本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一組托酚酮類(lèi)天然產(chǎn)物羅博盧酮的生物合成基因簇及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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羅博盧酮為具有A、B、C、D、E五環(huán)并構(gòu)的新骨架天然產(chǎn)物(圖1)，其中A環(huán)是2,3,4,6-四取代的吡啶環(huán)，B環(huán)為環(huán)戊酮，C環(huán)為環(huán)庚三烯酚酮(tropolone)，D環(huán)和E環(huán)為糖通過(guò)糖苷鍵及碳碳鍵與環(huán)庚三烯酚酮環(huán)縮合而成。該化學(xué)結(jié)構(gòu)區(qū)別于所有已知的天然產(chǎn)物，且到目前為止，還未有其它類(lèi)似物報(bào)道。羅博盧酮A(Rubrolone A)最初是1978年P(guān)alleron小組從Streptomyces enchinoruber中分離得到的化合物。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成是由多酶體系參與的，這些多酶體系中的各個(gè)酶系按照一定的組織結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)起作用。聚酮類(lèi)化合物的生物合成通常是由生物體內(nèi)的聚酮合酶利用乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A等二碳單元通過(guò)一系列的克萊森縮合(Claisen Condensation)形成聚酮鏈骨架，然后再經(jīng)一系列的修飾和環(huán)化，最終形成結(jié)構(gòu)各異的聚酮化合物。近年來(lái)蓬勃發(fā)展起來(lái)的組合生物合成技術(shù)，為天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)了新的機(jī)遇。在闡明了自然界的生物合成途徑、理解自然界聚酮化合物天然組合生物合成機(jī)理的基礎(chǔ)上，人們可以采用組合生物合成技術(shù)對(duì)抗生素的生物合成基因、調(diào)控基因進(jìn)行分子遺傳操作和異源表達(dá)，不但能夠生產(chǎn)“非天然”的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，而且還可以提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，或定向積累所需要的天然產(chǎn)物，為天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)提供化合物結(jié)構(gòu)和生物活性多樣化。目前現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有為羅博盧酮的生產(chǎn)菌鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(Streptomyces sp.KIB-H033)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種羅博盧酮的生物合成基因簇，同時(shí)提供鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(KIB-H033)，從其中獲得的化合物1-4，它們的藥物組合物，以及制備方法和在制藥中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種托酚酮類(lèi)天然產(chǎn)物羅博盧酮的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第6308～28758位的堿基序列所示。

鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535。

如所述的一種托酚酮類(lèi)天然產(chǎn)物羅博盧酮的生物合成基因簇，該生物合成基因簇是從包含有整個(gè)羅博盧酮生物合成基因簇的科斯質(zhì)粒p9B10中測(cè)序獲得的，該羅博盧酮的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第6308～28758位的堿基序列所示，包含24個(gè)基因，具體為：

(1)負(fù)責(zé)羅博盧酮的酚酮七元環(huán)骨架合成的基因，即rubA、rubB、rubC、rubE1、rubE2、rubE3、rubE4、rubE5、rubE6、rubE7、rubE8、rubE9共12個(gè)基因：

rubA位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第16318-17253個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為936個(gè)堿基對(duì)，編碼F-420依賴(lài)的氧化還原酶，311個(gè)氨基酸；

rubB位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第17831-19387個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1557個(gè)堿基對(duì)，編碼氧化酶，518個(gè)氨基酸；

rubC位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第19384-20553個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1170個(gè)堿基對(duì)，編碼水解酶，389個(gè)氨基酸；

rubE1位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第20926-21885個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為960個(gè)堿基對(duì)，編碼III型酮基合成酶，319個(gè)氨基酸；

rubE2位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第22167-22442個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為276個(gè)堿基對(duì)，編碼II型PKS?；d體蛋白，91個(gè)氨基酸；

rubE3位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第22597-23517個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為921個(gè)堿基對(duì)，編碼?；D(zhuǎn)移酶，306個(gè)氨基酸；

rubE4位于基因簇核苷酸序列第23587-23841個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為255個(gè)堿基對(duì)，編碼II型PKS酰基載體蛋白，84個(gè)氨基酸；

rubE5位于基因簇核苷酸序列第24281-24775個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為495個(gè)堿基對(duì)，編碼環(huán)化/脫氫酶，164個(gè)氨基酸；

rubE6位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第24775-25530個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為756個(gè)堿基對(duì)，編碼環(huán)化酶，251個(gè)氨基酸；

rubE7位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第25527-26147個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為621個(gè)堿基對(duì)，編碼NADH依賴(lài)的脫氫酶，206個(gè)氨基酸；

rubE8位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第26297-27526個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1230個(gè)堿基對(duì)，編碼II型PKS酮基合成酶，409個(gè)氨基酸；

rubE9位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第27556-28758個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1203個(gè)堿基對(duì)，編碼II型PKS鏈延伸因子模塊，400個(gè)氨基酸；

(2)負(fù)責(zé)羅博盧酮的糖基合成的基因，即rubS1、rubS2、rubS3、rubS4、rubS5、rubS6、rubS7共7個(gè)基因：

rubS1位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第6308-7786個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1478個(gè)堿基對(duì)，編碼FAD-依賴(lài)的氧化還原酶，492個(gè)氨基酸；

rubS2位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第8303-8917個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為615個(gè)堿基對(duì)，編碼dTDP-葡糖3,5-異構(gòu)酶，204個(gè)氨基酸；

rubS3位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第9053-9985個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為933個(gè)堿基對(duì)，dTDP-葡糖4-酮基還原酶，310個(gè)氨基酸；

rubS4位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第9982-11013個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1032個(gè)堿基對(duì)，編碼dTDP-葡糖4,6脫水酶，343個(gè)氨基酸；

rubS5位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第11030-11899個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為870個(gè)堿基對(duì)，葡糖-1磷酸-胸苷轉(zhuǎn)移酶，289個(gè)氨基酸；

rubS6位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第11921-12757個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為837個(gè)堿基對(duì)，編碼NAD依賴(lài)的異構(gòu)酶/脫水酶，278個(gè)氨基酸；

rubS7位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第12868-14022個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1155個(gè)堿基對(duì)，編碼糖苷轉(zhuǎn)移酶，384個(gè)氨基酸；

(3)負(fù)責(zé)羅博盧酮調(diào)控子蛋白的基因，即rubR1、rubR2共2個(gè)基因：

rubR1位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第14232-15269個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1038個(gè)堿基對(duì)，編碼SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，345個(gè)氨基酸；

rubR2位于基因簇核苷酸序列第15329-15676個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為348個(gè)堿基對(duì)，編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，115個(gè)氨基酸；

(4)其它功能尚未明確的蛋白，rubN共1個(gè)基因：

rubN位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第7783-8190個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為408個(gè)堿基對(duì)，編碼未知功能蛋白，135個(gè)氨基酸。

包含有所述的一種托酚酮類(lèi)天然產(chǎn)物羅博盧酮的生物合成基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1的第6308～28758位的堿基序列，或者包含有以權(quán)利要求2所述的鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535中提取的DNA序列的重組菌株S.albus/9B10。

包含有所述的一種托酚酮類(lèi)天然產(chǎn)物羅博盧酮的生物合成基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1的第6308～28758位的堿基序列，或者包含有以所述的鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535中提取的DNA序列的表達(dá)載體。

如下結(jié)構(gòu)式所示的羅博盧酮及其類(lèi)似物1-4，

所述的羅博盧酮的生物合成基因簇在制備羅博盧酮及其類(lèi)似物中的應(yīng)用。

制備所述的羅博盧酮化合物1-4的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列整合到鏈霉菌S.albus染色體中異源表達(dá)產(chǎn)生化合物1，2，3，4，

如所述的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)羅博盧酮生物合成基因簇測(cè)序以及序列生物信息學(xué)分析：

先對(duì)羅博盧酮產(chǎn)生菌鏈霉菌鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535進(jìn)行大量基因組DNA提取，然后對(duì)權(quán)利要求1所述的包含有羅博盧酮生物合成基因簇序列為SEQ ID NO.1的科斯質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到插入片段大約37Kb的基因組序列包含SEQ ID NO.1的第6308～28758位的堿基序列，通過(guò)生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，所測(cè)序科斯質(zhì)粒包含了整個(gè)羅博盧酮生物合成基因簇，該基因簇包含有24個(gè)開(kāi)放閱讀框，包括負(fù)責(zé)羅博盧酮的酚酮七元環(huán)骨架合成的基因，即rubA、rubB、rubC、rubE1、rubE2、rubE3、rubE4、rubE5、rubE6、rubE7、rubE8、rubE9共12個(gè)基因，負(fù)責(zé)羅博盧酮的糖基合成的基因，即rubS1、rubS2、rubS3、rubS4、rubS5、rubS6、rubS7共7個(gè)基因；負(fù)責(zé)羅博盧酮調(diào)控子蛋白的基因，即rubR1、rubR2共2個(gè)基因；還有一個(gè)未知功能的基因rubN，利用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的方法，分析這24個(gè)開(kāi)放閱讀框的基因信息，并找到與其相類(lèi)似的基因序列，從而推測(cè)各開(kāi)放閱讀框的生物功能；

(2)包含整個(gè)羅博盧酮生物合成基因簇的科斯質(zhì)粒p9B10的異源表達(dá)：

將包含有完整的羅博盧酮生物合成基因簇序列為SEQ ID NO.1的科斯質(zhì)粒p9B10與異源宿主鏈霉菌S.albus進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)得到了重組菌株S.albus 9B10，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，表達(dá)出化合物1,2,3,4。

一種托酚酮類(lèi)天然產(chǎn)物羅博盧酮的生物合成基因簇或鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535，包括用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物獲得重組菌株S.albus 9B10的步驟的方法制備。

藥物組合物，其中含有化合物1-4或其藥用鹽作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。

所述的化合物羅博盧酮及其類(lèi)似物在制備預(yù)防或治療心肌細(xì)胞損傷疾病的藥物中、抗氧化劑中、心肌細(xì)胞損傷保護(hù)劑中、抗自由基劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(于2015年10月23日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。來(lái)源于，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供的生物材料：KIB-H033)。

附圖說(shuō)明：

圖1是羅博盧酮A(rubrolone A，2)和羅博盧酮B(rubrolone B，1)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2是Streptomyces sp.KIB-H033中羅博盧酮生物合成基因簇。

圖3是包含有羅博盧酮生物合成基因簇的p9B10整合到異源宿主鏈霉菌S.albus得到的重組菌株S.albus 9B10在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析圖：I野生型S.albus；II重組菌株S.albus 9B10；1，2，3，4表示相應(yīng)的化合物。

圖4A-圖4E是本發(fā)明新化合物1的核磁共振譜的結(jié)果圖，依次為H譜，C譜，COSY譜，HSQC譜和HMBC譜。

圖5A-圖5E是新化合物3的核磁共振譜的結(jié)果，依次為H譜，C譜，COSY譜，HSQC譜和HMBC譜。

具體實(shí)施方式：

以下結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1.羅博盧酮生物合成基因簇測(cè)序以及序列生物信息學(xué)分析：

通過(guò)對(duì)包含有羅博盧酮生物合成基因簇序列為SEQ ID NO.1的科斯質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到插入片段大約37Kb的基因組序列SEQ ID NO.1的第6308～28758位的堿基序列，通過(guò)生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，所測(cè)序科斯質(zhì)粒包含了整個(gè)羅博盧酮生物合成基因簇，該基因簇全長(zhǎng)大約22Kb，分析該基因簇包含有24個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)，包括負(fù)責(zé)羅博盧酮的酚酮七元環(huán)骨架合成的基因，即rubA、rubB、rubC、rubE1、rubE2、rubE3、rubE4、rubE5、rubE6、rubE7、rubE8、rubE9共12個(gè)基因，負(fù)責(zé)羅博盧酮的糖基合成的基因，即rubS1、rubS2、rubS3、rubS4、rubS5、rubS6、rubS7共7個(gè)基因；負(fù)責(zé)羅博盧酮調(diào)控子蛋白的基因，即rubR1、rubR2共2個(gè)基因；還有一個(gè)未知功能的基因rubN。利用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的方法，分析這24個(gè)開(kāi)放閱讀框的基因信息，并找到與其相類(lèi)似的基因序列，從而推測(cè)各開(kāi)放閱讀框的生物功能。具體的羅博盧酮生物合成基因簇的分析如圖2所示。

(2)包含整個(gè)羅博盧酮生物合成基因簇的科斯質(zhì)粒p9B10的異源表達(dá)：

將包含有完整的羅博盧酮生物合成基因簇序列為SEQ ID NO.1的科斯質(zhì)粒p9B10與異源宿主鏈霉菌S.albus進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)得到了重組菌株S.albus 9B10，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，表達(dá)出化合物1,2,3,4。

以下進(jìn)一步提供具體實(shí)施例，這些實(shí)施實(shí)例有助于理解本發(fā)明，僅用作說(shuō)明而不限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。

實(shí)施例2

鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(于2015年10月23日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院昆明植物所編號(hào)為KIB-H033)。

Streptomyces sp.CGMCC No.11535作為典型的鏈霉菌，其基內(nèi)菌絲分枝，氣生菌絲稍粗，部分氣生菌絲分化為螺旋形的孢子絲。同時(shí)在培養(yǎng)基里能產(chǎn)生紅顏色的化合物。其DNA的G+C含量為71％左右，具有典型的鏈霉菌屬的特征。

羅博盧酮產(chǎn)生菌鏈霉菌鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(KIB-H033)大量基因組DNA提?。?/p>

菌絲培養(yǎng)：用TSB液體培養(yǎng)基50ml于28℃250rpm搖床培養(yǎng)48h。溶菌：于50ml離心管3750rpm離心，15min收集菌絲，用SET buffer(葡萄糖0.3mol/L(10.3％)Tris-HCl 25mmol/L EDTA 25mmol/L pH8.0)洗、離心收集菌體。加5ml SET緩沖液，使菌體懸浮分散，加入溶菌酶至1mg/ml，37℃水浴保溫約45min,每15min顛倒混勻一次。去蛋白：加入140μl蛋白酶K，顛倒混勻，再加600μl 10％的SDS，混勻，在50℃溫浴2-5h,每30min顛倒一次。蛋白酶K終濃度為0.5mg/ml,SDS為1％。加2ml 5M NaCl,混勻，再加5ml氯仿，于室溫混勻30min以上。然后4500g離心30min。沉淀DNA：上清倒入小燒杯，加0.6倍體積異丙醇，顛倒混勻，用滅菌玻棒將總DNA攪出，用70％乙醇清洗。室溫稍干燥后立即溶于1-2ml TE中。

實(shí)施例3

羅博盧酮產(chǎn)生菌鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(KIB-H033)基因組文庫(kù)的建立：

首先通過(guò)一系列的稀釋實(shí)驗(yàn)確定了限制性核酸內(nèi)切酶Mbo I的用量，在50μL體系中，含有5μL的鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535基因組DNA，5μL的10×反應(yīng)緩沖液和7.5μL稀釋度為10^-2的Sau3A I，其終止反應(yīng)為2.5μL 15mM EDTA和合適的上樣緩沖液。在此基礎(chǔ)上通過(guò)大量部分酶切得到略大于40kb的基因組DNA片段，用去磷酸化酶進(jìn)行去磷酸化處理。

用于構(gòu)建文庫(kù)的載體pJTU2554質(zhì)粒先用限制性核酸內(nèi)切酶Hpa I從兩個(gè)cos序列中間切開(kāi)，然后進(jìn)行去磷酸化處理，再?gòu)亩嗫寺∥稽c(diǎn)處用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI切開(kāi)，獲得兩個(gè)臂。處理后的載體與之前制備的部分酶切的約40kb的基因組DNA片段連接過(guò)夜，連接體系為10μL，含有2.0μg制備的基因組DNA片段和0.50μg處理后的pJTU2554質(zhì)粒，2μL的10×Buffer，1U的T4連接酶。連接產(chǎn)物70℃處理15分鐘，使連接酶失活。從-80℃冰箱中取出一管包裝混合物(50μL)置于冰上，將包裝混合物在指間迅速融化，小心吸取一半包裝混合物(25μL)至一個(gè)新的離心管中，加入10μL熱處理后的連接產(chǎn)物，其余包裝混合物于-80℃保存。小心混勻，30℃溫浴90分鐘，加入另外一半包裝混合物(25μL)，30℃溫浴繼續(xù)90分鐘。加入500μL噬菌體稀釋緩沖液(100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl₂,10mmol/L pH8.3Tris-HCl)，再加入25μL氯仿，輕輕混勻，得包裝液，于4℃保存。

將凍存于-80℃的菌株E.coli XL1-blue涂布在LB培養(yǎng)基上復(fù)蘇。包裝反應(yīng)前一天，挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)基中(添加0.2％麥芽糖和10mM MgSO₄)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，包裝反應(yīng) 當(dāng)天，取5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入到50mL新鮮的LB培養(yǎng)基中(添加0.2％麥芽糖和10mM MgSO₄)，37℃，200rpm振蕩至培養(yǎng)物OD600達(dá)到0.8-1時(shí)，4℃保存?zhèn)溆?，得宿主菌液。?00μL如上處理的宿主菌液和100μL適度稀釋的包裝液輕輕混勻，于37℃溫浴15分鐘，然后涂布于含有100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將長(zhǎng)出來(lái)的單個(gè)克隆子，用無(wú)菌牙簽點(diǎn)種于23塊含以上上述抗生素的LB培養(yǎng)基的96孔板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入終濃度為20％的甘油，混合均勻，置于-80℃保存。

實(shí)施例4

從羅博盧酮產(chǎn)生菌(鏈霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535)基因組文庫(kù)中篩選含有羅博盧酮生物合成基因的陽(yáng)性克隆子：

通過(guò)分析羅博盧酮的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，用dTDP-葡糖4,6脫水酶基因做篩選引物(表1)進(jìn)行PCR來(lái)篩選，從2000個(gè)克隆子中得到4個(gè)陽(yáng)性克隆子，其中得到一個(gè)包含完整羅博盧酮生物合成基因簇的陽(yáng)性克隆p9B10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，羅博盧酮的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第6308～28758位的堿基序列所示。

表1：文庫(kù)篩選引物

實(shí)施例5

將包含有羅博盧酮的生物合成基因簇的科斯質(zhì)粒p9B10在異源宿主鏈霉菌S.albus中進(jìn)行表達(dá)：

將含有p9B10的轉(zhuǎn)化菌株E.coli ET12567/pUZ8002/p9B10接種于4mL的LB+100μg/mL Amp+50μg/mL Apr+25μg/mL Cm+50μg/mL Kan液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14h后，取100μL菌液轉(zhuǎn)接于10mL相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD為0.4，離心收集菌體，用不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基洗滌2次，洗去抗生素，離心濃縮菌體，備用。與此同時(shí),滅菌水收集S.albus孢子，經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾后，4000rpm離心15min，棄上清，加入適量LB培養(yǎng)基懸浮孢子，置于50℃水浴中熱激10分鐘。將轉(zhuǎn)化菌株E.coli ET12567/pUZ8002/p9B10與S.albus孢子按照體積比1:1比例混合，涂布于MS+MgCl₂(終濃度為20mmol/L)固體平板上(MS：大豆粉20g/L，甘露醇20g/L，瓊脂粉20g/L，pH7.0～7.2，使用去離子水配制，和定 容)。16～20h后，用1mL H₂O+30μL100μg/mL Nal+20μL50μg/mL Apr進(jìn)行藥物覆蓋。大約在30℃培養(yǎng)3～4天后即可看到接合轉(zhuǎn)移子，該接合轉(zhuǎn)移子即為轉(zhuǎn)入p9B10的鏈霉菌S.albus，命名為重組菌株S.albus 9B10。

接合轉(zhuǎn)移子—重組菌株S.albus 9B10在MS+50μg/mL Apr平板上培養(yǎng)5～7d后，挑取適量菌絲體分別接種入50mL TSB種子培養(yǎng)基(胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L,氯化鈉5g/L,磷酸氫二鉀2.5g/L,葡萄糖2.5g/L，pH7.0～7.2)，在溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為250rpm的搖床上搖瓶2天后分別取3ml菌液轉(zhuǎn)接到50ml PTM發(fā)酵培養(yǎng)基(糊精40g/L，乳糖40g/L，酵母提取粉5g/L，MOPS sodium salt 20g/L；pH7.0～7.2)中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4天，得到發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物離心后，上清過(guò)濾取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC分析條件為：使用YMC-Triart C18(250×4.6mm,5μ)分析柱；A相組成為H₂O，B相組成為甲醇。流速為1ml/min,HPLC分析的檢測(cè)波長(zhǎng)為304nm。HPLC走樣程序：0-20min,10％-100％B相；20-24min,100％B相；24-28min,10％B相。結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，野生型的S.albus不能產(chǎn)生化合物1,2,3,4，而重組菌株S.albus 9B10能夠產(chǎn)生化合物1,2,3,4。其具體結(jié)構(gòu)如圖1所示，新的化合物1、3的核磁共振譜如圖4A-圖4E和圖5A-圖5E所示。

本發(fā)明SEQ ID NO.1(序列表)所示序列的第6308～28758位的堿基序列的互補(bǔ)序列可根據(jù)DNA堿基互補(bǔ)原則隨時(shí)得到。且第6308～28758位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用合適的限制性?xún)?nèi)切酶酶切相應(yīng)的DNA或DNA體外合成技術(shù)或使用其他合適的技術(shù)得到。本發(fā)明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第6308～28758位中DNA序列的重組DNA載體的途徑。

本發(fā)明還提供了創(chuàng)制羅博盧酮生物合成基因被阻斷或異源表達(dá)等其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含SEQ ID NO.1所示序列的第6308～28758位中DNA片段。

本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探針?lè)ɑ騍outhern雜交等技術(shù)，從其他生物體重篩選獲得羅博盧酮的生物合成基因簇同源基因。

本發(fā)明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用于Streptomyces sp.CGMCC No.11535基因組文庫(kù)中定位更多的文庫(kù)質(zhì)粒。這些文庫(kù)質(zhì)粒至少包括本發(fā)明中的部分序列，也包含Streptomyces sp.CGMCC No.11535基因組中鄰近區(qū)域未克隆DNA。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被體內(nèi)外突變等修飾，包括插入、置換、缺失、易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、位點(diǎn)特異性突變、不同序列重組、定向進(jìn)化等。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通過(guò)合適表達(dá)系統(tǒng)在外源宿主中表達(dá)生產(chǎn)相應(yīng)酶或者提高生物活性化合物產(chǎn)量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈霉菌、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母及動(dòng)植物等。

本發(fā)明提供的氨基酸序列可以用于分離所需蛋白并可用于抗體制備。

包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或者部分序列的多肽，可能在去除或者替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性，或提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特征或其他致力于得到的性質(zhì)。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達(dá)及揭示它們?cè)谒拗鞔x中的功能。

包含本發(fā)明所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建重組載體，以獲得新型生物合成途徑，也可以通過(guò)插入、置換、缺失或失活，進(jìn)而獲得其他基于生物合成途徑的新結(jié)構(gòu)化合物。

總之，本發(fā)明所提供的包含格羅博盧酮生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，可以幫助人們理解羅博盧酮天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制，為進(jìn)一步遺傳改造提供了材料和知識(shí)。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來(lái)尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。

實(shí)施例6：

活性測(cè)定：

H₂O₂誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：

將在DMED(Dulbeco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基里生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞以10⁵/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)12h后，分組加入單體化合物到不同的孔中，濃度為10μM，同時(shí)加入卡維地洛為對(duì)照。加入化合物24h后再將細(xì)胞暴露在600μM的H₂O₂中24h.酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的吸光度值。每孔OD值減去空白孔OD值為測(cè)試孔OD值?；罴?xì)胞與OD值成正比。每個(gè)化合物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。

化合物1-4具有良好的對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，見(jiàn)表2。

表2：化合物1-4對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。a:獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)*p<0.05**p<0.01b:陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)施例7：

上述實(shí)施例所得化合物1-4，加入4％的硫酸乙醇溶液，PH＝4，過(guò)濾，干燥，制成硫酸鹽化合物1-4。

實(shí)施例8：

上述實(shí)施例所得化合物1-4，加入4％的鹽酸溶液，PH＝4，過(guò)濾，干燥，制成鹽酸鹽化合物1-4。

實(shí)施例9：

上述實(shí)施例所得化合物1-4，加入4％的酒石酸溶液，PH＝4，過(guò)濾，干燥，制成酒石酸鹽化合物1-2。

實(shí)施例10：

上述實(shí)施例所得化合物1-4，加入4％的檸檬酸溶液，PH＝4，過(guò)濾，干燥，制成檸檬酸鹽化合物1-2。

實(shí)施例11：

片劑：將上述實(shí)施例所得化合物1-4或所得的鹽10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg、乳糖和淀粉混和，用水均勻濕潤(rùn)、把濕潤(rùn)后的混合物過(guò)篩并干燥，再過(guò)篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實(shí)施例12：

安瓿劑：將上述實(shí)施例所得化合物1-4或所得的鹽2mg，氯化鈉10mg，溶解于適量的注射用水中，過(guò)濾所得溶液，在無(wú)菌條件下裝入安瓿瓶中。

實(shí)施例13：

注射用凍干劑：上述實(shí)施例所得化合物1-4或所得的鹽10mg，碳酸氫鈉2mg，甘露醇252mg。

制備方法：將碳酸氫鈉、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除熱原，過(guò)濾除去活性碳，在濾液中加入化合物或其鹽，超聲處理使溶解，用1N鹽酸調(diào)節(jié)PH為5.0-7.0，微孔濾膜濾過(guò)，加注射用水，分裝，冷凍干燥，上塞，軋蓋，即得。

實(shí)施例14：

膠囊劑：上述實(shí)施例所得化合物1-4或所得的鹽10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg；制備方法：將化合物或其鹽與助溶劑混和，過(guò)篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個(gè)膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。