本發(fā)明涉及生物可降解材料領(lǐng)域，更具體地說，涉及具有抗菌效應(yīng)的聚羥基脂肪酸酯生物塑料。

背景技術(shù)：

隨著石油資源的不斷消耗和石化產(chǎn)品尤其是不可降解的傳統(tǒng)塑料所造成的白色污染日益嚴(yán)重，可天然降解的綠色生物塑料正在受到越來越多的關(guān)注^[1]。不同于生產(chǎn)過程仍需化工縮聚反應(yīng)的聚乳酸(polylacticacid，pla)，聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，phas)作為一種新型的可降解生物塑料，可以通過可再生的生物質(zhì)原料進(jìn)行全程的發(fā)酵生產(chǎn)，其環(huán)境污染指數(shù)低，更為環(huán)保^[2,3]。更為重要的是，pha種類繁多(僅其單體就超過150種)，化學(xué)性質(zhì)和材料性能差異極大，在不同的環(huán)境中均表現(xiàn)出很高的生物可降解性，其潛在的應(yīng)用前景因此更為廣泛^[4]。特別是在醫(yī)療和食品領(lǐng)域，聚(3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯)[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate),phbhhx]和聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)[poly(3-hydroxybutyricacid-co-4-hydroxybutyricacid),p(3hb-co-4hb)]這兩種pha因其極強(qiáng)的生物相容性和人體可植入性展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力，可用做手術(shù)縫合線、骨釘、人造骨骼、食品包裝等，其相關(guān)研究亟需跟進(jìn)展開^[5,6]。

乳酸鏈球菌素(nisin)是由乳酸乳球菌(lactococcuslactissubsp.lactis)產(chǎn)生的一種陽離子多肽，可以有效的抑制多種引起食品腐敗和醫(yī)學(xué)感染的革蘭氏陽性菌^[7]，對(duì)沙門氏菌(salmonella)等部分革蘭氏陰性菌同樣有抑制效果^[8]。nisin可被人體腸道分泌的α-胰凝乳蛋白酶有效降解，因此對(duì)人體安全無毒，是目前唯一大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的高效天然防腐劑^[7]，被廣泛應(yīng)用于歐盟、中國、美國等多個(gè)國家和地區(qū)的食品行業(yè)中^[9,10]。特別值得注意的是，除了作為食品防腐劑之外nisin亦可被應(yīng)用到多種材料中以達(dá)到抗菌效果。x.qi等^[11]利用peg1000將nisin穩(wěn)固結(jié)合到碳納米管上，從而使碳納米管具備了一定的抗菌活性。t.jin等^[12]則將nisin整合入聚乳酸(pla)以生產(chǎn)具有抗菌效應(yīng)的食品包裝袋。進(jìn)一步研究表明，在帶有nisin-pla涂層的牛奶灌裝瓶中，李斯特菌(listeriamonocytogenes)的生長(zhǎng)被顯著抑制，并且抑制效果在4℃保存條件下可維持70天^[13]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面提供了具有抗菌效應(yīng)的聚羥基脂肪酸酯，其中包含作為抗菌劑的乳酸鏈球菌素。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸鏈球菌素的濃度為不低于25μg/g；例如，不低于100μg/g。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述聚羥基脂肪酸酯可以選自由phbhhx、phb、phbv和p3hb4hb構(gòu)成的組。優(yōu)選地，所述聚羥基脂肪酸酯為phbhhx。

所述抗菌聚羥基脂肪酸酯可以被制成薄膜。

本發(fā)明還提供了所述聚羥基脂肪酸酯在制備具有抗菌效應(yīng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。例如，所述聚羥基脂肪酸酯可以被制成食品包裝、食品容器、廚具、醫(yī)療器械、家裝建材、家用電器或配件、健康護(hù)理產(chǎn)品以及可穿戴設(shè)備等。

本發(fā)明還提供了抑制微生物生長(zhǎng)的方法，包括將所述聚羥基脂肪酸酯與所述微生物進(jìn)行接觸。例如，所述微生物可以為食品中的微生物。

附圖說明

圖1顯示了瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量的含有乳酸鏈球菌素的phbhhx膜片的抑菌效應(yīng)。(a)含有不同濃度nisin的phbhhx薄膜抑制micrococcusluteus(ncib8166)的生長(zhǎng)，其中nisin濃度分別為0,25,100,400,1600和6400μg/g。(b)含有不同濃度nisin的phbhhx薄膜的抑制效應(yīng)(0,0.25和2.5μg/g)。薄膜直徑為6mm。

圖2顯示了phbhhx膜片抗菌效應(yīng)對(duì)nisin含量的依賴關(guān)系。nisin濃度分別為0.25,2.5,25,100,400,1600和6400μg/g。誤差棒(errorbar)表示6個(gè)測(cè)試平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation)。其中，縱坐標(biāo)為抑制區(qū)直徑(cm)。

圖3顯示了激光共聚焦顯微鏡層掃觀察到的nisin顆粒在phbhhx膜片內(nèi)部的物理分布。(a)25μg/gnisin；(b)100μg/gnisin.

圖4顯示了液體培養(yǎng)條件下phbhhx-nisin膜片的抗菌活性隨時(shí)間的變化。誤差棒表示三個(gè)測(cè)試平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為活細(xì)胞(cfu/ml)，control表示對(duì)照。

圖5顯示了激光共聚焦顯微鏡下nacl顆粒在phbhhx薄膜內(nèi)的物理分布。(a)nacl/phbhhx的濃度為0.975mg/g，深色顆粒為nacl顆粒,大小范圍是10-40μm。(b)不添加鹽的phbhhx空白膜片。

圖6顯示了瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量nisin與phb，phbv，p3hb4hb分別混合的薄膜抑菌效應(yīng)。a代表nisin與phb混合的抑菌效果，所用的nisin濃度為100，25，0.25μg/g(每克pha材料中含有nisin的量)；b代表代表nisin與phbv混合的抑菌效果，所用的nisin濃度為100，25，0.25μg/g；c代表nisin與p3hb4hb混合的抑菌效果，所用的nisin濃度為100，25，0.25μg/g。

具體實(shí)施方式

本文所用的術(shù)語“聚羥基脂肪酸酯”(polyhydroxyalkanoates,簡(jiǎn)稱pha或phas)，是一系列廣泛存在于許多微生物細(xì)胞中的天然高分子，種類繁多。pha具 有良好的生物相容性和生物可降解性，同時(shí)在加工性能和機(jī)械性能方面更具優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯，其結(jié)構(gòu)如式(i)所示。

其中，中括號(hào)內(nèi)為結(jié)構(gòu)單元，各結(jié)構(gòu)單元可以相同或不同；n表示結(jié)構(gòu)單元的總數(shù)；各結(jié)構(gòu)單元的m獨(dú)立地選自1～3的整數(shù)；各結(jié)構(gòu)單元的r1獨(dú)立地選自由h、c1-c9的烷基構(gòu)成的組。

本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯既包括聚羥基丁酸酯(poly(hydroxybutyrate)，簡(jiǎn)稱phb)，聚羥基戊酸酯(poly(hydroxyvalerate)，簡(jiǎn)稱phv)，聚羥基辛酸酯(poly(hydroxyoctanoate)，簡(jiǎn)稱pho)等pha類均聚物，也包括羥基丁酸戊酸共聚物(poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，簡(jiǎn)稱phbv)，3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚物(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，簡(jiǎn)稱phbhhx)，3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚物(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)，簡(jiǎn)稱p3hb4hb)等pha共聚物以及幾種pha形成的混合物。

本發(fā)明所采用的聚羥基脂肪酸酯(pha)的重均分子量沒有特別限制，優(yōu)選范圍在50,000-2,000,000之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)聚合物的種類、所需要的力學(xué)性能等因素確定合適的分子量。

本發(fā)明所使用的具體的聚羥基脂肪酸酯材料包括phbhhx、phb、phbv和p3hb4hb等。

本文所用的術(shù)語“烷基”是指帶有給定數(shù)量的碳原子的支鏈和直鏈的飽和脂族烴基。例如，“c1-c9的烷基”定義為直鏈或支鏈的帶有1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)碳的飽和脂族烴基基團(tuán)。例如，“c1-c9的烷基”特別包括甲基、乙基、正-丙基、異-丙基、正-丁基、異-丁基、叔-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。

本文所用的術(shù)語“有效量”指的是足以引起技術(shù)人員所尋找的抗菌效果的nisin的量。本發(fā)明的生物塑料中nisin的有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)材料的應(yīng)用場(chǎng)合、對(duì)抗菌效果的要求等因素而確定。例如，在pha薄膜材料中，nisin的含量可以為不低于10、15或20μg/g。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，nisin在薄膜材料中的含量可以為不低于25μg/g。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為了獲得更強(qiáng)或者更持久的抗菌效果(例如在醫(yī)療器械領(lǐng)域)，nisin含量可以更高。 例如，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，nisin在薄膜材料中的含量可以為不低于100μg/g。

本文所用的術(shù)語“抗菌效應(yīng)”是指抑制微生物生長(zhǎng)的能力。此處所述的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌等。術(shù)語“抗菌效應(yīng)”并不局限于對(duì)細(xì)菌的抑制作用。在食品包裝、醫(yī)療器械等許多領(lǐng)域，廣泛存在對(duì)抗菌效應(yīng)的需要。技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法和標(biāo)準(zhǔn)確定材料的抗菌效應(yīng)，例如，瓊脂擴(kuò)散法或液體培養(yǎng)法。例如，“具有抗菌效應(yīng)”可以指該材料在瓊脂擴(kuò)散法中表現(xiàn)出明顯的抑菌圈，或者在液體培養(yǎng)法中表現(xiàn)出超過90％(例如超過95％，特別是超過99％)的微生物抑制率。

本文所用的術(shù)語“乳酸鏈球菌素”和“nisin”可以互換使用，是本領(lǐng)域公知的大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的高效天然防腐劑。

本發(fā)明的抗菌pha可以廣泛應(yīng)用于食品包裝、食品容器、廚具、醫(yī)療器械、家裝建材、健康護(hù)理、可穿戴設(shè)備、家用電器等領(lǐng)域。由于與人體或者食品存在直接或間接的接觸，在這些領(lǐng)域存在對(duì)抗菌材料的迫切需要。例如，馬桶圈、馬桶沖水按鈕、把手、食品包裝袋、飲水機(jī)接口、電冰箱內(nèi)置塑料等產(chǎn)品，由于頻繁與人體或食品接觸，如果它們具有抗菌效應(yīng)將是令人期待的。

為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將給出本發(fā)明的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是出于解釋和說明的目的，不應(yīng)該被理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

研究概述

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,phas)作為一類新型的生物高分子材料，因其多樣的材料性質(zhì)與高度的生物可降解性日益受到關(guān)注。本發(fā)明使用乳酸鏈球菌素(nisin)，一種被公認(rèn)為安全的天然食品防腐劑，制備了具有高效、持久抗菌效應(yīng)的pha塑料。首先采用溶劑澆鑄的方法將nisin整合到正3-羥基丁酸-3羥基己酸共聚酯(phbhhx),一種具備高度生物相容性的pha中，從而獲得了具有抗菌效應(yīng)的phbhhx薄膜。激光共聚焦顯微鏡觀察表明nisin在phbhhx中呈顆粒狀均勻分布。隨后以條件致病菌藤黃微球菌(micrococcusluteus)為測(cè)試菌株，通過瓊脂擴(kuò)散法，測(cè)定nisin含量與phbhhx薄膜抗菌效應(yīng)的定量關(guān)系；在液體培養(yǎng)條件下測(cè)量phbhhx薄膜的nisin釋放效果與抗菌效應(yīng)。結(jié)果表明nisin可從phbhhx薄膜順利釋放且nisin的含量高于25μg/g時(shí)即表現(xiàn)出顯著的抑菌效果且可長(zhǎng)時(shí)間維持。該研究為工業(yè)化生產(chǎn)具有抗菌效應(yīng)的pha奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)，拓展了pha在醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

實(shí)施例1

在本試驗(yàn)中，我們首先利用溶劑澆鑄的方法將nisin整合入pha(phbhhx)，從而獲得了具有抗菌效應(yīng)的phbhhx薄膜；激光共聚焦顯微鏡的觀察表明nisin在phbhhx薄膜內(nèi)部呈顆粒狀均勻分布^[14]；隨后的功能實(shí)驗(yàn)表明，僅僅25μg/g的nisin濃度就足以使得phbhhx薄膜對(duì)于典型條件致病菌—藤黃微球菌(micrococcusluteusncib8166)的生長(zhǎng)起到顯著抑制，且抑制效果可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)。本試驗(yàn)成功使用乳酸鏈球菌素制備了具有高效、持久抗菌效應(yīng)的pha塑料，并且通過詳細(xì)的功能表征與顯微鏡觀察，為pha生物塑料在醫(yī)學(xué)與食品領(lǐng)域的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1、材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株與試劑

用于抗菌效應(yīng)檢測(cè)的菌株為藤黃微球菌(micrococcusluteusncib8166)。培養(yǎng)基為si培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為30℃，靜置或200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)。phbhhx塑料粉料由北京藍(lán)晶生物科技有限公司提供。乳酸鏈球菌素(nisin)樣品由中科院微生物研究所提供，純度為2.5％，剩余雜質(zhì)為無機(jī)鹽和蛋白粉。其余所需試劑均購自sigma-aldrich公司。

1.1.2含有nisin的phbhhx塑料薄膜

選取二氯甲烷作為溶劑澆鑄的溶劑；這是因?yàn)槎燃淄榫邆浠瘜W(xué)惰性和高揮發(fā)性且已有工作表明pha在二氯甲烷中可高效溶解^[15]。稱取不同質(zhì)量梯度的nisin，各自加入一份溶解了1gphbhhx粉料的15ml二氯甲烷中；nisin樣品的用量分別是0.01mg，0.1mg，1mg，4mg，16mg，64mg和256mg，換算為nisin純凈物則為0.25μg，2.5μg，25μg，100μg，400μg，1.6mg和6.4mg(后文中nisin濃度與用量皆指純凈物)。用磁棒攪拌直至nisin樣品粉末完全分散到聚合物溶液中，將混勻的溶液澆鑄到9cm的玻璃培養(yǎng)皿中，通風(fēng)櫥內(nèi)靜置24h。待二氯甲烷完全揮發(fā)，phbhhx成膜；塑料膜的厚度約1mm，面積約為63.5cm²，因此nisin在薄膜中的分布濃度為(x*0.394)μg/cm²，x代表含有nisin的混合物樣品的質(zhì)量數(shù)值(以mg單位記)。用6mm直徑的打孔器將塑料膜加工為圓形薄膜，保存在密閉容器中待用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1利用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試phbhhx-nisin薄膜的抑菌效應(yīng)

將藤黃微球菌單克隆菌落接種到5mlsi液體培養(yǎng)基中；30℃，200rmp條件下培養(yǎng)16h，獲得種子液(od600＝1.9)。取500μl種子液加到50mlsi固體培養(yǎng)基中，混勻以制備瓊脂擴(kuò)散法所需的平板，每個(gè)平板含有約25ml的si固體培養(yǎng)基。 將6mm直徑的phbhhx-nisin圓形薄膜平放在si固體培養(yǎng)基表面，每種nisin含量的薄膜有6個(gè)重復(fù)，30℃靜置培養(yǎng)24h；對(duì)照組為不含nisin、等直徑的phbhhx薄膜。用卡尺測(cè)量每個(gè)抑菌圈的大小并記錄。

1.2.2nisin在phbhhx薄膜中的物理分布

將直徑6mm的phbhhx-nisin薄膜固定在載玻片上，nisin的濃度分別為100μg/g和25μg/g。phbhhx-nacl薄膜和不添加任何鹽的phbhhx薄膜分別作為對(duì)照組；phbhhx-nacl薄膜中的nacl濃度是0.975mg/g(與25μg/gnisin含量的膜片所對(duì)應(yīng)的鹽含量相同)。采用leicatcssp2激光共聚焦顯微鏡，層掃觀察nisin的分布情況。nisin在425nm波長(zhǎng)的激發(fā)光(ex)下可發(fā)出475nm波長(zhǎng)(em)的自發(fā)熒光。

1.2.3液體培養(yǎng)條件下測(cè)量phbhhx-nisin的抑菌效應(yīng)

獲得種子液的方法同瓊脂擴(kuò)散法。所用nisin的濃度為100μg/g，25μg/g和2.5μg/g。將種子液稀釋10⁴倍，即每毫升稀釋過的菌液約含10⁵個(gè)菌落形成單位(colony-formingunit,cfu)，加入3片加工好的phbhhx-nisin薄膜到5mlsi液體培養(yǎng)基中，30℃，200rmp培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣，從培養(yǎng)液中取出200μl菌液測(cè)量od600，根據(jù)od600數(shù)值用新鮮si培養(yǎng)基將取出樣品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋后涂板，30℃靜置培養(yǎng)20h后計(jì)算活菌數(shù)目得出統(tǒng)計(jì)結(jié)果。每種nisin含量的薄膜進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，對(duì)照組為不含nisin的phbhhx薄膜和不含nisin的紙片。

2結(jié)果與分析

2.1瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定phbhhx-nisin薄膜的抑菌效應(yīng)

藤黃微球菌是一種廣泛分布于空氣、土壤、水及動(dòng)植物表面的條件致病菌，被用作抑菌素(如nisin)的指示菌株^[16,17]。瓊脂擴(kuò)散法觀測(cè)到含有nisin的phbhhx薄膜對(duì)于藤黃微球菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)。使用紙片和不含nisin的phbhhx薄膜的對(duì)照組并沒有抑菌效應(yīng)(見圖1a和圖1b的0μg/g)，說明抑菌效應(yīng)的來源正是nisin。nisin含量達(dá)到25μg/g以上時(shí)表現(xiàn)出穩(wěn)定大小的抑菌圈(圖1a)；nisin含量在2.5μg/g及以下時(shí)的抑菌效果則不穩(wěn)定(圖1b)；這暗示nisin在phbhhx薄膜內(nèi)部的分布并不均勻，因此nisin濃度越低則抑菌效果平行性越差。隨著nisin濃度的增加，phbhhx薄膜抑菌效果顯著增強(qiáng)，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)的變化趨勢(shì)見圖2。

2.2nisin在phbhhx薄膜中的物理分布

通過leicatcssp2激光共聚焦顯微鏡清晰地觀察到nisin在phbhhx薄膜中分布情況。圖3展示了100μg/g和25μg/g兩種nisin濃度的phbhhx薄膜的顯微結(jié)果。nisin在薄膜內(nèi)部呈顆粒狀分布；圖中的綠色亮點(diǎn)為nisin蛋白質(zhì)顆粒的自發(fā)熒光，直徑約為10-70μm。為了分析深色斑點(diǎn)的來源，我們采用phbhhx-nacl膜片(nacl濃度是0.975mg/g，與實(shí)驗(yàn)組所對(duì)應(yīng)的鹽含量相同)與不添加任何鹽的空白phbhhx膜片分別作為25μg/gphbhhx-nisin膜片的對(duì)照組進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。盡管空白phbhhx膜片(圖5b)中可以觀察到深色斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)的直徑和密度與phbhhx-nacl膜片(圖5a)相比有顯著差別；與此同時(shí)，phbhhx-nacl膜片(圖5a)中深色斑的直徑和密度與實(shí)驗(yàn)組(圖3a)更為相似，說明深色斑點(diǎn)為無機(jī)鹽顆粒。

2.3phbhhx薄膜中nisin的釋放情況

根據(jù)瓊脂擴(kuò)散法的測(cè)量結(jié)果，選取四種nisin濃度(100μg/g，25μg/g，2.5μg/g，0.25μg/g)的phbhhx薄膜做液體培養(yǎng)抑菌實(shí)驗(yàn)。將phbhhx-nisin薄膜加到藤黃微球菌生長(zhǎng)所需的si液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，在特定時(shí)間點(diǎn)取樣后用新鮮si液體培養(yǎng)基將樣品稀釋不同的倍數(shù)后涂板，30℃靜置培養(yǎng)20h，統(tǒng)計(jì)平板上的活菌數(shù)目，結(jié)果如圖4所示。對(duì)照組(加入了不含nisin的phbhhx薄膜的培養(yǎng)基)在培養(yǎng)22h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期(～8.8logcfu/ml)。含有2.5μg/gphbhhx-nisin薄膜的樣品中，菌的密度在早期生長(zhǎng)中急速下降約3個(gè)數(shù)量級(jí)，原因可能是大量菌體被薄膜釋放的nisin殺死；但由于含量不高的nisin被耗盡，少數(shù)幸存的活菌導(dǎo)致8h后菌體密度迅速上升，在22h也達(dá)到了穩(wěn)定期(圖4)。25μg/g與100μg/g的phbhhx-nisin薄膜所在培養(yǎng)液沒有出現(xiàn)藤黃微球菌菌體復(fù)蘇的現(xiàn)象，說明薄膜釋放的nisin可以在細(xì)菌生長(zhǎng)早期就將其完全殺滅(圖4)。這些結(jié)果證明了分布在薄膜中的nisin可以被順利釋放出來且抑菌效應(yīng)能得到長(zhǎng)時(shí)間的維持。

3討論

本研究首次將nisin經(jīng)過溶劑澆鑄的方法嵌入到phbhhx中，使得phbhhx具有抗菌活性，其生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便，極易應(yīng)用于工業(yè)放大。當(dāng)前國內(nèi)外的同類研究將目光集中在pla和pbs系列的生物塑料上，而針對(duì)性能更為多樣化、生物降解性與相容性更高的pha系列的工作則是空白。為了進(jìn)一步說明本文方法對(duì)于pha系列的通用性，我們采用另外三種pha(phb，phbv，p3hb4hb)分別制備了phb-nisin，phbv-nisin與p3hb4hb-nisin共三種抗菌pha材料并進(jìn)行了的瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然不同的材料間表現(xiàn)出一定的差異，但三種含有nisin的pha材料均呈現(xiàn)出靈敏的、顯著的抗菌活性(圖6)。

nisin可以通過共價(jià)和非共價(jià)的方式整合到其他介質(zhì)中。考慮到nisin需要被充分釋放才能最大程度發(fā)揮抑菌活性，因此我們選擇溶劑澆鑄這一非共價(jià)結(jié)合的方法將nisin整合到pha中。本研究中nisin以“不溶顆?！钡男问交煸趐ha中；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明利用此種方法，在5ml液體培養(yǎng)基中僅僅0.33μg的nisin(換算為nisin濃度則為0.07μg/ml)就足以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；這是截止到目前已報(bào)道的抑菌活性最高的抗菌塑料。

驗(yàn)證pha-nisin薄膜在液體培養(yǎng)條件下的抑菌情況時(shí)我們觀察到，25μg/g和100μg/gnisin含量的pha薄膜在藤黃微球菌生長(zhǎng)初期就沒有了生長(zhǎng)跡象。然而，當(dāng)nisin的含量為2.5μg/g時(shí)，在生長(zhǎng)前8個(gè)小時(shí)活菌數(shù)急劇下降后，菌體密度反而出現(xiàn)復(fù)蘇現(xiàn)象。這說明此時(shí)被釋放到液體中的nisin尚不足以殺滅全部的菌體，且后續(xù)釋放乏力。因此，2.5μg/g的nisin含量對(duì)于液體培養(yǎng)條件下的抑菌來說是不夠的。關(guān)于固體與液體之間的抑菌濃度差別，有兩個(gè)潛在的影響因素：一是nisin的擴(kuò)散方式不同，在液體震蕩的條件下nisin比在固體平板上更容易擴(kuò)散稀釋；二是不同的生長(zhǎng)條件導(dǎo)致細(xì)菌的代謝物不同，而后者會(huì)顯著影響nisin的活性^[18]。

nisin是由34個(gè)氨基酸組成的、硫醚鍵形成五個(gè)內(nèi)環(huán)的短肽，常為二聚體或四聚體。nisin作為食品防腐劑的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明其在偏酸性條件下保存時(shí)間長(zhǎng)，高壓處理后活性保持良好，在合適的條件下甚至可以忍受一定程度的高溫。前人報(bào)道，在ph5-7時(shí)，經(jīng)歷巴氏消毒后nisin可保持至少80％的活性^[7]。在偏酸性條件下，常規(guī)高壓蒸汽滅菌后nisin的活性仍能保持50％以上；一些nisin突變體甚至可以忍受100攝氏度及以上的高溫處理10分鐘而保持80％抑菌活性^[19]。這些物理?xiàng)l件符合工業(yè)實(shí)踐中pha的加工窗口，因此抗菌pha塑料的工業(yè)生產(chǎn)過程nisin的降解失活很可能不是難題。

本研究為工業(yè)化生產(chǎn)具有抗菌效應(yīng)的生物可降解塑料pha提供了重要參考。特別值得注意的是，這里使用nisin這一被公認(rèn)為安全食品防腐劑的天然產(chǎn)物作為抗菌成分，可以有效遏制食品腐敗菌和條件致病菌的生長(zhǎng)。因此抗菌pha塑料在醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域可預(yù)見的應(yīng)用范圍相當(dāng)可觀，包括食品包裝袋、飲水機(jī)接口、電冰箱內(nèi)置塑料等等。

references

[1]yoongkitleong,paulokeshow,chienweiooietal.currenttrendsinpolyhydroxyalkanoates(phas)biosynthesis:insightsfromtherecombinantescherichiacoli.journalofbiotechnology,2014,180:52-65.

[2]a.nath,m.dixit,a.bandiyaetal.enhancedphbproductionandscaleupstudiesusingcheesewheyinfedbatchcultureofmethylobacteriumsp.zp24.bioresourcetechnology,2008,99:5749-5755.

[3]liz,weix,cheng.microbialcellfactoriesforproductionofpolyhydroxyalkanoates.chinesejournalofbiotechnology,2010,26:1426-1435.

[4]guoqiangchen,wuq.theapplicationofpolyhydroxyalkanoatesastissueengineeringmaterials.biomaterials,2005,26:6565-6578.

[5]bugnicourte,cinellip,lazzeriaetal.polyhydroxyalkanoate(pha):reviewofsynthesis,characteristics,processingandpotentialapplicationsinpackaging.expresspolymerletters,2014,8.

[6]l.r.castilho,d.a.mitchell,freiredm.productionofpolyhydroxyalkanoates(phas)fromwastematerialsandby-productsbysubmergedandsolid-statefermentation.bioresourcetechnology,2009,100:5996-6009.

[7]j.delves-broughton,p.blackburn,r.j.evansetal.applicationsofthebacteriocin,nisin.antonievanleeuwenhoek,1996,69:193-202.

[8]kellya.stevens,brianw.sheldon,n.arleneklapesetal.nisintreatmentforinactivationofsalmonellaspeciesandothergram-negativebacteria.appliedandenvironmentalmicrobiology,1991,57:3613-3615.

[9]cindyvankraaij,willemm.devos,rolandj.siezenetal.lantibiotics:biosynthesis,modeofactionandapplications.natureproductsreport,1999,16:575-587.

[10]deoliveiraaa,coutoh,barbosaaatetal.stability,antimicrobialactivity,andeffectofnisinonthephysico-chemicalpropertiesoffruitjuices.internationaljournaloffoodmicrobiology,2015,211:38-43.

[11]xiaobaoqi,gunawanpoernomo,keanwangetal.covalentimmobilizationofnisinonmulti-walledcarbonnanotubes:superiorantimicrobialandanti-biofilmproperties.nanoscale,2011,3:1874-1880.

[12]jint,hz.biodegradablepolylacticacidpolymerwithnisinforuseinantimicrobialfoodpackaging.journaloffoodscience,2008,73:m127-134.

[13]jint.inactivationoflisteriamonocytogenesinskimmilkandliquideggwhitebyantimicrobialbottlecoatingwithpolylacticacidandnisin.journaloffoodscience,2010,75:m83-88.

[14]jis,luj,liuzetal.dynamicencapsulationofhydrophilicnisininhydrophobicpoly(lacticacid)particleswithcontrolledmorphologybyasingleemulsionprocess.journalofcolloidandinterfacescience,2014,423:85-93.

[15]nicolasjacquel,chi-weilo,ho-shingwuetal.solubilityofpolyhydroxyalkanoatesbyexperimentandthermodynamiccorrelations.aichejournal,2007,53:2704-2714.

[16]delafuente-salcidonm,castaneda-ramirezjc,garcia-almendarezbeetal.isolationandcharacterizationofbacteriocinogeniclacticbacteriafromm-tubaand tepache,twotraditionalfermentedbeveragesinmexico.foodscience&nutrition,2015,3:434-442.

[17]mengf,zhaoh,zhangcetal.expressionofanovelbacteriocin-theplantaricinpln1-inescherichiacolianditsfunctionalanalysis.proteinexpressionandpurification,2015,119:85-93.

[18]m.rocha,f.a.ferreira,m.m.souzaetal.antimicrobialfilmsareview.microbialpathogensandstrategiesforcombatingthem:science,technologyandeducation2013:23-31.

[19]路遙,蔣立科,陳美玲etal.通過定點(diǎn)突變提高乳鏈菌肽對(duì)熱及ph的穩(wěn)定性.微生物學(xué)報(bào),2010,50:1481-1487.