本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，更具體地，涉及一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法。

背景技術(shù)：

重組腺相關(guān)病毒(raav)具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、能介導(dǎo)外源基因在動物體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)，是基因治療領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的載體之一。raav在神經(jīng)科學(xué)研究以及疾病的基因治療等領(lǐng)域具有重要作用和巨大需求。有研究數(shù)據(jù)表明，一次大型靈長類動物試驗(yàn)或臨床基因治療試驗(yàn)就需要約10¹⁵vg(vg，virusgenomes)的raav，是一般體外細(xì)胞試驗(yàn)或小鼠試驗(yàn)用量的成百上千倍(humgenether.2002nov1；13(16):1935-43.)。

桿狀病毒(baculovirus)屬于桿狀病毒科，專一性寄生于節(jié)肢動物體內(nèi)，多見于昆蟲綱的鱗翅目昆蟲，可感染600多種昆蟲。桿狀病毒是有囊膜的雙鏈環(huán)狀dna病毒，其基因組大小在90kb-230kb之間，編碼上百種蛋白。1983年，smith首次利用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(autographacalifornicamulticapsidnuclearpolyhedrosisvirus，acmnpv)在草地貪夜蛾細(xì)胞系sf9中成功表達(dá)了人β-干擾素，首創(chuàng)了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(molcellbiol,1983,3:2156-2165)。1985年，maeda用家蠶核型多角體病毒(bombyxmorinuclearpolyhydrosisvirus，bmnpv)作為表達(dá)載體，在家蠶體內(nèi)表達(dá)了人α-干擾素(nature,1985,315:592-594)。此后，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)不斷完善和發(fā)展，已經(jīng)成為應(yīng)用非常廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲是一類與腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,aav)同屬于微小病毒科(parvoviridae)的濃核病毒 亞科(densovirinae)病毒的自然宿主。2002年，urabe等人證實(shí)了感染桿狀病毒的sf9昆蟲細(xì)胞可以支持aav的復(fù)制，利用分別攜帶有aav的rep基因、cap基因以及itr核心表達(dá)元件的三種重組桿狀病毒共同感染sf9細(xì)胞制備出了raav，成功建立了三桿狀病毒系統(tǒng)(threebacsystem),(humgenether.2002nov1；13(16):1935-43.)。在此基礎(chǔ)上，研究者相繼開發(fā)出了更適合大規(guī)模制備raav的兩桿狀病毒系統(tǒng)(twobacsystem),(molther.2008may；16(5):924-30，molther.2009nov；17(11):1888-96.)以及依賴感染誘導(dǎo)表達(dá)rep基因和cap基因的包裝細(xì)胞系的一桿狀病毒系統(tǒng)(onebacsystem),(procnatlacadsciusa.2009mar31；106(13):5059-64，humgenether.2014mar；25(3):212-22.)。

目前利用桿狀病毒系統(tǒng)大規(guī)模制備raav的方法，都是依靠重組桿狀病毒感染體外培養(yǎng)的特定的昆蟲細(xì)胞系，如sf9、sf21細(xì)胞等。然而體外細(xì)胞系培養(yǎng)工藝復(fù)雜，設(shè)備條件要求苛刻、生產(chǎn)成本高昂。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法，其目的在于利用一種重組桿狀病毒感染昆蟲幼蟲大規(guī)模生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒，由此解決現(xiàn)有的重組腺相關(guān)病毒生產(chǎn)方法工藝復(fù)雜、條件要求苛刻、生產(chǎn)成本高昂的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將目標(biāo)基因構(gòu)建在重組型桿狀病毒上，所述重組桿狀病毒其基因組整合了制備重組腺相關(guān)病毒所必需的腺相關(guān)病毒的rep基因、cap基因以及攜帶有目標(biāo)基因的itr核心表達(dá)元件；

(2)將步驟(1)中制得的重組桿狀病毒感染宿主昆蟲幼蟲，使得所述宿主昆蟲幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量重組腺相關(guān)病毒；

(3)將步驟(2)中獲得的宿主昆蟲幼蟲裂解，提取重組型腺相關(guān)病 毒并進(jìn)行純化。

優(yōu)選地，所述制備方法，其步驟(2)具體包括以下步驟：

(2-1-1)將孵化后的宿主昆蟲幼蟲飼養(yǎng)至幼蟲長到4-5齡；

(2-1-2)將步驟(1)中制得的重組桿狀病毒，對(2-1-1)中獲得的宿主昆蟲幼蟲進(jìn)行皮下注射接毒，滴度在1×10e+7vg/ml至1×10e+9vg/ml，接毒體積在10μl-20μl；

(2-1-3)將步驟(2-1-2)中注射了重組桿狀病毒的宿主昆蟲幼蟲飼養(yǎng)至幼蟲出現(xiàn)食欲減弱、行動遲緩、體節(jié)腫脹、和/或體色變淡的病變癥狀時(shí)，結(jié)束飼養(yǎng)收獲蟲體。

優(yōu)選地，所述制備方法，其步驟(2-1-3)在所述宿主昆蟲幼蟲感染相應(yīng)所述重組桿狀病毒后的3至7天期間出現(xiàn)典型病變癥狀時(shí)，蟲體死亡之前結(jié)束飼養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述重組型桿狀病毒為基于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(acmnpv)或家蠶核型多角體病毒(bmnpv)。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述宿主昆蟲幼蟲為甜菜夜蛾(beetarmyworm,spodopteraexigua)幼蟲或家蠶(silkworm,bombyxmori)幼蟲。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述步驟(3)將所述宿主昆蟲幼蟲裂解，其具體操作步驟如下：

將所述宿主昆蟲幼蟲搗碎研磨，加入pbs溶液勻漿，凍融后，制得裂解物。

優(yōu)選地，所述制備方法，其步驟(3)所述提純具體操作如下：

將所述宿主昆蟲幼蟲裂解后，將裂解物離心，取上清液，用氯仿抽提，獲得初步純化的重組腺相關(guān)病毒。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果：

飼養(yǎng)昆蟲幼蟲相比體外培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，具有設(shè)備簡單容易推廣，成本 低，產(chǎn)物生物活性高，是天然的生物反應(yīng)器產(chǎn)量高等不可比擬的優(yōu)勢。本發(fā)明提供的方法，通過一種高度整合的重組桿狀病毒感染昆蟲幼蟲，從而大量制備品質(zhì)穩(wěn)定的基因治療用重組腺相關(guān)病毒載體。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的重組腺相關(guān)病毒制備方法的流程示意圖；

圖2是raav的包裝原理圖(a)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(bactobac)中穿梭質(zhì)粒pfast.bac.dual(pfbd)的結(jié)構(gòu)示意圖(b)以及整合了制備raav所需組件的重組穿梭質(zhì)粒pfbd/cap-(itr-gfp)-rep的結(jié)構(gòu)示意圖(c)；

圖3是實(shí)施例中利用重組桿狀病毒感染宿主昆蟲細(xì)胞或宿主昆蟲幼蟲制備raav的過程示意圖；

圖4是實(shí)施例1中制備重組桿狀病毒感染宿主sf9細(xì)胞制備raav以及病毒活性的驗(yàn)證圖；其中，圖4a是重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染sf9細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；圖4b是實(shí)例1中制備的raav感染hek293和sf9細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；

圖5是實(shí)施例1中使用的正常甜菜夜蛾幼蟲以及感染了重組桿狀病毒后出現(xiàn)明顯病變的蟲體形態(tài)圖。

圖6是實(shí)施例1中利用重組桿狀病毒感染宿主甜菜夜蛾幼蟲制備raav以及病毒活性的驗(yàn)證圖；其中，圖6a是蟲體裂解液上清感染hek293和sf9細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；圖6b是氯仿抽提純化后的裂解液上清感染hek293細(xì)胞的熒光顯微成像圖；

圖7是實(shí)施例2中制備重組桿狀病毒感染宿主bmn細(xì)胞制備raav以及病毒活性的驗(yàn)證圖；其中，圖7a是重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染bmn細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；圖7b是實(shí)例2中制備的raav感染hek293和bmn細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；

圖8是實(shí)施例2中使用的正常家蠶幼蟲以及感染了重組桿狀病毒后出現(xiàn)明顯病變的蟲體形態(tài)圖。

圖9是實(shí)施例2中利用重組桿狀病毒感染宿主家蠶幼蟲制備raav以及病毒活性的驗(yàn)證圖；其中，圖9a是蟲體裂解液上清感染hek293和bmn細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；圖9b是氯仿抽提純化后的裂解液上清感染hek293細(xì)胞的熒光顯微成像圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

昆蟲是桿狀病毒的天然宿主。然而，目前利用桿狀病毒系統(tǒng)大規(guī)模制備raav的方法，都是依靠感染體外培養(yǎng)的特定的昆蟲細(xì)胞系。昆蟲幼蟲飼養(yǎng)相比體外培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，具有設(shè)備簡單容易推廣，成本低，產(chǎn)物生物活性高，是天然生物反應(yīng)器產(chǎn)量高等不可比擬的優(yōu)勢。迄今，尚沒有利用重組桿狀病毒感染昆蟲幼蟲制備raav的方法。原因是目前的桿狀病毒系統(tǒng)制備raav方法存在難以克服的缺陷：現(xiàn)有的三桿狀病毒系統(tǒng)或兩桿狀病毒系統(tǒng)，由于多種重組桿狀病毒共感染單個昆蟲細(xì)胞是隨機(jī)事件效率低，感染昆蟲幼蟲相比體外培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞將更加無法控制，raav的高效生產(chǎn)無法實(shí)現(xiàn)。對于現(xiàn)有的依賴感染誘導(dǎo)表達(dá)rep基因和cap基因的包裝細(xì)胞系的一桿狀病毒系統(tǒng)，雖然將raav的包裝元件rep基因、cap基因構(gòu)建到包裝細(xì)胞系基因組中可行，然而構(gòu)建類似的誘導(dǎo)表達(dá)rep基因、cap基因的轉(zhuǎn)基因昆蟲幼蟲卻難以實(shí)現(xiàn)。尚沒有利用重組桿狀病毒感染昆蟲幼蟲制備raav的應(yīng)用。開發(fā)出不依賴包裝細(xì)胞系的制備raav的真正的一桿狀病毒系統(tǒng)(onebacsystem)，是實(shí)現(xiàn)利用重組桿狀病毒感染昆蟲大規(guī)模制備raav的關(guān)鍵前提條件，如圖3所示。

優(yōu)選采用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒或家蠶核型多角體病毒。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(acmnpv)是一種能交叉感染30多種鱗翅目昆蟲的桿狀病毒，由于其感染宿主存在特異性，acmnpv不感染家蠶，而能夠感染甜菜夜蛾。由于甜菜夜蛾野外分布廣泛，容易人工飼養(yǎng)，是研究acmnpv感染昆蟲蟲體的常用宿主昆蟲之一(plosone.2012；7(7):e42462)，基于acmnpv的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是開發(fā)最早，應(yīng)用最廣泛的一種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(biotechnolj.2015may；10(5):702-14.)。

家蠶核型多角體病毒(bmnpv)感染宿主范圍較小，其不感染甜菜夜蛾，而能夠感染家蠶。家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中種桑家蠶獲得蠶絲并生產(chǎn)絲綢，在世界上有著上千年的悠久歷史?；赽mnpv的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也已經(jīng)發(fā)展成為一種應(yīng)用廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)(applmicrobiolbiotechnol.2010jan；85(3):459-70)。

研發(fā)利用重組桿狀病毒感染昆蟲大規(guī)模制備raav的新方法，將為重要基因治療病毒載體之一的raav生產(chǎn)提供嶄新的平臺，也將促進(jìn)生物醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)中的基因治療產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的昆蟲養(yǎng)殖業(yè)的融合發(fā)展。

本發(fā)明提供的重組腺相關(guān)病毒的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟:

(1)將目標(biāo)基因構(gòu)建在重組型桿狀病毒上，所述重組型桿狀病毒其基因組整合了腺相關(guān)病毒的rep基因、cap基因以及攜帶有目標(biāo)基因的itr核心表達(dá)元件。

所述重組桿狀病毒，優(yōu)選基于acmnpvclonee2(基因組序列如：genbankaccessionno.km667940.1，參考journalofvirology,aug.1993,p.4566-4579)或acmnpvclonec6(基因組序列如：genbankaccessionno.nc_001623.1)或bmnpvisolatet3(基因組序列如：genbankaccessionno.l33180.1，參考virologicasinica,june2007,22(3):0218-225)，整合了aav的rep基因、cap基因和攜帶有目標(biāo)基因的itr核心表達(dá)元件，所述rep基因和cap基因優(yōu)選依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。

所述itr核心表達(dá)元件，兩端包括aav基因組中的一段末端反向重復(fù)序列(itr)，中間為攜帶的目標(biāo)基因(goi)片段，通過5’端連接核酸片段和3’端連接核酸片段與所述rep基因和cap基因的表達(dá)框相連。其中，rep基因和cap基因，皆可處于itr核心表達(dá)元件的上游或下游。

所述rep基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過ph啟動子轉(zhuǎn)錄出一條mrna，實(shí)現(xiàn)rep72、rep52復(fù)制蛋白的功能性表達(dá)。其序列優(yōu)選為如seqidno.1所示。

所述cap基因密碼子優(yōu)化同樣利用核糖體泄露掃描原理，通過p10啟動子轉(zhuǎn)錄出一條mrna，實(shí)現(xiàn)vp1、vp2、vp3三種衣殼蛋白以接近天然比例(1:1:10)的功能性表達(dá)。其序列優(yōu)選為如seqidno.2所示。

itr核心表達(dá)元件，通過兩端的連接核酸片段與rep基因、cap基因的表達(dá)框連接。itr為aav基因組中的一段末端反向重復(fù)序列，優(yōu)選2型aav的itr序列，如seqidno.3所示。所述5’端或3’端連接核酸序列優(yōu)選長度在80bp-140bp之間的連接核酸序列，如seqidno.4或seqidno.5所示。itr核心表達(dá)元件在實(shí)例中選用含cmv啟動子、gfp基因、sv40ploya組件的gfp基因表達(dá)框，便于技術(shù)方案的驗(yàn)證。

整合到桿狀病毒基因組上的rep基因、cap基因和itr核心表達(dá)元件的優(yōu)選組合方案，如圖2c所示。

本發(fā)明提供的重組桿狀病毒(優(yōu)選基于acmnpv或bmnpv)，可按照如下方法制備：

a、采用基因人工合成的方法獲得密碼子優(yōu)化的rep基因、cap基因；采用基因人工合成、pcr擴(kuò)增和酶切連接的方法獲得itr核心表達(dá)元件。

b、通過分子克隆的方法將步驟a中獲得的rep基因、cap基因以及itr核心表達(dá)元件構(gòu)建到pfast.bac.dual(pfbd)穿梭載體上(如圖2b)，根據(jù)bactobac系統(tǒng)操作方法，將重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主sf9細(xì)胞或bmn細(xì)胞，獲得相應(yīng)的重組桿狀病毒。

raav載體dna一般是用外源目的基因表達(dá)元件替換aav的編碼基因，僅保留了病毒復(fù)制和包裝所需的itr序列。制備raav需要反式補(bǔ)償rep基因、cap基因和輔助病毒功能因子，如圖2a所示。

(2)將步驟(1)中制得的重組型桿狀病毒感染宿主昆蟲幼蟲，使得所述宿主昆蟲幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量重組腺相關(guān)病毒。所述感染可通過皮下注射接毒方式進(jìn)行，具體包括以下步驟：

(2-1-1)將孵化后的宿主昆蟲幼蟲，在適宜溫度和濕度的潔凈培養(yǎng)空間中，利用飼料飼養(yǎng)，直至幼蟲長到4-5齡。

(2-1-2)將制得的重組桿狀病毒，以適當(dāng)病毒劑量，對4-5齡宿主昆蟲幼蟲進(jìn)行皮下注射接毒。

(2-1-3)繼續(xù)飼養(yǎng)感染了重組桿狀病毒的宿主昆蟲幼蟲，使病毒在幼蟲體內(nèi)復(fù)制增值，直至病毒大量復(fù)制后幼蟲出現(xiàn)食欲減弱、行動遲緩、體節(jié)腫脹、和/或體色變淡的典型病變癥狀時(shí)時(shí)，一般在注射后3-7天，結(jié)束飼養(yǎng)收獲蟲體。

(3)將步驟(2)中獲得的昆蟲幼蟲裂解，提取重組型腺相關(guān)病毒并進(jìn)行純化。

將收集的蟲體搗碎研磨，加入pbs溶液勻漿，然后反復(fù)凍融3次，5000rpm離心10min，取蟲體裂解上清液。然后用氯仿抽提，獲得初步純化的raav。

以下為實(shí)施例：

實(shí)施例1.重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染甜菜夜蛾幼蟲制備raav

(1)重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep的構(gòu)建及其活性驗(yàn)證

為了將raav制備所需的三種主要組件：cap基因、rep基因以及含有itr的核心表達(dá)元件置于一個重組桿狀病毒中。我們利用了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)bactobac中的pfast.bac.dual(pfbd)穿梭載體。實(shí)例中基于2型aav 的rep基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，rep基因置于ph啟動子的調(diào)控之下，實(shí)現(xiàn)rep72、rep52復(fù)制蛋白的功能性表達(dá)。rep基因序列為如seqidno.1所示的序列。實(shí)例中基于2型aav的cap基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，cap基因置于p10啟動子的調(diào)控之下，實(shí)現(xiàn)vp1、vp2、vp3三種衣殼蛋白以接近天然比例(1:1:10)的功能性表達(dá)。cap基因序列為如seqidno.2所示的序列。itr核心表達(dá)元件，實(shí)例中itr選用2型aav的itr核酸序列，即如seqidno.3所示的序列，itr的核心表達(dá)元件采用了綠色熒光蛋白(gfp)表達(dá)框，由cmv啟動子控制gfp的表達(dá)，便于檢測raav的活性。itr核心表達(dá)元件通過5’端連接核酸片段和3’端連接核酸片段與rep基因和cap基因的表達(dá)框相連。5’端或3’端連接核酸片段為如seqidno.4(linka)或seqidno.5(linkb)所示的序列。

在本實(shí)例中，重組桿狀病毒中主要組件選取的組合方案如下；

cap-linka-(itr-gfp)-linkb-rep

利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將itr核心表達(dá)元件(itr-gfp)通過連接核酸片段置于pfbd載體的p10和ph啟動子之間，構(gòu)建pfbd/cap-(itr-gfp)-rep重組穿梭質(zhì)粒，如圖2c所示。

參照bactobac系統(tǒng)操作說明，將該重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有acmnpv桿狀病毒基因組的acdh10bac菌。通過tn7轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的重組得到重組桿狀病毒基因組(bacmid)。通過藍(lán)白斑篩選和pcr鑒定獲得含有重組bacmid的陽性菌。抽提純化重組bacmid，將其轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)的sf9細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞逐漸被轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的重組桿狀病毒完全感染并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(cpe)現(xiàn)象。將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，上清中就含有產(chǎn)生的重組桿狀病毒。

將上清液感染貼壁培養(yǎng)的sf9細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)3天，可以看到對照組未感染病毒的sf9細(xì)胞狀態(tài)正常，沒有g(shù)fp的表達(dá)。而在實(shí)驗(yàn)組感染了bev 的sf9細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的cpe現(xiàn)象，有明顯的gfp表達(dá)，如圖4a。這表明該方案成功制備出了重組桿狀病毒。將轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后制備的bev再感染培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，感染3天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯cpe，將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，收上清即可獲得大量bev。病毒的滴度用熒光定量pcr的方法進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)(procnatlacadsciusa,2009.106(13):p.5059-64)中的方法。

將實(shí)施例1中制備得到的bev以感染復(fù)數(shù)(moi＝5)感染培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，感染72小時(shí)后，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。bev產(chǎn)生后，主要通過分泌釋放到培養(yǎng)基上清中，在sf9細(xì)胞中也有部分未釋放的bev。raav產(chǎn)生后，主要存在于細(xì)胞核中，由于昆蟲細(xì)胞被感染后發(fā)生細(xì)胞病變(cpe)，部分細(xì)胞會裂解，raav也會有部分釋放到上清中。而因此上清和細(xì)胞中會同時(shí)存在bev和raav。

為了驗(yàn)證用重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞制備出了具有活性的raav。在此通過病毒感染hek293細(xì)胞和sf9細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)該系統(tǒng)制備出了raav，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4b。具體實(shí)施過程和結(jié)果分析如下：將細(xì)胞沉淀反復(fù)凍融3次裂解后，5000rpm離心5min收集細(xì)胞裂解上清液。因?yàn)閞aav無包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，活性不受影響；而重組桿狀病毒(bev)有包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，失去活性。含有病毒的上清液感染hek293細(xì)胞2天后，利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，在處理前后都有g(shù)fp表達(dá)，表明raav在處理前后都有感染活性。bev感染sf9細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后僅有少量gfp表達(dá)，表明bev可以感染hek293細(xì)胞，滅活處理后bev不感染，但上清中少量的raav仍能夠感染。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后gfp強(qiáng)度有降低但仍有較強(qiáng)熒光，表明滅活處理后bev不感染，但上清中大量的raav仍能夠感染。用與感染hek293細(xì)胞組相同的樣品感染sf9細(xì)胞2天后，結(jié)果顯示：利用傳統(tǒng)的 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，沒有g(shù)fp熒光，表明raav對sf9細(xì)胞沒有感染性。bev感染sf9細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，滅活后前有較強(qiáng)gfp表達(dá)，滅活后的沒有g(shù)fp表達(dá)。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后的沒有g(shù)fp表達(dá)。

圖4以上結(jié)果證明，重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染培養(yǎng)的sf9細(xì)胞能夠制備出raav。

(2)利用重組桿狀病毒(bev)感染甜菜夜蛾幼蟲制備raav

將孵化后的甜菜夜蛾幼蟲飼養(yǎng)至4-5齡，長度約2cm左右(蟲重約0.15g)，將蟲體在冰上麻醉，然后用微量注射器對蟲體進(jìn)行皮下注射接毒，注射量約10μl(bev的滴度約為1×10e+9vg/ml)的重組桿狀病毒，然后放入有蓋的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)飼養(yǎng)3-4天，被感染的宿主幼蟲明顯出現(xiàn)食欲減弱，行動遲緩的病變現(xiàn)象。典型癥狀為體結(jié)腫脹，體色變淡，表皮薄脆。未感染的甜菜夜蛾幼蟲狀態(tài)正常(如圖5)。

(3)裂解蟲體，抽提raav并驗(yàn)證其活性

將收集的蟲體搗碎研磨，加入pbs溶液勻漿，然后反復(fù)凍融3次，5000rpm離心10min，取蟲體裂解上清液。bev感染甜菜夜蛾蟲體后，bev增殖的同時(shí)，蟲體細(xì)胞也將產(chǎn)生raav。蟲體裂解上清液中會同時(shí)存在bev和raav。

為了驗(yàn)證用重組桿狀病毒注射感染甜菜夜蛾幼蟲制備出了具有活性的raav。通過病毒感染hek293細(xì)胞和sf9細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)在此制備出了raav，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6a。因?yàn)閞aav無包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，活性不受影響；而重組桿狀病毒(bev)有包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，失去活性。具體實(shí)施過程和結(jié)果分析如下：

含有病毒的上清液感染hek293細(xì)胞2天后，注射感染bev的蟲體裂解上清液實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后gfp強(qiáng)度有降低但仍有較強(qiáng)熒光，表明滅活處理后bev不感染，但上清中大量的raav仍能 夠感染。未感染的蟲體裂解上清液對照組，在處理前后都沒有g(shù)fp表達(dá)。

含有病毒的上清液感染sf9細(xì)胞2天后，注射感染bev的蟲體裂解上清液實(shí)驗(yàn)組，未處理的有g(shù)fp表達(dá)，處理后沒有g(shù)fp表達(dá)，表明bev在蟲體中增殖，滅活后失去感染性，而raav不感染sf9細(xì)胞。未感染的蟲體裂解上清液對照組，在處理前后都沒有g(shù)fp表達(dá)。

將蟲體裂解上清液，用氯仿抽提，進(jìn)行初步純化。因?yàn)閞aav是無囊膜的病毒，能夠耐受氯仿處理，仍舊保持感染活性；而重組桿狀病毒acmnpv是有囊膜的病毒，不耐受氯仿處理，失去活性。將氯仿處理初步純化過的蟲體裂解上清液感染hek293細(xì)胞，感染2天后，可以看到gfp的表達(dá)，如圖6b所示。以上結(jié)果證明，重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染甜菜夜蛾幼蟲，成功制備出了具有活性的raav。

實(shí)施例2.重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染家蠶幼蟲制備raav

(1)重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep的構(gòu)建及其活性驗(yàn)證

本實(shí)施例與實(shí)施例1關(guān)于構(gòu)建重組桿狀病毒過程中的其主要組件組合方案相似，如下：

cap-linka-(itr-gfp)-linkb-rep

利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將itr核心表達(dá)元件(itr-gfp)通過連接核酸片段置于pfbd載體的p10和ph啟動子之間，構(gòu)建pfbd/cap-(itr-gfp)-rep重組穿梭質(zhì)粒，如圖2c所示。

參照bactobac系統(tǒng)操作說明，將該重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有bmnpv桿狀病毒基因組的bmdh10bac菌。通過tn7轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的重組得到重組桿狀病毒基因組(bacmid)。通過藍(lán)白斑篩選和pcr鑒定獲得含有重組bacmid的陽性菌。抽提純化重組bacmid，將其轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)的bmn細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞逐漸被轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的重組桿狀病毒完全感染并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(cpe)現(xiàn)象。將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，上清中就含有產(chǎn)生的 重組桿狀病毒。

將上清液感染貼壁培養(yǎng)的bmn細(xì)胞。后繼續(xù)培養(yǎng)3天，可以看到對照組未感染病毒的bmn細(xì)胞狀態(tài)正常，沒有g(shù)fp的表達(dá)。而在實(shí)驗(yàn)組感染了bev的bmn細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的cpe現(xiàn)象，有明顯的gfp表達(dá)，如圖7a。這表明該方案成功制備出了重組桿狀病毒。將轉(zhuǎn)染bmn細(xì)胞后制備的bev再感染培養(yǎng)的bmn細(xì)胞，感染3天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯cpe，將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，收上清即可獲得大量bev。病毒的滴度用熒光定量pcr的方法進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)(procnatlacadsciusa,2009.106(13):p.5059-64)中的方法。

將實(shí)施例2中制備得到的bev以感染復(fù)數(shù)(moi＝5)感染培養(yǎng)的bmn細(xì)胞，感染72小時(shí)后，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。bev產(chǎn)生后，主要通過分泌釋放到培養(yǎng)基上清中，在bmn細(xì)胞中也有部分未釋放的bev。raav產(chǎn)生后，主要存在于細(xì)胞核中，由于昆蟲細(xì)胞被感染后發(fā)生細(xì)胞病變(cpe)，部分細(xì)胞會裂解，raav也會有部分釋放到上清中。而因此上清和細(xì)胞中會同時(shí)存在bev和raav。

為了驗(yàn)證用重組桿狀病毒感染bmn細(xì)胞制備出了具有活性的raav。在此通過病毒感染hek293細(xì)胞和bmn細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)該系統(tǒng)制備出了raav，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7b。具體實(shí)施過程和結(jié)果分析如下：將細(xì)胞沉淀反復(fù)凍融3次裂解后，5000rpm離心5min收集細(xì)胞裂解上清液。因?yàn)閞aav無包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，活性不受影響；而重組桿狀病毒(bev)有包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，失去活性。含有病毒的上清液感染hek293細(xì)胞2天后，利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，在處理前后都有g(shù)fp表達(dá)，表明raav在處理前后都有感染活性。bev感染bmn細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后僅有少量gfp表達(dá)，表明bev可以感染hek293細(xì)胞，滅活處理后bev不感染，但上清中少量的raav仍能夠感染。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組， 未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后gfp強(qiáng)度有降低但仍有較強(qiáng)熒光，表明滅活處理后bev不感染，但上清中大量的raav仍能夠感染。用與感染hek293細(xì)胞組相同的樣品感染bmn細(xì)胞2天后，結(jié)果顯示：利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，沒有g(shù)fp熒光，表明raav對bmn細(xì)胞沒有感染性。bev感染bmn細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，滅活后前有較強(qiáng)gfp表達(dá)，滅活后的沒有g(shù)fp表達(dá)。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后的沒有g(shù)fp表達(dá)。

圖7以上結(jié)果證明，重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染培養(yǎng)的bmn細(xì)胞能夠制備出raav。

(2)利用重組桿狀病毒(bev)感染家蠶幼蟲制備raav

將孵化后的家蠶幼蟲飼養(yǎng)至4-5齡，長度約4cm左右(蟲重約1g)，將蟲體在冰上麻醉，然后用微量注射器對蟲體進(jìn)行皮下注射接毒，注射量約20μl(bev的滴度約為1×10e+7vg/ml)的重組桿狀病毒，然后放入有蓋的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)飼養(yǎng)6-7天，被感染的家蠶幼蟲明顯出現(xiàn)食欲減弱，行動遲緩的病變現(xiàn)象。典型癥狀為，體結(jié)腫脹，體色變淡，表皮薄脆。而未感染的家蠶幼蟲狀態(tài)正常，如圖8所示。

(3)裂解蟲體，抽提raav并驗(yàn)證其活性

將收集的蟲體搗碎研磨，加入pbs溶液勻漿，然后反復(fù)凍融3次，5000rpm離心10min，取蟲體裂解上清液。bev感染家蠶幼蟲后，bev增殖的同時(shí)，蟲體細(xì)胞也將產(chǎn)生raav。蟲體裂解上清液中會同時(shí)存在bev和raav。

為了驗(yàn)證用重組桿狀病毒注射感染家蠶幼蟲制備出了具有活性的raav。通過病毒感染hek293細(xì)胞和bmn細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)在此制備出了raav，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9a。因?yàn)閞aav無包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，活性不受影響；而重組桿狀病毒(bev)有包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，失去活性。具體實(shí)施過程和結(jié)果分析如下：

含有病毒的上清液感染hek293細(xì)胞2天后，注射感染bev的蟲體裂解上清液實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后gfp強(qiáng)度有降低但仍有較強(qiáng)熒光，表明滅活處理后bev不感染，但上清中大量的raav仍能夠感染。未感染的蟲體裂解上清液對照組，在處理前后都沒有g(shù)fp表達(dá)。

含有病毒的上清液感染bmn細(xì)胞2天后，注射感染bev的蟲體裂解上清液實(shí)驗(yàn)組，未處理的有g(shù)fp表達(dá)，處理后沒有g(shù)fp表達(dá)，表明bev在蟲體中增殖，滅活后失去感染性，而raav不感染bmn細(xì)胞。未感染的蟲體裂解上清液對照組，在處理前后都沒有g(shù)fp表達(dá)。

將蟲體裂解上清液，用氯仿抽提，進(jìn)行初步純化。因?yàn)閞aav是無囊膜的病毒，能夠耐受氯仿處理，仍舊保持感染活性；而重組桿狀病毒bmnpv是有囊膜的病毒，不耐受氯仿處理，失去活性。將氯仿處理初步純化過的蟲體裂解上清液感染hek293細(xì)胞，感染2天后，可以看到gfp的表達(dá)，如9b所示。

以上結(jié)果證明，重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)-rep感染家蠶幼蟲，成功制備出了具有活性的raav。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。