄酒發(fā)酵實驗

將重組菌株和出發(fā)菌株分別同時進行葡萄酒發(fā)酵實驗，發(fā)酵工藝路線圖：

葡萄原料→清洗、晾干、除?！扑椤{(diào)糖、調(diào)酸→加亞硫酸、滅菌→接菌→前發(fā)酵→皮渣分離→后發(fā)酵→測定指標(biāo)

工藝條件：

糖度：20.45Brix；酸度：pH 3.51；SO₂添加量：80mg/L；接菌量：3％；前發(fā)酵溫度和時間：25℃，4.5d；后發(fā)酵溫度和時間：20℃，9d。

挑取一環(huán)酵母細胞，接入裝有5mL YEPD培養(yǎng)基的試管中，30℃，180rpm培養(yǎng)12h，再按10％接種量接種到裝有45mLYEPD培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，30℃，180rpm培養(yǎng)12h后，按3％接種量接種到葡萄汁發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃靜置發(fā)酵。每隔12h稱重1次，當(dāng)兩次失重小于0.3g，前發(fā)酵結(jié)束。用紗布過濾使皮渣分離，20℃靜置進行后發(fā)酵，后發(fā)酵時間為前發(fā)酵的兩倍。發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵醪液進行過濾，得葡萄酒酒樣。測定CO₂累積排放量、酒精度、殘余還原糖、總酸和pH等發(fā)酵性能指標(biāo)，結(jié)果如表4。

表4親本菌株和重組菌株的發(fā)酵性能測定

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(2)液相色譜法測葡萄酒中尿素含量

①原理

9-羥基噸與尿素在酸性條件下生成可以產(chǎn)生具有熒光特性的衍生物(N-9H-xanthen-9-yl-X)，反應(yīng)原理如圖4所示，再經(jīng)高效液相色譜柱C18的分離，熒光檢測器的檢測，用外標(biāo)法定量。

②樣品衍生處理

取500μL酒樣用無水乙醇稀釋至1000μL，再取稀釋的酒樣500μL，加9-羥基噸溶液500μL和鹽酸溶液100μL，混勻，室溫避光衍生30min，經(jīng)有機微孔濾膜過濾后，待進樣分析。

③液相色譜檢測條件

色譜柱：Agilent-C18色譜柱：250mm×4.6mm，粒徑5μm，柱溫35℃；流動相A：乙腈；流動相B：0.02mol/L乙酸鈉溶液，用1％(V/V)乙酸調(diào)pH為7.2；流動相流速：1mL/min；熒光檢測器激發(fā)波長λ_ex＝240nm，發(fā)射波長λ_em＝308nm，增益10；進樣量20uL；梯度洗脫，詳見表5：

表5洗脫程序

結(jié)果如表6。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中尿素含量為0.93mg/L，較出發(fā)菌株降低了40.38％。

(3)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測葡萄酒中EC含量

①原理

樣品加氨基甲酸丙酯內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)過堿性硅藻土固相萃取柱凈化除雜、洗脫、濃縮后，用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。

②樣品的預(yù)處理

用固相萃取法對樣品進行預(yù)處理。準(zhǔn)確吸取2mL的酒樣或配好的EC標(biāo)品，加入20uL，10.0mg/L內(nèi)標(biāo)PC使用溶液，0.3g氯化鈉，超聲溶解、混勻后，上樣至堿性硅藻土固相萃取柱，在真空條件下，使樣品溶液慢慢滲入萃取柱，靜置約10min。經(jīng)10mL正己烷淋洗除雜后，用15mL、5％乙酸乙酯-乙醚溶液約以1mL/min流速進行洗脫，洗脫液先經(jīng)裝有2g無水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水，再收集于10mL具塞刻度試管中，室溫下用氮氣緩緩吹至0.5mL左右，用甲醇定容至1.0mL，制成待測液，供GC/MS分析。

③GC/MS的檢測條件

色譜條件：CP-WAX毛細管50m*0.25mm*0.25μm，柱溫50℃保持1min，再以3℃/min的速度增至180℃，保持1min，最后以20℃/min的速度增至220℃，保持10min。載氣：He，載氣流量：1mL/min，注射模式：不分流。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250℃，電子能量70ev，接口溫度230℃，電子倍增器電壓1568V，EC檢測離子m/z 62、74、89，定量離子m/z 62。PC檢測離子m/z 59、62、74，定量離子m/z 62。

結(jié)果如表6。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中EC含量為12.50μg/L，較出發(fā)菌株降低了34.45％。

表6親本菌株和重組菌株的尿素和EC產(chǎn)量

注：所不數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(4)液相色譜法測葡萄酒中氨基酸含量

①原理

將樣品進行DNFB柱前衍生，使氨基算衍生化成有利于分離，在紫外360nm處有吸收的化合物，經(jīng)高效液相色譜柱C18的分離，紫外檢測器的檢測，用外標(biāo)法定量。

②樣品衍生處理

取樣品20μL，加衍生緩沖液200μL和衍生劑200μL，混勻，65℃水浴避光衍生1h后取出，待溶液冷卻至室溫后，加定溶緩沖液至1200μL并混勻，放置15min后經(jīng)有機微孔濾膜過濾后，待進樣分析。

③液相色譜檢測條件

色譜柱：Agilent-C18色譜柱：250mm×4.6mm，粒徑5μm，柱溫33℃；流動相A：50％乙腈；流動相B：0.05mol/L乙酸鈉溶液；流動相流速：1mL/min；紫外檢測器波長360nm，增益10；進樣量20μL；梯度洗脫，詳見表7：

表7洗脫程序

結(jié)果如表8。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中常見氨基酸含量較出發(fā)菌株無明顯差異。

表8親本菌株和重組菌株的常見氨基酸產(chǎn)量(單位mg/L)

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(5)氣相色譜法測定酒中揮發(fā)性酸、酯和醇的含量

①酒樣預(yù)處理

準(zhǔn)確量取內(nèi)標(biāo)液(乙酸正丁酯)0.15mL于10mL容量瓶中，用待測酒樣定容并混勻，用400μm孔徑濾膜過濾后，進行高效氣相色譜測定。

②氣相色譜條件

氣相色譜儀：Agilent 7890C；色譜柱：AT.LZP-930，230℃，50m×320μm×1μm；檢測器：FID檢測器，檢測器溫度：200℃；載氣：高純氮，流速5mL/min；檢測條件：程序升溫，50℃保持8min，5℃/min升到120℃，保持8min；進樣口溫度：200℃；進樣量：1.0μL；分流方式：分流，分流比為10：1。

結(jié)果如表9。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中常見揮發(fā)性酸、酯和醇含量較出發(fā)菌株無明顯差異。

表9親本菌株和重組菌株的揮發(fā)性酸、酯和醇產(chǎn)量(單位mg/L)

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。