本發(fā)明涉及一種異秦皮啶制備方法，屬于藥用活性成分提取
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：異秦皮啶是天然香豆素類(lèi)成分，具有較好的體內(nèi)抗炎、鎮(zhèn)痛、抗感染作用（xiaofengniu等，internationalimmunopharmacology.2015.24：432–439;lingliu等，immunobiology,2015,220:406–413；xiaofengniu等，internationalimmunopharmacology.2012.14：164–171），是中藥腫節(jié)風(fēng)、刺五加藥材特征性成分，并作為藥材質(zhì)量控制指標(biāo)性成分收載于2015版中國(guó)藥典（中國(guó)藥典，2015版，i部，第206、224頁(yè)），用于腫節(jié)風(fēng)、刺五加藥材及其制劑質(zhì)量控制。目前文獻(xiàn)報(bào)道異秦皮啶的制備方法有大孔樹(shù)脂色譜法（何行真，江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，19（4）：45-46）、高速逆流色譜法（江永南等，中藥材，2008，31(6)：913-915）。但大孔樹(shù)脂分離法制備獲得的香豆素粗品部位中異秦皮啶含量?jī)H為2.59%，而采用高速逆流儀器貴重成本高、有機(jī)溶劑用量大，且制備富集部位仍為粗品，異秦皮啶得率只有3%。其它已申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利的異秦皮啶制備工藝方法包括從刺五加根莖中醇提取、酸水解、1,1-二氯乙烷萃取獲得異秦皮啶，但也僅為粗產(chǎn)品（祖元?jiǎng)?，一種從刺五加根莖中制備異秦皮啶的方法，專(zhuān)利號(hào)：201010184243.7）。迄今為止，還沒(méi)有一種簡(jiǎn)單可行、制備成本相對(duì)低廉的異秦皮啶單體制備工藝公開(kāi)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉且所得產(chǎn)品純度高的異秦皮啶制備方法。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式為：a.取腫節(jié)風(fēng)藥材飲片，用5-15倍原材料重量水加熱取2次，每次30?120min，合并提取濾液，過(guò)濾，濾液備用；b.濾液濃縮至適當(dāng)體積，環(huán)己烷-乙酸乙酯（1:1，體積比）等體積萃取1-4次；c.環(huán)己烷-乙酸乙酯萃取相真空減壓濃縮，有機(jī)溶劑復(fù)溶，1-3倍硅膠干法拌樣，經(jīng)5-20倍硅膠柱層析，石油醚：丙酮（15:8，體積比）洗脫，薄層分析，合并含有異秦皮啶流分；d.甲醇復(fù)溶富含異秦皮啶合并流分，經(jīng)凝膠柱色譜，甲醇洗脫脫色素，再經(jīng)ods柱色譜，meoh-h2o洗脫，得純度大于85%粗品異秦皮啶，甲醇-水重結(jié)晶，即得純度大于99%純品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明提取用原料藥材來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉；對(duì)腫節(jié)風(fēng)藥材飲片采用水加熱提取方法，大大減少了全草類(lèi)藥材提取液中色素類(lèi)雜質(zhì)；根據(jù)異秦皮啶兼有親水、親酯性特點(diǎn)，采用環(huán)己烷-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑萃取，能最大程度減少其它水溶性成分共萃取，降低色素干擾，從而減少后續(xù)繁瑣的去除無(wú)關(guān)雜質(zhì)及色素分離操作；液液萃取用有機(jī)溶劑可回收反復(fù)利用；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，無(wú)需用到貴重儀器設(shè)備，從而使樣品制備成本大大減低。附圖說(shuō)明圖1是異秦皮啶uv吸收光譜圖。圖2是異秦皮啶電噴霧（esi）正離子模式高分辨質(zhì)譜圖。圖3是異秦皮啶氫核磁（1h-nmr，500mhz,dmso-d6）譜圖。圖4是異秦皮啶碳核磁（1h-nmr，125mhz,dmso-d6）譜圖。圖5是腫節(jié)風(fēng)水提取液hplc色譜圖。圖6是腫節(jié)風(fēng)水提取液環(huán)己烷-乙酸乙酯萃取部分hplc色譜圖。圖7是分離制備異秦皮啶hplc色譜圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1.異秦皮啶提取分離取腫節(jié)風(fēng)全草藥材12kg（約3cm/段），置100l中藥提取罐中，第一次加84l水浸潤(rùn)0.5小時(shí)，100℃加熱煎煮2h,第二次加42l水100℃加熱煎煮1.5h,，紗布濾過(guò)，濃縮至7l（相當(dāng)于藥材濃度約1.7g/ml），環(huán)己烷-乙酸乙酯（1:1）等體積萃取4次，合并萃取液，濃縮干燥，乙酸乙酯-甲醇溶解萃取回收可溶部分（44g），100g柱層析硅膠（100～200目）均勻拌樣，室溫?fù)]去溶劑，700g柱層析硅膠（200～300目）干法裝柱，石油醚ii：丙酮（15:8）梯度洗脫2個(gè)柱體積，每500ml為一個(gè)流分收集，濃縮回收有機(jī)相，得各子流分，薄層分析，石油醚ii（沸點(diǎn)60-90℃）：丙酮（1:1）展開(kāi)，石油醚ii：丙酮（15:8）洗脫第6-16瓶在紫外燈365nm下與異秦皮啶對(duì)照品相同位置顯天藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。合并含異秦皮啶留分，經(jīng)凝膠（sephadexlh-20）柱層析，甲醇洗脫，薄層分析，合并含有異秦皮啶子流分，再經(jīng)ods柱色譜，甲醇-水（20:80?30:70）洗脫，30%甲醇洗脫部分得異秦皮啶粗品(2.9g)，經(jīng)甲醇-水重結(jié)晶，即得異秦皮啶純品。2.異秦皮啶結(jié)構(gòu)鑒定白色粉末（meoh）,uvλmax(meoh)nm:342nm（附圖1）;hr-esi-ms+：m/z223.05983[m+h]++（calcdforc11h11o5+，-1.2ppm）（附圖2）.1h-nmr(500mhz,dmso-d6)δ:7.89(1h,d,j=9.5hz,h-4),6.22(1h,d,j=9.5hz,h-3),7.01(1h,s,h-5),3.82(3h,s,6-och3),3.81(3h,s,8-och3)。13c-nmr(125mhz,dmso-d6)δ:160.7(c-2),146.2(c-6),145.3(c-4),144.9(c-9),143.5(c-7),135.2(c-8),112.1(c-3),104.9(c-5),110.4(c-10),61.0(och3-8),56.6(och3-5)，見(jiàn)附圖3-4。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[許旭東，胡曉茹，袁經(jīng)權(quán)，楊峻山,等.草珊瑚中香豆素化學(xué)成分研究.中國(guó)中藥雜志.2008,33(8),900-902]報(bào)道基本一致。3.異秦皮啶高效液相分析3.1定性分析儀器：waters2695高效分析液相，配2998pad二極管整列檢測(cè)器。主要色譜條件：色譜柱：xbridgetmc18(4.6′250mm,5μm)；柱溫：40℃；流速0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330nm;流動(dòng)相：甲醇(a)-0.1%甲酸水(b)梯度洗脫條件為0-10min,20?22%a,10-30min,20?37%a,30-45min,37?42%a；進(jìn)樣體積：20μl。供試品溶液制備及分析：分別制備相當(dāng)于腫節(jié)風(fēng)藥材0.2g/ml的藥材水提取液、相當(dāng)于萃取物10mg/ml的有機(jī)溶劑萃取部分以及從腫節(jié)風(fēng)中分離制備的異秦皮啶對(duì)照品供試品溶液，進(jìn)樣hplc分析，色譜圖見(jiàn)附圖5-7。3.2定量分析檢測(cè)波長(zhǎng)：341nm;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水（20:80）；其它條件同3.1定性分析。對(duì)照品溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立：異秦皮啶標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所，批次110837-201507，含量以99.2%計(jì)），十萬(wàn)分之一精密分析天平分別精密稱(chēng)取1.03、1.07mg，移取1ml甲醇，超聲溶解，即得母液存儲(chǔ)液，其中濃度為1.03mg/ml母液分別稀釋2,4,6,8,16,32,64,128,256倍，進(jìn)樣20μl，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立，濃度為1.07mg/ml稀釋8倍用于質(zhì)控，經(jīng)儀器分析軟件處理，線(xiàn)性方程為y=6.54e+004x-7.08e+004，r=0.9999，線(xiàn)性范圍為3.99-510.88μg/ml。供試品溶液制備及含量測(cè)定：分別平行制備3份qc質(zhì)控液、異秦皮啶粗品、異秦皮啶重結(jié)晶、腫節(jié)風(fēng)全草水提液（相當(dāng)于藥材0.2g/ml）以及腫節(jié)風(fēng)全草水提環(huán)己烷-乙酸乙酯（1:1）萃取部分（相當(dāng)于萃取浸膏0.01g/ml），hplc進(jìn)樣分析，計(jì)算含量，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表一。表一.制備異秦皮啶及樣品測(cè)定結(jié)果樣品質(zhì)控樣品異秦皮啶粗品異秦皮啶結(jié)晶水提液萃取物含量(%)98.6±1.086.5%±0105.5±0.40.03±02.8±0.13.3結(jié)果分析從表一可知，結(jié)晶后異秦皮啶純度可達(dá)105%，可以用于含量測(cè)定。從附圖5-7可知，在同一檢測(cè)波長(zhǎng)下，腫節(jié)風(fēng)水提取物中除保留時(shí)間為16.0min異秦皮啶目標(biāo)成分，還有其它干擾性成分，而在腫節(jié)風(fēng)水提物環(huán)己烷-乙酸乙酯（1:1）萃取部分，只有異秦皮啶一個(gè)主成分，進(jìn)一步測(cè)得在其萃取物中含量是藥材中含量93倍（表一），采用環(huán)己烷-乙酸乙酯液液萃取方法優(yōu)勢(shì)明顯。本工藝流程換算成藥材制備異秦皮啶得率約0.025%，制備得率較高，從而使樣品制備成本大大減低。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、同等替換和改進(jìn)等，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12