本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及二肽基肽酶iv酶近紅外熒光探針底物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二肽基肽酶-iv(dipeptidylpeptidaseiv,dpp-iv,cd26,ec3.4.14.5)是以二聚體形式存在的ⅱ型跨膜蛋白酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物臟器的上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中在小腸和腎中表達(dá)最高，也能以溶解形式存在于體液中。作為重要的i相代謝酶，dpp-iv能特異性地催化多肽鏈n末端第2位的氨基酸殘基脯氨酸(pro)或丙氨酸(ala)肽鍵水解斷裂，從而參與體內(nèi)多種生物活性多肽的激活，以及使多種活性多肽部分或完全失活，如腸促胰島素、神經(jīng)肽、胃泌素釋放肽、生長(zhǎng)激素釋放激素等。dpp-iv在糖代謝過程中扮演重要角色，已經(jīng)成為了治療2型糖尿病新靶點(diǎn)，同時(shí)也被fda批準(zhǔn)為重要的藥物作用靶點(diǎn)。另外它還是細(xì)胞膜受體和共刺激分子，從而參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞移行、細(xì)胞黏附和細(xì)胞調(diào)亡過程，故與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，dpp-iv在一些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)(結(jié)腸癌、原發(fā)性肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、食道惡性腺瘤等)，利用dpp-iv代謝活化機(jī)制，以dpp-iv為潛在靶點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)靶向性的抗癌前藥。臨床研究表明許多疾病會(huì)引起患者血液/尿液dpp-iv含量顯著改變，如肝病癌患者血液/血清dpp-iv含量顯著高于正常人，糖尿病腎病患者尿液dpp-iv含量明顯增高。有報(bào)道稱檢測(cè)血液/血清或尿液中的dpp-iv可作為某些疾病診斷和評(píng)估的標(biāo)志物。因此，dpp-iv酶的活性檢測(cè)具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，對(duì)疾病的早期診斷、評(píng)估及預(yù)后治療，以及高效篩選dpp-iv抑制劑作為糖尿病治療的候選藥物等。

目前，定量評(píng)估dpp-iv的方法主要包括對(duì)硝基苯胺衍生物gp-pna底物顯色法和4-甲基-7-氨基香豆素衍生物gp-amc熒光探針法。gp-pna體系多適用于含單一成分dpp-iv的檢測(cè)(如單酶體系dpp-iv抑制劑的篩選)，實(shí)際生物樣品檢測(cè)中存在樣品制備與分析流程繁瑣、測(cè)試通量低、成本高、生物基質(zhì)干擾大等缺陷。而gp-amc體系應(yīng)用于生物樣品(體液、細(xì)胞、組織等)檢測(cè)時(shí)，由于吸收和發(fā)射波長(zhǎng)所限(λex＝360/λem＝460nm)容易受到生物基質(zhì)背景吸收和背景熒光的干擾，使得熒光分析的靈敏度和準(zhǔn)確性受到了很大的影響，應(yīng)用時(shí)容易得到假陽性或假陰性的結(jié)果。近年來，隨著人們對(duì)dpp-iv與疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究的深入，現(xiàn)存的dpp-iv熒光探針的性能已經(jīng)不能滿足人們對(duì)dpp-iv精確定量評(píng)估方法的需求，特別是針對(duì)血液、尿液、癌細(xì)胞/組織等復(fù)雜生物體系的快速檢測(cè)或功能成像。因此，急需開發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、抗干擾能力強(qiáng)、可高靈敏定量檢測(cè)復(fù)雜生物體系dpp-iv活性的熒光探針底物。

近紅外(nir)熒光探針由于其激發(fā)和檢測(cè)可避免環(huán)境和生物樣品產(chǎn)生的背景噪聲,可以有效地避免生物樣品的自吸收和自熒光的干擾。同時(shí),在生物光學(xué)窗口(600m-900nm)范圍內(nèi)，避開了生命體系所不能承受的紫外-可見光損傷，降低了光漂白和光損傷。另外，近紅外熒光成像可以穿透的組織,彌補(bǔ)了光學(xué)成像中組織穿透性低的缺陷。因此,近紅外熒光探針在復(fù)雜生物樣品分析檢測(cè)中有明顯的優(yōu)越性。開發(fā)高選擇性的dpp-iv近紅外熒光探針反應(yīng)及其配套的高通量檢測(cè)方法具有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種測(cè)定二肽基肽酶iv(dpp-iv)的特異性及紅外近紅外熒光探針底物及其應(yīng)用，該熒光探針底物和去二肽基化產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長(zhǎng)具有明顯差異，且產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率更高更易檢測(cè)。利用該探針反應(yīng)可對(duì)多種生物體系中dpp-iv的分布和功能進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。

本發(fā)明提供了一種dpp-iv的特異性熒光探針底物，該探針底物可被dpp-iv特異性催化生成具有不同熒光屬性的產(chǎn)物并生成相應(yīng)的取代芳胺，該底物結(jié)構(gòu)式如下：

其中，x選自o、n；r選自c1-c10烷基、-(c1-c8亞烷基)-羧基、-(c1-c8亞烷基)-酯基、-(c1-c8亞烷基)-氨基、-(c1-c8亞烷基)-氰基、-(c1-c8亞烷基)-硝基、-(c1-c3亞烷基)-o-(c1-c3烷基)、碳環(huán)基、-(c1-c3亞烷基)-碳環(huán)基、芳基、-(c1-c3亞烷基)-芳基、雜芳基、-(c1-c3亞烷基)-雜芳基、雜環(huán)基或-(c1-c3亞烷基)-雜環(huán)基。

本發(fā)明提供了一種二肽基肽酶iv近紅外熒光探針底物的制備方法，其特征在于：

1)以2-乙?；椒訛槠鹗荚?，經(jīng)過堿催化乙?；铣?-乙?；阴１椒?，酸催化環(huán)化合成黃酮3；

2)酸催化黃酮3與丙二腈反應(yīng)合成二氰苯并吡喃4，或黃酮3與取代胺反應(yīng)合成酸性/中性/堿性、極性/非極性、親水/疏水、及大小不一的系列取代基團(tuán)的n-取代喹啉酮5，在與丙二腈反應(yīng)合成二氰n-取代喹啉6；

3)二氰苯并吡喃4或二氰n-取代喹啉6與對(duì)氨基苯甲醛反應(yīng)合成反式取代4-乙烯基苯胺7；

4)反式取代4-乙烯基苯胺7(1.0eq)在n-羥基苯并三氮唑(0.5-2.0eq)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(0.5-2.0eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.0-3.0eq)存在下，與叔丁氧羰基甘氨酸基脯氨酸(1.0-3.0eq)縮合，20-30℃攪拌反應(yīng)24-48小時(shí)，生成的產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，再經(jīng)三氟乙酸酸催化，20-30℃攪拌反應(yīng)4-10小時(shí)脫除叔丁氧羰基生成二肽基肽酶iv的近紅外熒光探針底物gp-r，純化后產(chǎn)率為30-80％。

該反應(yīng)的反應(yīng)路線如下：

本發(fā)明還提供一種測(cè)定dpp-iv的特異性熒光探針底物的應(yīng)用，采用該dpp-iv特異性底物，與含dpp-iv的生物樣品混合后進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過定量檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)的底物消除率或其去二肽基化產(chǎn)物的生成率來定量測(cè)定不同生物體系中dpp-iv的活性，具體測(cè)定方法及條件如下：

a.體系中以gp-r作為比率型探針底物；底物濃度選擇1/10～10km；

b.在pbs緩沖液中，反應(yīng)溫度為20～60℃之間；孵育體系ph介于5.5～10.5之間；

c.反應(yīng)時(shí)間為5～120分鐘，確保以上底物相應(yīng)的n-去二肽基化產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物轉(zhuǎn)化率不超過20％時(shí)終止反應(yīng)；

d.測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)底物減少量或n-去二肽基化產(chǎn)物生成量作為dpp-iv活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

具體測(cè)定方法及條件中，單點(diǎn)測(cè)定時(shí)底物濃度優(yōu)選km。

具體測(cè)定方法及條件中，反應(yīng)溫度優(yōu)選37℃，孵育體系ph優(yōu)選ph7.4。

所述的生物體系為重組表達(dá)dpp-iv單酶、人或動(dòng)物血液/血清、尿液、組織制備液或各類哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞及其制備物中的任意一種。

該探針底物及其去二肽基產(chǎn)物具有不同的紫外吸收和熒光發(fā)射波譜，可用于紫外和熒光檢測(cè)。該探針底物還可用于dpp-iv抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評(píng)價(jià)。

該特異性探針底物為近紅外熒光探針，其在dpp-iv活性檢測(cè)過程不易受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種重組dpp-iv、人及動(dòng)物組織制備液、血液/血清、尿液及各類組織細(xì)胞中dpp-iv酶活的定量測(cè)定；同時(shí)也可作為在體及動(dòng)物整體dpp-iv的探針底物，評(píng)估代謝酶dpp-iv的個(gè)體及種屬差異。該探針底物及n-去二肽基化代謝產(chǎn)物的熒光檢測(cè)方法還可用于dpp-iv抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評(píng)價(jià)。

作為高特異性的dpp-iv單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測(cè)dpp-iv的活性，尤其適合用于對(duì)細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系生產(chǎn)的dpp-iv的酶活測(cè)定，以及多種哺乳動(dòng)物組織器官來源的微粒體、s-9等制備物中dpp-iv的活性標(biāo)定。

選用本發(fā)明所述dpp-iv單酶的近紅外熒光探針反應(yīng)檢測(cè)dpp-iv單酶體外活性具有以下突出優(yōu)勢(shì)：

(1)高特異性：gp-r可被dpp-iv高特異性地代謝成一個(gè)代謝產(chǎn)物，即n-去二肽化產(chǎn)物。

(2)廉價(jià)易得：gp-r可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行。

(3)易高通量檢測(cè)：可在實(shí)驗(yàn)室常見各類熒光酶標(biāo)儀及臨床大生化儀上測(cè)定，可利用96或386微孔板進(jìn)行批量檢測(cè)。

(4)抗干擾：由于在近紅外(nir)檢測(cè)可避免環(huán)境和生物樣品產(chǎn)生的背景噪聲,可以有效地避免生物樣品的自吸收和自熒光的干擾。

附圖說明

圖1.4-(甘氨酸-脯氨酸)-取代乙烯基苯胺類化合物的結(jié)構(gòu)通式；

圖2.n-(甘氨酸-脯氨酸)-(e-苯并吡喃-乙烯)苯胺(gp-acm)的合成路線；

圖3.n-(甘氨酸-脯氨酸)-(e-苯并吡喃-乙烯)苯胺(gp-acm)的¹h-nmr譜圖；

圖4.n-(甘氨酸-脯氨酸)-(e-喹啉-乙烯)苯胺(gp-abp)的合成路線；

圖5.n-(甘氨酸-脯氨酸)-(e-苯并吡喃-乙烯)苯胺(gp-acm)的選擇性；

圖6.dpp-iv的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7.dpp-iv催化gp-acm水解的酶促動(dòng)力學(xué)；

圖8.化學(xué)抑制實(shí)驗(yàn)；

圖9.健康人血漿dpp-iv活性測(cè)定；

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

本發(fā)明所采用的設(shè)備及其型號(hào)為：熒光發(fā)射/激發(fā)光譜是由synergyh1全功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)完成；¹h-nmr譜圖是由核磁共振波譜儀(avanceii700mhz)檢測(cè)完成。

4-(甘氨酸-脯氨酸)-芳胺類化合物的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。

實(shí)施例1

n-(甘氨酸-脯氨酸)-(e-苯并吡喃-乙烯)苯胺(gp-acm)的合成

合成路線如圖2所示。

(1)化合物2的合成

室溫，將鄰羥基苯乙酮1(1.36g,10mmol)加入乙酸乙酯(85ml)和四氫呋喃(15ml)的混合溶液中。劇烈攪拌下分批加入鈉塊，加完后室溫反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，加入冰水(50ml)，稀鹽酸調(diào)ph＝5-6，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)、水洗(30ml×1)、飽和氯化鈉溶液洗(30ml×1)、無水硫酸鈉干燥。干燥充分后，蒸除溶劑，得粗化合物2，無需純化直接用于下一步反應(yīng)。

(2)化合物3的合成

室溫，將上一步所得化合物2粗產(chǎn)物加入冰醋酸(10ml)溶液中，攪拌均勻后慢慢滴加濃硫酸(1ml)，加完室溫反應(yīng)。反應(yīng)完畢后蒸除醋酸，加入水(50ml)，用乙酸乙酯萃取(50ml×2)，合并有機(jī)相水洗(30ml×1)、飽和氯化鈉溶液洗(30ml×1)、無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)得化合物3，淡黃色固體，產(chǎn)率70-80％,esi-msm/z161.0[m+h]⁺。

(3)化合物4的合成

室溫，將化合物3(480.5mg,3mmol)、丙二腈(792.7mg,12mmol)加入乙酸酐(3ml)溶液中，攪拌溶解后，回流反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，加入冰水(10ml)，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)ph＝7-8，乙酸乙酯萃取(50ml×2)，合并有機(jī)相水洗(20ml×2)、飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)、無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)得化合物4，淡黃色固體，產(chǎn)率50-60％,esi-msm/z207.1[m-h]^-。

(4)化合物7的合成

室溫，依次將化合物4(218.5mg,1.05mmol)、對(duì)氨基苯甲醛(121.1mg,1mmol)、哌啶(0.5ml)、醋酸(0.5ml)加入甲苯(40ml)溶液中，攪拌溶解后，回流反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，冷卻到室溫，蒸除乙醇加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取(50ml×2)，合并有機(jī)相水洗(20ml×1)、飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)、無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(石油醚/二氯甲烷/乙酸乙酯＝5/5/1)得化合物7，紅棕色固體，產(chǎn)率40-50％,esi-msm/z312.1.1[m+h]⁺。

(5)化合物8的合成

室溫，將化合物7(155.7mg,0.5mmol)、boc-gly-pro-oh(272.3mg,1.0mmol)、n-羥基苯并三氮唑(67.6mg,0.5mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(95.9mg,0.5mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(380.2mg,1.0mmol)依次加入到n,n-二甲基甲酰胺(5ml)溶液中反應(yīng)，薄板層析(tlc)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)36h后，反應(yīng)體系冷卻到0-5℃，加水(25ml)，乙酸乙酯萃取三次(30ml×3)，合并有機(jī)相水洗三次(15ml×3)，5％碳酸氫鈉溶液洗(20ml×1)，水洗(15ml×1)、飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(二氯甲烷/甲醇＝50/1)得化合物8，黃色油狀物，產(chǎn)率65-75％,esi-msm/z564.3[m-h]^-。

(6)化合物gp-acm的合成

室溫，將化合物8(200mg,0.35mmol)加入到二氯甲烷(12ml)與三氟乙酸(3ml)混合溶液中反應(yīng)，薄板層析(tlc)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)6h后，蒸除反應(yīng)溶劑，粗產(chǎn)物加入水中(15ml)，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)ph＝7-8，二氯甲烷萃取三次(25ml×3)，合并有機(jī)相水洗(15ml×1)，飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(二氯甲烷/甲醇/水＝20/5/0.5)得化合物gp-acm，其核磁譜圖如圖3所示，該產(chǎn)物為紅棕色固體，產(chǎn)率50-60％。

制備的產(chǎn)物的核磁共振波譜具體如下：

¹hnmr(700mhz,dmso)δ8.73(d,j＝8.4hz,1h),8.22(s,1h),7.93(t,j＝7.8hz,1h),7.79(d,j＝8.4hz,1h),7.77-7.68(m,5h),7.62(t,j＝7.8hz,1h),7.41(d,j＝16.0hz,1h),7.00(s,1h),4.51(dd,j＝8.4,3.3hz,1h),3.78(s,2h),3.64-3.59(m,1h),3.53(m,1h),2.24-2.16(m,1h),2.06-1.85(m,3h).esi-msm/z466.2[m+h]⁺。

實(shí)施例2

n-(甘氨酸-脯氨酸)-(e-喹啉-乙烯)苯胺(gp-abp)的合成

合成路線如圖4所示。

(1)化合物5的合成

室溫，將上一步所得化合物3(961mg,6mmol)粗產(chǎn)物加入冰醋酸(10ml)溶液中，攪拌均勻后慢慢滴加正丁胺(2ml)，回流反應(yīng)。反應(yīng)完畢后降至室溫，加入冰水(100ml)，過濾得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝8/1)得化合物5，紅棕色固體，產(chǎn)率30-40％,esi-msm/z216.1[m+h]⁺。

(2)化合物6的合成

室溫，將化合物5(430mg,1mmol)、丙二腈(792.7mg,12mmol)加入乙酸酐(3ml)溶液中，攪拌溶解后，回流反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，加入冰水(10ml)，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)ph＝7-8，乙酸乙酯萃取(50ml×2)，合并有機(jī)相水洗(20ml×2)、飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)、無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)得化合物6，淡黃色固體，產(chǎn)率50-60％,esi-msm/z262.1[m-h]^-。

(3)化合物7'的合成

室溫，依次將化合物6(275.4mg,1.05mmol)、對(duì)氨基苯甲醛(121.1mg,1mmol)、哌啶(0.5ml)、醋酸(0.5ml)加入甲苯(40ml)溶液中，攪拌溶解后，回流反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，冷卻到室溫，蒸除乙醇加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取(50ml×2)，合并有機(jī)相水洗(20ml×1)、飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)、無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(石油醚/二氯甲烷/乙酸乙酯＝5/5/1)得化合物7'，紅棕色固體，產(chǎn)率40-50％,esi-msm/z367.2[m+h]⁺。

(4)化合物8'的合成

室溫，將化合物7'(183.6mg,0.5mmol)、boc-gly-pro-oh(272.3mg,1.0mmol)、n-羥基苯并三氮唑(67.6mg,0.5mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(95.9mg,0.5mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(380.2mg,1.0mmol)依次加入到n,n-二甲基甲酰胺(5ml)溶液中反應(yīng)，薄板層析(tlc)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)36h后，反應(yīng)體系冷卻到0-5℃，加水(25ml)，乙酸乙酯萃取三次(30ml×3)，合并有機(jī)相水洗三次(15ml×3)，5％碳酸氫鈉溶液洗(20ml×1)，水洗(15ml×1)、飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(二氯甲烷/甲醇＝50/1)得化合物8'，棕色油狀物，產(chǎn)率65-75％,esi-msm/z619.3[m-h]^-。

(4)化合物gp-abp的合成

室溫，將化合物8'(150mg,0.24mmol)加入到二氯甲烷(10ml)與三氟乙酸(2ml)混合溶液中反應(yīng)，薄板層析(tlc)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)6h后，蒸除反應(yīng)溶劑，粗產(chǎn)物加入水中(15ml)，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)ph＝7-8，二氯甲烷萃取三次(25ml×3)，合并有機(jī)相水洗(15ml×1)，飽和氯化鈉溶液洗(20ml×1)，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(二氯甲烷/甲醇/水＝20/5/0.5)得化合物gp-abp，該產(chǎn)物為紅棕色固體，產(chǎn)率40-50％,esi-msm/z521.2[m-h]^-。

實(shí)施例3.

體外測(cè)定人重組dpp-iv單酶的選擇性

(1)預(yù)先準(zhǔn)備198μldpp-iv代謝反應(yīng)體系，包括ph7.4的pbs緩沖液(50mm)、重組人dpp-iv單酶(1μg/ml)，重組人dpp-ix單酶(1μg/ml)，重組人dpp-viii單酶(1μg/ml)，重組人成纖維細(xì)胞活化蛋白單酶(fap，1μg/ml)，碳酸酐酶(ca，10μg/ml)，胰蛋白酶(trypsin，10μg/ml)，胃蛋白酶(pepsin，10μg/ml)，丁酰膽堿酯酶(bche，10μg/ml)，乙酰膽堿酯酶(ache，10μg/ml)，羧酸酯酶(hce1，hce2，10μg/ml)，牛血清白蛋白(bsa，10μg/ml)，人血清白蛋白(has，10μg/ml)，蛋白酶k(proteinasek嗎，5μg/ml)，溶菌酶(lysozyme，10μg/ml),脂肪酶(lipase，5μg/ml),α-酸性糖蛋白(α-acidoglycoprotein，5μg/ml)于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入2μl濃度為10mm的gp-acm起始反應(yīng)；

(3)30分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；

(4)用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測(cè)(ex＝400nm，em＝535nm)；重組人dpp-iv酶的選擇性最高約是其它單酶的50倍左右(圖5)。

實(shí)施例4.

體外測(cè)定dpp-iv的檢測(cè)下限測(cè)定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測(cè)定，gp-acm100μm，dpp-iv單酶0.5μg/ml～1.2μg/ml，ph7.4的pbs緩沖液50mm，總體積為200μl，37℃下孵育1h后通過酶標(biāo)儀分析，每組的平均值與不加dpp-iv的對(duì)照組比較，結(jié)果表明dpp-iv的檢測(cè)下限為160ng/ml(圖6)。

實(shí)施例5.

dpp-iv酶促動(dòng)力學(xué)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測(cè)定，底物1-500μm，dpp-iv單酶0.25mg/ml或腸微粒體2.5mg/ml，ph7.4的pbs緩沖液100mm，總體積200μl，37℃下孵育通過酶標(biāo)儀分析1h，每1分鐘測(cè)一次。檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)480nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為670nm。將所獲熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后分別得到dpp-iv單酶和人腸微粒體(him)對(duì)gp-acm的vmax和km(圖7)。

實(shí)施例6.

化學(xué)抑制試驗(yàn)

抑制劑濃度梯度：工作液濃度(μm)250、100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0；反應(yīng)終濃度(nm)2500、1000、500、250、100、50、25、10、5、2.5、1、0。測(cè)定：

(1)him:平行實(shí)驗(yàn)2組。加入5μlhim和93μlbuffer，加入維格列汀2μl，孵育4min；加入100μl(100μm)底物起始反應(yīng)，30min，200μl乙腈終止反應(yīng)，檢測(cè)。

(2)dpp-ⅳ：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法，在dpp-ⅳ體系中，重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)2組。

如圖8所示，人腸微粒體水解gp-acm的活性能被vildagliptin(2.5μm)所強(qiáng)烈抑制(圖8)。

實(shí)施例7.

健康人血漿dpp-iv活性測(cè)定

在1.5mlep管中加入196ulpbs溶液，然后加入2ul血漿(或血清)樣品，在孵育鍋中預(yù)孵5min。然后分別加入已配好底物gp-acm2ul，每個(gè)樣品反應(yīng)30min。30min后加入200ul乙腈終止反應(yīng)。吸取200ul體系在96孔酶標(biāo)板上，測(cè)量熒光值。測(cè)得的比值帶入標(biāo)曲中計(jì)算酶活性(圖9)。