一種從酶轉(zhuǎn)化液中分離提取2-酮丁酸的方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種從酶轉(zhuǎn)化液中分離提取2-酮丁酸的方法，屬于發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)酸的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
2-酮丁酸又稱a-羰基丁酸(a-Ketobutyricacid)，2-氧代丁酸(2-Oxobutyricacid)、3-甲基丙酮酸，分子式為C4H6O3，相對(duì)分子質(zhì)量為102.09，熔點(diǎn)為31～32℃，沸點(diǎn)為82～84℃(16mmHg)，易溶于水和酒精，具有甜的烤香、奶油、焦糖和脂肪風(fēng)味。是合成多種有用化合物的前體物質(zhì)，如異亮氨酸、1-丙醇、正丁醇、2-羥基丁酸、保洛霉素、呋喃酮及一些食品添加劑等，特別地，2-酮丁酸能合成L-高丙氨酸，它是抗癲癇藥物左乙拉西坦(LEV)和布瓦西坦片的一種重要前體。另一個(gè)下游產(chǎn)物4-羥基-L-異亮氨酸顯示出了高效促進(jìn)胰島素分泌的能力。而利用2-酮丁酸生產(chǎn)1-丙醇和正丁醇進(jìn)而合成高辛烷值的新型生物燃料取代傳統(tǒng)的乙醇燃料，對(duì)節(jié)約能源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境也起到了積極的作用。2-酮丁酸的生產(chǎn)方法包括化學(xué)直接合成法和生物法，生物法生產(chǎn)2-酮基丁酸又包括酶法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法可以由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解進(jìn)行，化學(xué)合成的2-酮基丁酸至今一直用作進(jìn)一步合成香料的中間體，如呋喃酮(5-乙基-3-羥基-4-甲基-2(5H)呋喃酮)，具有濃烈且特殊的香味，并以低濃度用作香料及食物的前調(diào)。酶法生產(chǎn)a-酮丁酸，如利用蘇氨酸脫水酶催化蘇氨酸生產(chǎn)a-酮基丁酸，直接以蘇氨酸為底物，選育具有蘇氨酸脫水酶活性的微生物，制成完整細(xì)胞催化劑，由于蘇氨酸是比較廉價(jià)、方便得到的原料，此法可以快速生成一定量的2-酮丁酸產(chǎn)物。已知a-羥基丁酸僅僅經(jīng)過一步氧化反應(yīng)即可生成2-酮基丁酸，是酶法生產(chǎn)2-酮基丁酸的極佳底物，而利用含a-羥基氧化酶的微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化a-羥基丁酸制備2-酮基丁酸的報(bào)道不多，馬翠卿等選育具有a-羥酸氧化酶活性的假單胞菌，將菌體制備成具有a-羥酸氧化酶活性的完整細(xì)胞催化劑，并成功使a-羥基丁酸鈉與O2反應(yīng)制備出2-酮基丁酸鈉，且轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.4％。美國專利(USPatent7015020)報(bào)道了一種利用丙酮酸脫羧酶催化的加成反應(yīng)以CO2和丙醛為底物生產(chǎn)2-酮基丁酸，濃度為0.1mmoL/L的底物丙醛經(jīng)反相液譜分離后，2-酮基丁酸的產(chǎn)率為52％。FuruyoshiSetsuo等人報(bào)道利用惡臭假單胞菌催化巴豆酸生產(chǎn)2-酮基丁酸的方法，先是在N-甲基氧化嗎啉存在的條件下，催化巴豆酸生成2,3-二羥基丁酸，此步反應(yīng)產(chǎn)率約為53％，然后用惡臭假單胞菌催化2,3-二羥基丁酸生產(chǎn)2-酮基丁酸，最適反應(yīng)條件下，這一步摩爾轉(zhuǎn)化率能達(dá)到47％，產(chǎn)量為4.8g/L,但該方法在經(jīng)兩步催化過程后，即由巴豆酸到2-酮基丁酸，其總體產(chǎn)率僅為25％，造成了底物的浪費(fèi)。還有一些底物，如1,2-二丁醇、丁烯酸，也可以被用于利用生物催化法生產(chǎn)2-酮丁酸。發(fā)酵法生產(chǎn)2-酮丁酸也有多例報(bào)道。美國專利(USPatent7144715)報(bào)道一株粗糙脈胞菌的ilv-3突變體，以蘇氨酸為底物生產(chǎn)2-酮基丁酸，通過優(yōu)化培養(yǎng)配比，2-酮基丁酸產(chǎn)量可以達(dá)到8g/L，產(chǎn)率為90％，本法中巧合的是，纈氨酸是粗糙脈孢菌的ilv-1基因產(chǎn)物的激活劑，但也不能以大劑量加入，適量控制可促進(jìn)2-酮基丁酸的積累。NakaharaTadaatsu等人在以硫胺素為限制因素的培養(yǎng)基上，篩選得到馬紅球菌IFO3730，可以以1,2-丁二醇為碳源生產(chǎn)2-酮基丁酸，經(jīng)過32h培養(yǎng)可將20g/L的1,2-丁二醇轉(zhuǎn)變成15.7g/L的2-酮基丁酸，底物摩爾轉(zhuǎn)化率約為68％。但1,2-丁二醇對(duì)獲得食物成分而言并非優(yōu)選，所以并不能確保在合成食物成分中微生物對(duì)食物成分或反應(yīng)物的產(chǎn)生是無害的。天津科技大學(xué)陳寧等構(gòu)建了一株2-酮基丁酸基因工程菌株，該菌株能夠以葡萄糖為原料高效積累蘇氨酸，通過過量表達(dá)蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA實(shí)現(xiàn)2-酮基丁酸的大量積累，發(fā)酵24h，2-酮基丁酸產(chǎn)量可以達(dá)到15g/L。目前利用發(fā)酵法生產(chǎn)2-酮基丁酸最普遍的方法是通過選育L-蘇氨酸脫水酶(ilvA基因編碼)活力較高的微生物，在其合成并積累一定量蘇氨酸的前提下，由L-蘇氨酸脫水酶催化蘇氨酸生成2-酮基丁酸，但通過發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮丁酸產(chǎn)酸較低，副產(chǎn)物多，特別是和酮丁酸性質(zhì)相近的雜酸如丙酮酸等雜酸較多，分離提取困難，造成發(fā)酵法放大生產(chǎn)受阻。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是提供一種新型的2-酮丁酸的分離提取工藝，改變現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中存在的分離提取工藝復(fù)雜，收率低，產(chǎn)品純度低，大量制備成本高等問題。本發(fā)明采用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-酮丁酸，生產(chǎn)周期短，催化效率高，副產(chǎn)物少，分離提取相對(duì)容易。針對(duì)上述問題，本發(fā)明課題組采用酶催化法生產(chǎn)2-酮丁酸，酶催化液含有2-酮丁酸、菌體、水溶性蛋白、色素、蘇氨酸、鈉鹽等，根據(jù)發(fā)酵液的特點(diǎn)，開發(fā)了一種新型提取工藝技術(shù)，該工藝首先通過雙膜即微濾膜、超濾膜分離系統(tǒng)錯(cuò)流過濾去除發(fā)酵液中的菌體、大部分蛋白和色素，膜過濾液依次通過粉末活性炭脫色、加堿除蛋白、減壓濃縮、陽離子交換柱除雜質(zhì)、冷凍真空干燥操作步驟，得到純度95.0％以上的2-酮丁酸結(jié)晶，收率達(dá)到80％以上，具體步驟如下：a、將2-酮丁酸酶轉(zhuǎn)化液經(jīng)活菌滅活，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0-4.5，進(jìn)入微濾膜分離系統(tǒng)進(jìn)行微濾，得到去除菌體的2-酮丁酸微濾液；所述微濾膜分離系統(tǒng)采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，微濾膜孔徑為0.1-0.2um，操作溫度為10～50℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差為0.05～0.1Mpa，過濾過程分多次加入純化水頂洗，直至濃液中2-酮丁酸含量低于2.0g/L后停機(jī)，獲得2-酮丁酸微濾液。b、將經(jīng)a步得到澄清的2-酮丁酸過濾液泵入超濾膜過濾器，過濾除蛋白，操作溫度為10-50℃，操作壓力差為0.05-0.1MPa，得到2-酮丁酸超濾過濾液。所述超濾膜過濾器采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，截留分子量為6000。c、將b步獲得的超濾過濾液加入濾液重量的0.05％-2％的活性炭脫色，溫度30-60℃，攪拌脫色20-30min，過濾獲得2-酮丁酸脫色液，560nm透光90％以上。d、將c步獲得的脫色液加入氫氧化鈉固體，調(diào)解pH至10.0以上，靜置半小時(shí)，出現(xiàn)絮狀蛋白沉淀后，加入液體重量的0.05％-2％的活性炭吸附絮凝蛋白，過濾后收集過濾液。e、將d步獲得的過濾液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至原體積液的15％-20％，獲得2-酮丁酸濃縮液；f、將e步獲得的2-酮丁酸濃縮液上732陽離子交換樹脂吸附鈉離子、蘇氨酸陽離子，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液。g、將f步獲得的2-酮丁酸流出液放入-20℃冰箱結(jié)冰，然后將其放入冷凍真空干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥，獲得2-酮丁酸晶體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明采用微濾和超濾雙膜過濾菌體，去除菌體效果較好，過濾液澄清透明；2、本發(fā)明采用陽離子交換工藝，高效去除難分離的鈉鹽、蘇氨酸等雜質(zhì)；3、本發(fā)明采用冷凍真空干燥，避免了2-酮丁酸的揮發(fā)，提高了收率；4、本發(fā)明提供一種新型的2-酮丁酸生產(chǎn)工藝，得到的2-酮丁酸晶體經(jīng)高效液相分析儀測(cè)定純度達(dá)95.0％以上。具體實(shí)施方式實(shí)施例1a、取2-酮丁酸酶轉(zhuǎn)化液5.0L(-酮丁酸含量42.3g/L)，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0，進(jìn)入微濾膜分離系統(tǒng)進(jìn)行微濾，得到去除菌體的-酮丁酸微濾液；所述微濾膜分離系統(tǒng)采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，微濾膜孔徑為0.2um，操作溫度為35℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差為0.1Mpa，過濾過程分多次加入純化水頂洗，直至濃液中2-酮丁酸含量低于2.0g/L后停機(jī)，獲得2-酮丁酸微濾液。清液2-酮丁酸回收率達(dá)96.2％，菌體去除率大于99.9％，膜通量達(dá)到89L·(m2·h)-1。b、將經(jīng)a步得到澄清的2-酮丁酸過濾液泵入超濾膜過濾器，過濾除蛋白，操作溫度為35℃，操作壓力差為0.1MPa，得到2-酮丁酸超濾過濾液。所述超濾膜過濾器采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，截留分子量為6000。c、將b步獲得的超濾過濾液加入濾液重量的1.0％的活性炭脫色，溫度50℃，攪拌脫色20min，過濾獲得2-酮丁酸脫色液，560nm透光92.0％。d、將c步獲得的脫色液加入氫氧化鈉固體，調(diào)解pH為10.6，靜置半小時(shí)，出現(xiàn)絮狀蛋白沉淀后，加入液體重量的1.0％的活性炭吸附絮凝蛋白，過濾后收集過濾液。e、將d步獲得的過濾液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至原體積液的20％，獲得2-酮丁酸濃縮液；f、將e步獲得的2-酮丁酸濃縮液上732陽離子交換樹脂吸附鈉離子、蘇氨酸陽離子，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液。g、將f步獲得的2-酮丁酸流出液放入-20℃冰箱結(jié)冰，然后將其放入冷凍真空干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥，獲得2-酮丁酸晶體。取出晶體后，迅速裝入密封袋中，稱重171.9g，計(jì)算收率為81.3％，純燉為95.1％。實(shí)施例2取2-酮丁酸酶轉(zhuǎn)化液6.8L(2-酮丁酸含量35.3g/L)，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行微濾除菌體和超濾除蛋白(其中，微濾條件：微濾膜孔徑為0.1um，溫度為50℃，進(jìn)出膜壓力差為0.05Mpa；超濾條件：溫度為20℃，操作壓力差為0.05MPa)，超濾液用其重量1.5％的活性炭脫色，溫度45℃，攪拌脫色25min，過濾獲得2-酮丁酸脫色液，用氫氧化鈉調(diào)pH為11.0后，加入脫色液重量1.5％的活性炭吸附絮狀蛋白，然后進(jìn)行減壓蒸發(fā)至原體積液的18％，得到2-酮丁酸濃縮液，上732陽離子交換樹脂，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液，流出液放入-20℃冰箱結(jié)冰，然后將其放入冷凍真空干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥，獲得2-酮丁酸晶體。取出晶體后，迅速裝入密封袋中，稱重192.3g，計(jì)算收率為80.1％，純度為95.7％。實(shí)施例3取2-酮丁酸酶轉(zhuǎn)化液8.4L(2-酮丁酸含量37.2g/L)，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行微濾除菌體和超濾除蛋白(其中，微濾條件：微濾膜孔徑為0.1um，溫度為10℃，進(jìn)出膜壓力差為0.1Mpa；超濾條件：溫度為50℃，操作壓力差為0.08MPa)，超濾液用其重量1.8％的活性炭脫色，溫度40℃，攪拌脫色30min，過濾獲得2-酮丁酸脫色液，用氫氧化鈉調(diào)pH為11.0后，加入脫色液重量1.8％的活性炭吸附絮狀蛋白，然后進(jìn)行減壓蒸發(fā)至原體積液的20％，得到2-酮丁酸濃縮液，上732陽離子交換樹脂，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液，流出液放入-20℃冰箱結(jié)冰，然后將其放入冷凍真空干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥，獲得2-酮丁酸晶體。取出晶體后，迅速裝入密封袋中，稱重255.0g，計(jì)算收率為81.6％，純度為95.4％。