本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種定點突變創(chuàng)制糯性玉米種質(zhì)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：玉米是重要的糧食作物和飼料作物，玉米淀粉在人類生活及工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，所含的直鏈淀粉和支鏈淀粉具有很高的經(jīng)濟價值。由于支鏈淀粉的理化特性使支鏈淀粉在食品加工、畜牧養(yǎng)殖、造紙業(yè)、紡織業(yè)以及粘著劑工業(yè)等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用空間，因此培育糯性玉米對生產(chǎn)及加工具有重要意義。糯性玉米又稱蠟質(zhì)玉米，是指玉米籽粒成熟后胚乳中支鏈淀粉含量幾乎為100％，且胚乳呈角質(zhì)不透明且無光澤的蠟質(zhì)狀，蒸煮后呈黏性故又稱粘玉米。糯性是一個普遍的突變性狀，天然糯性突變體在玉米、水稻、大麥、高粱等二倍體中禾谷類作物中非常常見。糯性玉米獨特的性狀是由受waxy1單基因隱形突變控制的，sprague等(1943)識別了位于玉米9號染色體短臂的waxy1基因位點，野生型waxy1基因全長3718bp，由14個外顯子和13個內(nèi)含子構(gòu)成，編碼顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase，gbssi)，該酶主要控制玉米胚乳和花粉的直鏈淀粉合成。如果waxy1基因缺失、表達受阻或gbssi酶活性降低，將導(dǎo)致胚乳直鏈淀粉合成受阻，胚乳中直鏈淀粉含量降低，從而改變淀粉的糊化和膨脹等特性形成具有糯性性狀的糯性玉米。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過50個waxy1等位基因，突變位置遍布整個waxy1基因，其中相當(dāng)一部分是不同的轉(zhuǎn)座子插入相同位置或者相同的轉(zhuǎn)座子插入不同的位置造成的不穩(wěn)定糯性突變?nèi)鐆x-7、wx-8、wx-9等(klosgen1986)，還有一些穩(wěn)定的waxy1突變體是在waxy1基因關(guān)鍵位置發(fā)生缺失或插入突變，如wx-d7、wx-d10分別是waxy1第7外顯子和第10外顯子發(fā)生堿基缺失導(dǎo)致突變的發(fā)生(fan，2008；田孟良2008)。crispr/cas9是基于細菌或古細菌規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)介導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來的基因編輯技術(shù)。該技術(shù)首先設(shè)計的一段sgrna基因，該基因轉(zhuǎn)錄的rna可以通過堿基互補配對識別目標(biāo)dna序列，指導(dǎo)cas9核酸酶切割識別的雙鏈dna，誘發(fā)同源重組(hdr，homologousdirectedrepair)或非同源末端鏈接(nhej，non-homologousend-joining)，進而實現(xiàn)目的dna編輯?；诩毦⑿兔庖邫C制開發(fā)的基因編輯技術(shù)在植物特別是作物遺傳改良上具有重大的應(yīng)用前景。該技術(shù)的基本要求之一就是受體細胞內(nèi)表達單分子識別rna(sgrna,singleguidingrna)，該分子負責(zé)識別特異性的基因編輯位點，然后介導(dǎo)結(jié)合cas9蛋白行使dna酶切活性，在設(shè)計的位點引入dna雙鏈斷裂損傷，通過胞內(nèi)的nhej或hdr修復(fù)途徑引入突變。因此，sgrna的表達是該技術(shù)的重要組成部分。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何培育糯性玉米。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了培育糯性玉米(支鏈淀粉含量高的玉米)的方法。本發(fā)明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中導(dǎo)入玉米基因組編輯的載體，得到糯性玉米。所述糯性玉米籽粒中支鏈淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支鏈淀粉含量。所述玉米基因組編輯的載體含有sgrna編碼基因。所述sgrna在玉米中識別的靶標(biāo)dna為編碼waxy1蛋白的dna片段，所述waxy1蛋白可為a1)或a2)：a1)氨基酸序列是seqidno.5所示的蛋白質(zhì)；a2)將seqidno.5所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的由a1)衍生的蛋白質(zhì)。上述方法中，所述玉米基因組編輯的載體還可含有cas9蛋白的編碼基因和rna聚合酶ⅲ識別的啟動子；所述rna聚合酶ⅲ識別的啟動子啟動所述sgrna編碼基因的轉(zhuǎn)錄。上述方法中，所述目的玉米可為非糯性玉米品種。所述非糯性玉米品種具體可為玉米自交系ca335。上述方法中，所述waxy1蛋白是seqidno.5所示的氨基酸序列，含有564個氨基酸。上述方法中，所述waxy1蛋白的cdna基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，seqidno.1的第466-2160位為所述waxy1蛋白的編碼序列。上述方法中，所述sgrna識別的靶位點可為seqidno.2所示的dna分子。上述方法中，所述sgrna編碼基因是seqidno.3的第10087-10191位所示的dna分子。上述方法中，所述rna聚合酶ⅲ識別的啟動子可為啟動子zmpolⅲca99，所述rna聚合酶ⅲ識別的啟動子為啟動子zmpolⅲca99，所述啟動子zmpolⅲca99是下述b1)或b2)或b3)所示的dna分子：b1)seqidno.4所示的dna分子；b2)與b1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性，且具有啟動子功能的dna分子；b3)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的dna序列雜交，且具有啟動子功能的dna分子。上述方法中，所述cas9蛋白的編碼基因是下述c1)或c2)或c3)所示的dna分子：c1)seqidno.3自5’末端起第12309-16409位所示的dna分子；c2)與c1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的dna分子；c3)在嚴格條件下與c1)或c2)限定的dna序列雜交的dna分子。“所述糯性玉米籽粒中支鏈淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支鏈淀粉含量”可體現(xiàn)為糯性玉米籽粒經(jīng)碘液染色為黃褐色或著色較淺，目的玉米籽粒經(jīng)碘液染色為深藍色或偏黑色?！八雠葱杂衩鬃蚜Ｖ兄ф湹矸酆扛哂谒瞿康挠衩鬃蚜Ｖ兄ф湹矸酆俊笨审w現(xiàn)為糯性玉米籽粒的淀粉粒經(jīng)碘液染色為黃褐色或著色較淺，目的玉米籽粒的淀粉粒經(jīng)碘液染色為深藍色或偏黑色。為解決上述問題，本發(fā)明還提供了玉米基因組編輯的載體。本發(fā)明所提供的玉米基因組編輯的載體，含有cas9蛋白的編碼基因、sgrna編碼基因和rna聚合酶ⅲ識別的啟動子；所述rna聚合酶ⅲ識別的啟動子啟動所述sgrna編碼基因的轉(zhuǎn)錄；所述sgrna在玉米中識別的靶標(biāo)dna為編碼waxy1蛋白的dna片段，所述waxy1蛋白為a1)或a2)：a1)氨基酸序列是seqidno.5所示的蛋白質(zhì)；a2)將seqidno.5所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的由a1)衍生的蛋白質(zhì)。上述載體還包括啟動cas9蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子(如玉米ubi啟動子)，終止cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子(如nos終止子)，復(fù)制子和抗性基因(如卡那霉素抗性基因)。上述玉米基因組編輯的載體中，所述sgrna識別的靶位點為seqidno.2所示的dna分子。上述玉米基因組編輯的載體中，所述sgrna編碼基因是seqidno.3的第10087-10191位所示的dna分子。上述玉米基因組編輯的載體中，所述rna聚合酶ⅲ識別的啟動子可為啟動子zmpolⅲca99，所述啟動子zmpolⅲca99是下述b1)或b2)或b3)所示的dna分子：b1)seqidno.4所示的dna分子；b2)與b1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性，且具有啟動子功能的dna分子；b3)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的dna序列雜交，且具有啟動子功能的dna分子。上述玉米基因組編輯的載體中，所述cas9蛋白的編碼基因是下述c1)或c2)或c3)所示的dna分子：c1)seqidno.3自5’末端起第12309-16409位所示的dna分子；c2)與c1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的dna分子；c3)在嚴格條件下與c1)或c2)限定的dna序列雜交的dna分子。上述玉米基因組編輯的載體具體可為重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9，其核苷酸序列為seqidno.3所示。其中，seqidno.3自5’末端起第208-884位所示的核苷酸序列為camv35s增強型啟動子，第2188-2982位所示的核苷酸序列為卡那霉素抗性基因，第4407-4995位所示的核苷酸序列為復(fù)制子ori，第9691-10086位所示的核苷酸序列為啟動子zmpolⅲca99，第10087-10191位所示的核苷酸序列為sgrna的編碼基因，第10192-12193位所示的核苷酸序列為玉米ubi啟動子，第12309-16409位所示的核苷酸序列為cas9蛋白的編碼基因，第16477-16729位所示的核苷酸序列為nos終止子。上述玉米基因組編輯的載體在培育糯性玉米和/或提高玉米籽粒中支鏈淀粉含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明保護的范圍。上述應(yīng)用中，所述玉米具體可為玉米自交系ca335。上述重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9可通過使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)、ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織培育成植株。實驗證明，采用含有重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米植株，能夠?qū)axy1基因進行編輯，waxy1基因通過crespr/cas9核酸內(nèi)切酶編輯之后，可造成waxy1基因突變，當(dāng)兩條同源染色體的waxy1基因均發(fā)生突變時，可以導(dǎo)致gbssi酶活性喪失，胚乳直鏈淀粉合成受阻，胚乳中直鏈淀粉含量降低，從而改變淀粉的糊化和膨脹等特性形成具有糯性性狀的糯性玉米。采用本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對玉米的waxy1基因編輯，獲得糯性玉米，具有很高的育種和栽培價值。附圖說明圖1為重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為陽性t0代轉(zhuǎn)sgrna基因植株的突變類型。圖3為陽性t0代轉(zhuǎn)sgrna基因植株突變類型的統(tǒng)計圖。圖4為t1代玉米籽粒碘染色后的表型。圖5為從t1代玉米籽粒分離的淀粉粒碘染色后的結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。peasy-bluntcloningkit、trans5α化學(xué)感受態(tài)細胞、peasy-bluntsimplevector和transt1感受態(tài)細胞為北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。玉米自交系ca335(chuanxiaoxie,shihuangzhang_,minshunli,xinhaili,zhuanfanghao,libai,deguizhang,yehongliang.inferringgenomeancestryandestimatingmolecularrelatednessamong187chinesemaizeinbredlines.journalofgeneticsandgenomics(formerlyactageneticasinica).2007,34(8):738_748)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所(即申請人)獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。玉米自交系ca335為非糯性玉米品種。中糯2號和墾粘1號均為市售，下述實施例中的白糯籽粒即為中糯2號的籽粒。下述實施例中的黃糯籽粒即為墾粘1號的籽粒。yeb液體培養(yǎng)基：將牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、mgso4·7h2o0.04g溶于1l去離子水，用10mnaoh水溶液調(diào)節(jié)ph至7.2，高溫高壓滅菌20min。實施例1、啟動子zmpolⅲca99的克隆和重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9的構(gòu)建一、啟動子zmpolⅲca99的克隆取玉米自交系ca335種子3～4粒，消毒浸種后，將其放入潮濕的石英沙盤中培育，待長出葉片，提取葉片基因組備用。以葉片基因組為模板，利用zmpolⅲca99-f(5’-aattggcccttacaaaatag-3’)和zmpolⅲca99-r(5’-ggagcggtggtcgcagctg-3’)組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增片段。將該pcr擴增片段利用peasy-bluntcloningkit進行亞克隆，得到重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)入trans5α化學(xué)感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)并測序，測序結(jié)果表明重組載體中含有seqidno.4所示的啟動子zmpolⅲca99序列。二、重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9的獲得人工合成seqidno.3所示的重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9(環(huán)形質(zhì)粒，載體結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)。其中，seqidno.3自5’末端起第208-884位所示的核苷酸序列為camv35s增強型啟動子，第2188-2982位所示的核苷酸序列為卡那霉素抗性基因，第4407-4995位所示的核苷酸序列為復(fù)制子ori，第9691-10086位所示的核苷酸序列為步驟一所述啟動子zmpolⅲca99，第10087-10191位所示的核苷酸序列為sgrna的編碼基因，第10192-12193位所示的核苷酸序列為玉米ubi啟動子，第12309-16409位所示的核苷酸序列為cas9蛋白的編碼基因，第16477-16729位所示的核苷酸序列為nos終止子。實施例2、培育糯性玉米突變株及其驗證一、農(nóng)桿菌侵染液的制備1、將實施例1合成的重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)細胞，得到重組農(nóng)桿菌，命名為eha105-zmpolⅲca99-sgrna-cas9。2、將eha105-zmpolⅲca99-sgrna-cas9單克隆接種于20ml含卡那霉素50mg/l和利福平50mg/l的yeb液體培養(yǎng)基，28℃、220rpm震蕩培養(yǎng)12～16h，然后按2％-4％(體積百分含量)的比例接種于含乙酰丁香酮100μm的yeb液體培養(yǎng)基，28℃、220rpm振蕩培養(yǎng)至od600值達到0.5左右，得到農(nóng)桿菌侵染液。二、培育糯性玉米突變株將eha105-zmpolⅲca99-sgrna-cas9誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米自交系ca335幼胚，經(jīng)過篩選、分化，獲得完整的再分化植株。具體步驟如下：1、接種授粉后9～15d內(nèi)，當(dāng)玉米自交系ca335幼胚長到1.8～2.2mm時，取果穗，用70％(體積百分比)酒精消毒，每去1層皮用70％酒精棉消毒1次，待完全去皮后，用0.1％的升汞滅菌約10min。再用解剖刀自上而下逐行削去種皮和胚乳，用鑷子從子粒中上部挑出幼胚，加入步驟一制備的農(nóng)桿菌侵染液中，浸泡15～20min，此間要不時的搖動。浸泡完后，棄菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液。將盾片向上置于經(jīng)高壓滅菌盛有誘導(dǎo)培養(yǎng)基(將kn032830mg、nh4so4463mg、cacl2·2h2o166mg、mgso4·7h20185mg、kh2po4400mg、feso4·7h2027.8mg、znso4·7h201.6mg、mns04·4h204.4mg、h2bo30.8mg、ki1.6mg、甘氨酸2mg、煙酸0.5mg、鹽酸硫胺素1.0mg、鹽酸吡哆素0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g、脯氨酸1.38g、水解酪蛋白500mg和2,4-d2mg溶于1l蒸餾水，調(diào)節(jié)ph至5.8，121℃滅菌15min)的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于26℃培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)(約3～5d時小心去除長出的幼芽和根)，每隔3周繼代1次，共繼代3次。2、繼代步驟1接種后第11周，挑選胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織夾碎成2.5-3mm大小的小塊，按每瓶3塊愈傷的方式轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(將kn032830mg、nh4so4463mg、cacl2·2h2o166mg、mgso4·7h20185mg、kh2po4400mg、feso4·7h2027.8mg、znso4·7h201.6mg、mns04·4h204.4mg、h2bo30.8mg、ki1.6mg、甘氨酸2mg、煙酸0.5mg、鹽酸硫胺素1.0mg、鹽酸吡哆素0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g、脯氨酸690mg、水解酪蛋白100mg和甘露醇20mg溶于1l蒸餾水，調(diào)節(jié)ph至5.8，121℃滅菌15min)進行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：28℃、光暗交替培養(yǎng)(16小時光照/8小時黑暗；光照強度約為2000lx)。3、分化完成步驟2后，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基(將kn032830mg、nh4so4463mg、cacl2·2h2o166mg、mgso4·7h20185mg、kh2po4400mg、feso4·7h2027.8mg、znso4·7h201.6mg、mns04·4h204.4mg、h2bo30.8mg、ki1.6mg、甘氨酸2mg、煙酸0.5mg、鹽酸硫胺素1.0mg、鹽酸吡哆素0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g、脯氨酸690mg、水解酪蛋白100mg和kt1mg溶于1l蒸餾水，調(diào)節(jié)ph至5.8，121℃滅菌15min)進行再分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：28℃、光暗交替培養(yǎng)(16小時光照/8小時黑暗；光照強度約為2000lx)。4、完成步驟3后，依次進行抗性篩選(采用濃度為3mg/l的雙丙氨膦進行抗性篩選)和生根培養(yǎng)，得到再生植株，即為t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株。三、玉米糯性突變株的鑒定1、pcr擴增檢測1)待步驟二培育的t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的幼苗長到3～4葉時，取新鮮葉片放入干凈的研缽中，研缽需加液氮預(yù)冷，取來的葉片放入液氮中，然后用研杵將葉片研成粉末。2)取步驟1)得到的粉末，加入800μl的65℃預(yù)熱的ctab緩沖液(500ml的ctab提取緩沖液的制備方法：加入50ml濃度為1m，ph7.5的tris溶液，70ml濃度為5m的nacl溶液，50ml濃度為0.5m、ph8.0的edta溶液，5.0gctab，5.0ml濃度為14mβ-巰基乙醇溶液，325mlddh2o，現(xiàn)用現(xiàn)配)，迅速劇烈振蕩。65℃水浴加熱15min，水浴過程中要顛倒混勻幾次。水浴后，取出離心管，冷卻至室溫。3)完成步驟2)后，取所述離心管，加入800μl的氯仿：異戊醇(v：v＝24：1)混合液，輕輕倒轉(zhuǎn)搖動10min之后12000rpm離心10min，取上清。4)取步驟3)得到的上清，加入3μlrnase溶液，室溫下或37℃下溫浴0.5～1h。5)完成步驟4)后，取整體液相體系，加入800μl的氯仿：異戊醇(v：v＝24：1)混合液，輕輕倒轉(zhuǎn)搖動10min之后12000rpm離心10min，取上清，置于新的1.5ml的離心管中。6)完成步驟5)后，取所述離心管，加入0.7倍體積預(yù)冷(-80℃)的異丙醇，輕輕混勻至dna析出凝集，在12000rpm條件下離心10min，棄上清(小心dna倒出)。7)完成步驟6)后，取所述離心管，加入700μl的70％乙醇，洗滌1～2次。8)完成步驟7)后，取所述離心管，室溫晾干后加入50μl的ddh2o溶解dna，即為基因組dna。9)以步驟8)獲得的t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的基因組dna為模板，以人工合成的zmpolⅲca99-ubi-f1和zmpolⅲca99-ubi-r1為引物進行pcr擴增，pcr擴增產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外凝膠成像儀成像。pcr反應(yīng)程序：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。引物序列及pcr反應(yīng)體系詳見表1和表2。按照上述步驟1)-9)，將步驟二培育的t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的幼苗替換為玉米自交系ca335幼苗，其它步驟均不變，作為陰性對照。將上述步驟9)中t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的基因組dna替換為重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9，其它步驟均不變，作為陽性對照。表1.引物序列和擴增產(chǎn)物表2.pcr反應(yīng)體系配置組成成分用量(μl)10×pcrbufferi2.0dntp(2.5mm)1.6f1(10μm)0.4r1(10μm)0.4模板2.0rtaq(2.5u/ul)0.2ddh2o13.4total20.0實驗結(jié)果表明，以重組載體zmpolⅲca99-sgrna-cas9和步驟二獲得的t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的基因組dna為模板，獲得的pcr擴增產(chǎn)物中均含有seqidno.3自5’末端起第10047-10462位所示的416bp的dna片段，而玉米自交系ca335幼苗的基因組dna中不含有seqidno.3自5’末端起第10047-10462位所示的416bp的dna片段?？梢姡襟E二獲得的t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株均為陽性t0代擬轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株。2、突變類型的分子檢測為分析目標(biāo)序列的突變類型，以waxy1基因(seqidno.1所示，編碼seqidno.5所示的蛋白)cas9目標(biāo)序列為核心，以陽性t0代轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株幼苗的基因組dna為模板，使用人工合成的de(wx1)-f和de(wx1)-r為引物，進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。將pcr擴增產(chǎn)物與peasy-bluntsimplevector連接并轉(zhuǎn)化至transt1感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)并測序，統(tǒng)計突變類型并計算突變率。分子檢測所用引物如下：de(wx1)-f：catacttctccggaccatacgg；de(wx1)-r:taggggctgacggtgagg突變率＝全部轉(zhuǎn)化事件突變基因總數(shù)/全部轉(zhuǎn)化事件數(shù)＝(純合突變株數(shù)×2+雙等位基因突變株數(shù)×2+雜合突變株數(shù))/全部轉(zhuǎn)化事件數(shù)×100％。由于玉米是二倍體植株，當(dāng)cas9發(fā)揮作用開始剪切特定的基因時，同一個細胞內(nèi)的兩條同源染色體上的兩個等位基因都有可能被編輯，產(chǎn)生同樣類型或不同類型的突變，所以將一個植株中兩個等位基因看成是兩個基因編輯事件。純合突變株指的是該植株的兩條同源染色體的waxy1基因發(fā)生了相同的突變，雙等位基因突變株指的是該植株的兩條同源染色體的waxy1基因均發(fā)生了突變但突變形式不同，雜合突變株數(shù)指的是該植株的兩條同源染色體中的一條同源染色體的waxy1基因發(fā)生了突變、另一條同源染色體的waxy1基因未發(fā)生突變，野生型指的是該植株的兩條同源染色體中的waxy1基因均未發(fā)生突變。共檢測陽性t0代轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株34株，其中純合突變株數(shù)15株、發(fā)生編輯數(shù)為30次，雙等位基因突變株17株、發(fā)生編輯次數(shù)為34次，雜合突變株數(shù)為0株，野生型2株、發(fā)生編輯次數(shù)為0次，突變率為94％。純合突變和雙等位基因突變均記為突變體。統(tǒng)計編輯位點插入或缺失情況數(shù)目統(tǒng)計如圖2。根據(jù)編輯位點插入或缺失情況統(tǒng)計各類型突變所占的比例統(tǒng)計如圖3。玉米為二倍體植物，waxy1基因編碼的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶是控制玉米胚乳和花粉的直鏈淀粉合成。waxy1基因通過crespr/cas9核酸內(nèi)切酶編輯之后，可造成waxy1基因突變，當(dāng)兩條同源染色體的waxy1基因均發(fā)生突變時，可以導(dǎo)致gbssi酶活性喪失，胚乳直鏈淀粉合成受阻，胚乳中直鏈淀粉含量降低，從而改變淀粉的糊化和膨脹等特性形成具有糯性性狀的糯性玉米。3、籽粒糯性與非糯性性狀調(diào)查非糯性淀粉遇到碘水變藍原理：非糯性籽粒中淀粉既含有直鏈淀粉(占10％-30％)也有支鏈淀粉(占70％-90％)，直鏈淀粉在結(jié)構(gòu)上呈彎曲形式，并借助氫鍵的作用卷曲成螺旋狀，加入碘水后，碘分子便進入螺旋結(jié)構(gòu)中借助范德華力與直鏈淀粉聯(lián)系在一起，從而形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物可以吸收除了藍光以外的其他光，所以使非糯性淀粉呈現(xiàn)深藍色。糯性淀粉遇到碘水變黃褐色原理：糯性淀粉中支鏈淀粉含量幾乎占100％，直鏈淀粉也可以吸附碘，但是每個分支上的葡萄糖殘基吸附的碘數(shù)量較少，所以糯性淀粉呈現(xiàn)黃褐色。將玉米自交系ca335的花粉授予陽性t0代轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的雌花序，作正交，待玉米種子成熟后，獲得正交t1代籽粒。將陽性t0代轉(zhuǎn)zmpolⅲca99-sgrna-cas9基因植株的花粉授予玉米自交系ca335的雌花序，作反交，待玉米種子成熟后，獲得反交t1代籽粒。待測籽粒：正交t1代籽粒、反交t1代籽粒、白糯籽粒、黃糯籽?；蛴衩鬃越幌礳a335籽粒。(1)籽粒染色將待測籽粒剝?nèi)シN皮然后浸入碘液(含10％(質(zhì)量比)ki，5％(質(zhì)量比)i2的水溶液)10min，取出，觀察籽粒顏色。將待測籽粒不剝種皮作為對照。如果籽粒顏色為深藍色或偏黑色、則為非糯性籽粒，如籽粒為黃褐色或著色較淺、則為糯性。籽粒染色結(jié)果見圖4(r1為沒有剝?nèi)シN皮的籽粒，r2為剝?nèi)シN皮且浸在碘液10min后染色結(jié)果，l1為白糯籽粒，l2為黃糯籽粒，l3為玉米自交系ca335籽粒，l4、l6和l8為正交t1代籽粒，l5和l7為反交t1代籽粒。bar為2厘米)。結(jié)果表明，正交t1代籽粒和反交t1代籽粒中既有糯性籽粒又有非糯性籽粒。(2)淀粉粒染色將正交t1代籽粒、反交t1代籽粒、白糯籽?；蛴衩鬃越幌礳a335籽粒浸泡過夜，待胚乳松軟后切下背向胚側(cè)的一層3mm寬度的胚乳，磨碎，加入碘液，然后用普通光學(xué)顯微鏡觀察淀粉粒染色情況并統(tǒng)計t1代籽粒中糯性籽粒、非糯性籽粒和雜合型籽粒(即既有糯性淀粉粒又有非糯性淀粉粒的籽粒)的粒數(shù)。淀粉粒染色結(jié)果見圖5(a為玉米自交系ca335籽粒，b為白糯籽粒，c為玉米自交系ca335籽粒和白糯籽粒的淀粉?；旌系馊旧Y(jié)果，d為正交t1代籽粒中的非糯性籽粒，e為反交t1代籽粒中的糯性籽粒，f為正交t1代籽粒中的非糯性籽粒和反交t1代籽粒中的糯性籽粒的淀粉?；旌系馊旧Y(jié)果)。統(tǒng)計結(jié)果表明，正交t1代籽粒共計345顆，包括糯性籽粒53顆、非糯性籽粒214顆、雜合型籽粒78顆；反交t1代籽粒共計286顆，包括糯性籽粒103顆，非糯性籽粒129顆和雜合型籽粒54顆。當(dāng)前第1頁12