本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，具體是涉及一株低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：
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葡萄酒是一種健康型酒類飲品，風(fēng)味獨特，備受喜愛。氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種自然產(chǎn)生于發(fā)酵食品和飲料酒中的化合物，主要是在發(fā)酵過程、加熱(如蒸餾)和儲存過程中產(chǎn)生。EC對人體具有潛在的致癌作用，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，并且乙醇對EC的致癌具有促進作用。2007年國際癌癥研究機構(gòu)把EC重新分類，由2B組(或可能令人類患癌的物質(zhì))改為2A組(可能令人類患癌的物質(zhì))。從20世紀(jì)70年代以來，世界各國學(xué)者先后在葡萄酒、白酒和黃酒等多種發(fā)酵飲料中檢測到了EC，這些發(fā)現(xiàn)引起了各國政府對發(fā)酵飲料中其含量的高度重視。因此，盡可能降低發(fā)酵飲料中的EC含量已成為眾多生產(chǎn)企業(yè)的當(dāng)務(wù)之急，對促進葡萄酒行業(yè)健康發(fā)展和保障人類身體健康具有深遠的意義。

如何降低葡萄酒中EC的含量，一直都是國際葡萄酒企業(yè)和相關(guān)科研單位研究的重要課題。目前大部分研究是通過添加酸性脲酶來降解葡萄酒中EC的主要前提物質(zhì)尿素從而抑制EC的生成。但目前脲酶的生產(chǎn)過程繁瑣，生產(chǎn)成本高，且脲酶的活性易受酒中各類抑制因子的影響而降低。而構(gòu)建低產(chǎn)EC釀酒酵母工程菌株，才可以從根本上解決葡萄酒中EC含量高的問題，也是工業(yè)微生物育種的發(fā)展方向。

研究表明，葡萄酒中EC主要由尿素和乙醇自發(fā)反應(yīng)而形成的。葡萄酒中的尿素主要由發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)生。因此選育低產(chǎn)尿素釀酒酵母菌株是降低葡萄酒中EC含量的主要措施。精氨酸是葡萄汁中含量最多的氨基酸之一，可通過精氨酸特異性透性酶(Can1p)或通用氨基酸透性酶(Gap1p)轉(zhuǎn)運到釀酒酵母細胞中。釀酒酵母菌株在生長繁殖和酒精發(fā)酵時，精氨酸可被CAR1基因編碼的精氨酸酶分解為尿素和鳥氨酸。當(dāng)酵母菌氮源充足時，大部分尿素由DUR4基因編碼的細胞膜上尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur4p攜帶分泌排出細胞，進入發(fā)酵液，其余少部分的尿素在生物素和輔助因子ATP的作用下進一步被DUR1，2基因編碼的脲基酰胺酶分解為CO₂和NH₃；當(dāng)酵母細胞氮源不足時，發(fā)酵液中的尿素可由細胞膜上DUR3基因編碼的尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p攜帶轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，被酵母細胞重吸收利用。因此，敲除精氨酸酶基因CAR1阻斷尿素的來源，過表達尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p基因DUR3促進酵母細胞對葡萄酒中尿素的吸收是降低葡萄酒中尿素含量的有效措施。因此，本發(fā)明通過敲除一個拷貝的精氨酸酶基因CAR1，同時過表達尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p基因DUR3，選育低產(chǎn)EC釀酒酵母工業(yè)菌株，滿足釀酒酵母應(yīng)用相關(guān)領(lǐng)域?qū)湍傅妮^高要求，對促進葡萄酒行業(yè)健康發(fā)展和保障人類身體健康具有深遠的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明解決的技術(shù)問題之一是提供一株低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母。

所述低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母是在出發(fā)酵母菌株中敲除一個拷貝的精氨酸酶基因CAR1，同時過表達尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p基因DUR3所得。

所述CAR1基因其Gene ID為：855993，核苷酸序列如表中SEQ NO：1所示；所述DUR3基因其Gene ID為：856370，核苷酸序列如表中SEQ NO：2所示；所述啟動子PGK1其Gene ID為：850370，核苷酸序列如表中SEQ ID NO：3所示。

所述出發(fā)酵母菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3373，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，公眾可購買獲得。

本發(fā)明解決的另一個技術(shù)問題是提供一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)重組質(zhì)粒Yep-APD₃KB的構(gòu)建

①以質(zhì)粒pPGK1為模板，PCR擴增強啟動子PGK1基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI對載體質(zhì)粒YEP352和PGK1基因片段進行酶切，再用Solution I連接酶將兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-P；

②以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，PCR擴增DUR3基因，用限制性內(nèi)切酶XhoI對質(zhì)粒Yep-P進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR3基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-P連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD₃；

③以質(zhì)粒pUG6為模板，PCR擴增KanMX基因，用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對質(zhì)粒Yep-PD₃和KanMX基因片段進行酶切，再用Solution I連接酶將兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD₃K；

④以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，PCR擴增DUR3基因的上游同源臂CDA，用限制性內(nèi)切酶KpnI對質(zhì)粒Yep-PD₃K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR3基因的上游同源臂CDA基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-PD₃K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD₃K；

⑤以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，PCR擴增DUR3基因的下游同源臂CDB，用限制性內(nèi)切酶NarI對質(zhì)粒Yep-APD₃K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR3基因的下游同源臂CDB基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-APD₃K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD₃KB。

(2)CAR1基因的敲除同時DUR3基因的過表達

①以質(zhì)粒Yep-APD₃KB為模板，PCR擴增“CDA-KanMX-PGK1_p-DUR3-PGK1_t-CDB”重組片段；

②用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將步驟(2)-①得到的PCR重組片段導(dǎo)入出發(fā)酵母菌株中，獲得敲除一個拷貝的CAR1基因，同時過表達DUR3基因的重組菌株1；

③用pGAP質(zhì)粒去除步驟(2)-②獲得菌株中的KanMX基因，獲得不含抗性基因，敲除一個拷貝的CAR1基因，同時過表達DUR3基因的重組菌株2，傳代得到不含pGAP質(zhì)粒的重組菌株2。

所述重組菌株可通過上述方法構(gòu)建，所涉及具體操作方法已有很多文獻報道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995。

本發(fā)明所述的釀酒酵母重組菌株2，在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，葡萄酒發(fā)酵試驗中，尿素的含量降低了45.51％，EC的含量降低了36.92％。

有益效果：

1、本發(fā)明提供了一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母菌株，降低了葡萄酒中EC的含量，克服了普通釀酒酵母由于產(chǎn)EC含量高而導(dǎo)致的對人體致癌風(fēng)險大的影響。

2、本發(fā)明提供的低產(chǎn)EC釀酒酵母在保持良好發(fā)酵性能的前提下，敲除了一個拷貝的精氨酸酶基因CAR1，同時尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p基因DUR3的表達量顯著提高，達到了低產(chǎn)EC的目的，為釀造出更有利于人體健康的葡萄酒奠定了理論基礎(chǔ)，具有廣闊的市場前景，同時為研究相關(guān)基因?qū)ζ咸丫浦心蛩睾虴C含量的影響奠定了基礎(chǔ)。

3、本發(fā)明選育得到的酵母菌株通過Cre/LoxP系統(tǒng)完全剔除了KanMX抗性基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)，有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1為Yep-APD₃KB質(zhì)粒構(gòu)建過程；

圖2為質(zhì)粒Yep-APD₃KB的PCR驗證：

其中：M為marker；1為以Yep-APD₃KB為模板，PGK1-U/PGK1-D為引物PCR擴增PGK1_p-DUR3-PGK1_t片段；2為以Yep-APD₃KB為模板，CD-U/CD-D為引物PCR擴增CDA-KanMX-PGK1_p-DUR3-PGK1_t-CDB片段；

圖3為CAR1基因的敲除同時DUR3基因的過表達重組菌株的驗證：

(a)中M為marker；1為以出發(fā)菌株的基因組為模板，D-S/KD-S為引物，PCR擴增驗證片段；2為以重組菌株1的基因組為模板，D-S/KD-S為引物，PCR擴增驗證片段；3為以出發(fā)菌株的基因組為模板，PD-X/D-X為引物，PCR擴增驗證片段；4為以重組菌株1的基因組為模板，PD-X/D-X為引物，PCR擴增驗證片段；

(b)中M為marker；1為以重組菌株1的基因組為模板，2為以重組菌株2的基因組為模板，以Kan-U/Kan-D為引物，PCR擴增驗證片段；

(c)中M為marker；1為以傳代后的重組菌株2的基因組為模板，2為以傳代前的重組菌株2的基因組為模板，以Zeocin-U/Zeocin-D為引物，PCR擴增驗證片段；

圖4為9-羥基噸與尿素在酸性條件下衍生反應(yīng)示意圖。

具體實施方式：

下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明的一種低產(chǎn)EC釀酒酵母及其選育方法。下述實施例中所用的技術(shù)手段，如無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。

實施例1：低產(chǎn)氨基甲酸乙酯釀酒酵母的構(gòu)建

本實例所用的出發(fā)菌株CGMCC No.3373。所述大腸桿菌DH5a購自Takara公司。所述YEPD培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基含2％進口瓊脂粉。

根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計了下述引物。

表1本實施例中所用到的引物

注：下劃線部分為酶切位點。

表2本實施例中所用的PCR擴增體系

表3(a)Solution I連接酶連接方法

注：反應(yīng)條件為16℃水浴，過夜連接

表3(b)Infusion連接酶連接方法

注：反應(yīng)條件為50℃水浴，連接30min

(1)重組質(zhì)粒Yep-APD₃KB的構(gòu)建

重組質(zhì)粒Yep-APD₃KB的構(gòu)建流程如圖1所示；

以質(zhì)粒pPGK1為模板，PGK1-U和PGK1-D為引物，PCR擴增強啟動子PGK1基因，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃105s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI對載體質(zhì)粒YEP352和PGK1基因片段進行酶切，再用Solution I連接酶將兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-P。

以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，DUR3-U和DUR3-D為引物，PCR擴增DUR3基因，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃135s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶XhoI對質(zhì)粒Yep-P進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR3基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-P連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD₃。

以質(zhì)粒pUG6為模板，Kan-U和Kan-D為引物，PCR擴增KanMX基因，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃100s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對質(zhì)粒Yep-PD₃和KanMX基因片段進行酶切，再用Solution I連接酶將兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-PD₃K。

以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，DA-U和DA-D為引物，PCR擴增DUR3基因的上游同源臂CDA，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃60s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶KpnI對質(zhì)粒Yep-PD₃K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR3基因的上游同源臂CDA基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-PD₃K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD₃K。

以出發(fā)酵母菌株基因組為模板，DB-U和DB-D為引物，PCR擴增DUR3基因的下游同源臂CDB，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃60s，30個循環(huán)；72℃10min。用限制性內(nèi)切酶NarI對質(zhì)粒Yep-APD₃K進行酶切，再用Infusion連接酶將DUR3基因的下游同源臂CDB基因片段和酶切后的質(zhì)粒Yep-APD₃K連接構(gòu)建質(zhì)粒Yep-APD₃KB。

PCR驗證結(jié)果如圖2所示，其中：M為marker；1為以Yep-APD₃KB為模板，PGK1-U/PGK1-D為引物PCR擴增PGK1_p-DUR3-PGK1_t片段；2為以Yep-APD₃KB為模板，CD-U/CD-D為引物PCR擴增CDA-KanMX-PGK1_p-DUR3-PGK1_t-CDB片段。

(2)CAR1基因的敲除同時DUR3基因的過表達

以質(zhì)粒Yep-APD₃KB為模板，CD-U和CD-D為引物，PCR擴增“CDA-KanMX-PGK1_p-DUR3-PGK1_t-CDB”重組片段，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃40s，53℃1min，72℃435s，30個循環(huán)；72℃10min。

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入釀酒酵母出發(fā)菌株得到重組菌株1，通過G418抗性篩選重組子進行PCR驗證，在DUR3基因的上游同源臂CDA外部設(shè)計引物D-S，KanMX序列內(nèi)部設(shè)計引物KD-S；在PGK1序列內(nèi)部設(shè)計引物PD-X，DUR3基因的下游同源臂CDB外部設(shè)計引物D-X，用于驗證CAR1基因敲除同時DUR3基因過表達。以D-S和KD-S為引物，可擴增出大小為1760bp的片段；以PD-X和D-X為引物，可擴增出大小為1136bp的片段，且PCR擴增出的片段與預(yù)期的目的產(chǎn)物大小一致，而出發(fā)菌株則不能擴增得到該片段，PCR驗證結(jié)果如圖3(a)所示。

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法將帶有Cre重組酶的pGAPza質(zhì)粒化轉(zhuǎn)于重組菌株1中獲得重組菌株2；挑取轉(zhuǎn)化子在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)4-5h，稀釋涂布，挑出單菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生長而在G418抗性平板上不生長的菌株，提取基因組進行PCR驗證，即以重組菌株2的基因組為模板擴增KanMX片段，無法得到1600bp左右的條帶，而重組菌株1則能擴增得到該片段，PCR驗證結(jié)果如圖3(b)所示。將驗證正確的酵母單菌落接到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，每12h轉(zhuǎn)接一次，傳數(shù)代之后pGAPza質(zhì)粒即可丟失，提取酵母質(zhì)粒進行PCR驗證如圖3(c)所示。

結(jié)果表明，在酵母細胞中實現(xiàn)了敲除一個拷貝的CAR1基因同時強啟動子PGK1過表達DUR3基因全序列。

實施例2：低產(chǎn)EC釀酒酵母菌株發(fā)酵實驗

(1)重組菌株與出發(fā)菌株的葡萄酒發(fā)酵實驗

將重組菌株和出發(fā)菌株分別同時進行葡萄酒發(fā)酵實驗，發(fā)酵工藝路線圖：

葡萄原料→清洗、晾干、除?！扑椤{(diào)糖、調(diào)酸→加亞硫酸、滅菌→接菌→前發(fā)酵→皮渣分離→后發(fā)酵→測定指標(biāo)

工藝條件：

糖度：20.45Brix；酸度：pH 3.51；SO₂添加量：80mg/L；接菌量：3％；前發(fā)酵溫度和時間：25℃，4.5d；后發(fā)酵溫度和時間：20℃，9d。

挑取一環(huán)酵母細胞，接入裝有5mL YEPD培養(yǎng)基的試管中，30℃，180rpm培養(yǎng)12h，再按10％接種量接種到裝有45mL YEPD培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，30℃，180rpm培養(yǎng)12h后，按3％接種量接種到葡萄汁發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃靜置發(fā)酵。每隔12h稱重1次，當(dāng)兩次失重小于0.3g，前發(fā)酵結(jié)束。用紗布過濾使皮渣分離，20℃靜置進行后發(fā)酵，后發(fā)酵時間為前發(fā)酵的兩倍。發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵醪液進行過濾，得葡萄酒酒樣。測定CO₂累積排放量、酒精度、殘余還原糖、總酸和pH等發(fā)酵性能指標(biāo)，結(jié)果如表4。

表4親本菌株和重組菌株的發(fā)酵性能測定

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(2)液相色譜法測葡萄酒中尿素含量

①原理

9-羥基噸與尿素在酸性條件下生成可以產(chǎn)生具有熒光特性的衍生物(N-9H-xanthen-9-yl-X)，反應(yīng)原理如圖4所示，再經(jīng)高效液相色譜柱C18的分離，熒光檢測器的檢測，用外標(biāo)法定量。

②樣品衍生處理

取500μL酒樣用無水乙醇稀釋至1000μL，再取稀釋的酒樣500μL，加9-羥基噸溶液500μL和鹽酸溶液100μL，混勻，室溫避光衍生30min，經(jīng)有機微孔濾膜過濾后，待進樣分析。

③液相色譜檢測條件

色譜柱：Agilent-C18色譜柱：250mm×4.6mm，粒徑5μm，柱溫35℃；流動相A：乙腈；流動相B：0.02mol/L乙酸鈉溶液，用1％(V/V)乙酸調(diào)pH為7.2；流動相流速：1mL/min；熒光檢測器激發(fā)波長λ_ex＝240nm，發(fā)射波長λ_em＝308nm，增益10；進樣量20uL；梯度洗脫，詳見表5：

表5洗脫程序

結(jié)果如表6。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中尿素含量為0.85mg/L，較出發(fā)菌株降低了45.51％。

(3)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測葡萄酒中EC含量

①原理

樣品加氨基甲酸丙酯內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)過堿性硅藻土固相萃取柱凈化除雜、洗脫、濃縮后，用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。

②樣品的預(yù)處理

用固相萃取法對樣品進行預(yù)處理。準(zhǔn)確吸取2mL的酒樣或配好的EC標(biāo)品，加入20μL，10.0mg/L內(nèi)標(biāo)PC使用溶液，0.3g氯化鈉，超聲溶解、混勻后，上樣至堿性硅藻土固相萃取柱，在真空條件下，使樣品溶液慢慢滲入萃取柱，靜置約10min。經(jīng)10mL正己烷淋洗除雜后，用15mL、5％乙酸乙酯-乙醚溶液約以1mL/min流速進行洗脫，洗脫液先經(jīng)裝有2g無水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水，再收集于10mL具塞刻度試管中，室溫下用氮氣緩緩吹至0.5mL左右，用甲醇定容至1.0mL，制成待測液，供GC/MS分析。

③GC/MS的檢測條件

色譜條件：CP-WAX毛細管50m*0.25mm*0.25μm，柱溫50℃保持1min，再以3℃/min的速度增至180℃，保持1min，最后以20℃/min的速度增至220℃，保持10min。載氣：He，載氣流量：1mL/min，注射模式：不分流。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250℃，電子能量70ev，接口溫度230℃，電子倍增器電壓1568V，EC檢測離子m/z 62、74、89，定量離子m/z 62。PC檢測離子m/z 59、62、74，定量離子m/z 62。

結(jié)果如表6。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中EC含量為12.03μg/L，較出發(fā)菌株降低了36.92％。

表6親本菌株和重組菌株的尿素和EC產(chǎn)量

注：所不數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(4)液相色譜法測葡萄酒中氨基酸含量

①原理

將樣品進行DNFB柱前衍生，使氨基算衍生化成有利于分離，在紫外360nm處有吸收的化合物，經(jīng)高效液相色譜柱C18的分離，紫外檢測器的檢測，用外標(biāo)法定量。

②樣品衍生處理

取樣品20μL，加衍生緩沖液200μL和衍生劑200μL，混勻，65℃水浴避光衍生1h后取出，待溶液冷卻至室溫后，加定溶緩沖液至1200μL并混勻，放置15min后經(jīng)有機微孔濾膜過濾后，待進樣分析。

③液相色譜檢測條件

色譜柱：Agilent-C18色譜柱：250mm×4.6mm，粒徑5μm，柱溫33℃；流動相A：50％乙腈；流動相B：0.05mol/L乙酸鈉溶液；流動相流速：1mL/min；紫外檢測器波長360nm，增益10；進樣量20μL；梯度洗脫，詳見表7：

表7洗脫程序

結(jié)果如表8。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中常見氨基酸含量較出發(fā)菌株無明顯差異。

表8親本菌株和重組菌株的常見氨基酸產(chǎn)量(單位mg/L)

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(5)氣相色譜法測定酒中揮發(fā)性酸、酯和醇的含量

①酒樣預(yù)處理

準(zhǔn)確量取內(nèi)標(biāo)液(乙酸正丁酯)0.15mL于10mL容量瓶中，用待測酒樣定容并混勻，用400μm孔徑濾膜過濾后，進行高效氣相色譜測定。

②氣相色譜條件

氣相色譜儀：Agilent 7890C；色譜柱：AT.LZP-930，230℃，50m×320μm×1μm；檢測器：FID檢測器，檢測器溫度：200℃；載氣：高純氮，流速5mL/min；檢測條件：程序升溫，50℃保持8min，5℃/min升到120℃，保持8min；進樣口溫度：200℃；進樣量：1.0μL；分流方式：分流，分流比為10：1。

結(jié)果如表9。結(jié)果顯示，重組菌株2發(fā)酵所生產(chǎn)葡萄酒中常見揮發(fā)性酸、酯和醇含量較出發(fā)菌株無明顯差異。

表9親本菌株和重組菌株的揮發(fā)性酸、酯和醇產(chǎn)量(單位mg/L)

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。