本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)傷口感染病原菌的引物組合及集成裝置。

背景技術(shù)：

由病原菌導(dǎo)致的傷口感染及傳染病目前仍是威脅全球人類健康的主要疾病，傷口感染和傳染病的控制主要從發(fā)現(xiàn)、診斷、治療和預(yù)防幾個(gè)方面進(jìn)行，其中病原菌的診斷對(duì)于盡早確認(rèn)、盡早控制傷口感染和傳染病非常重要。由病原菌導(dǎo)致的傷口感染診斷、感染性腹瀉診斷、進(jìn)出口食品和化妝品的檢驗(yàn)檢疫、流行病學(xué)調(diào)查等具有重要的社會(huì)意義，它們對(duì)病原菌檢測(cè)提出了更高的要求，如何實(shí)現(xiàn)病原菌的快速、準(zhǔn)確和高效的檢測(cè)是我國(guó)當(dāng)前面臨的重大課題。

目前我國(guó)對(duì)于病原菌的診斷主要依靠分離培養(yǎng)生化鑒定。但該方法存在如下不足：(1)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，難以及時(shí)滿足臨床需求，而盡早了解病原菌對(duì)于臨床治療至關(guān)重要；(2)難以檢出需要特殊培養(yǎng)的細(xì)菌，如某些厭氧或微需氧菌等；(3)易導(dǎo)致空氣中細(xì)菌對(duì)標(biāo)本的污染，致使假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)；(4)由于實(shí)驗(yàn)室保護(hù)條件的限制，實(shí)驗(yàn)室工作人員在分離病原菌時(shí)存在著被感染的高風(fēng)險(xiǎn)。

當(dāng)傷口(包括自然創(chuàng)口和手術(shù)切口)微生物污染達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)發(fā)生傷口部位的感染。傷口感染影響患者預(yù)后及延長(zhǎng)住院時(shí)間，監(jiān)測(cè)傷口感染細(xì)菌構(gòu)成與其耐藥性，對(duì)臨床預(yù)防和治療藥物選擇具有重要價(jià)值。

“民以食為天”。食品在生產(chǎn)、加工、貯存、運(yùn)輸和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能受到環(huán)境中病原菌的污染，而這些病原菌會(huì)導(dǎo)致各種食源性疾病，甚至死亡。近年來(lái)我國(guó)對(duì)外貿(mào)易發(fā)展迅速，各種食品的進(jìn)出口量迅猛增加，進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫面臨巨大壓力。同時(shí)由于食品保質(zhì)期的限制，對(duì)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫速度提出了更高的要求。

感染性腹瀉在我國(guó)發(fā)病率居各類傳染病之首，長(zhǎng)期以來(lái)嚴(yán)重危害人民健康，并具有發(fā)病急、傳播快等特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行快速診斷以確定傳染源是傳染病防治工作面臨的首要問(wèn)題。目前我國(guó)基層疾控單位采用的傳統(tǒng)檢測(cè)方法已不能滿足復(fù)雜多變的疫情處理工作。

為了判斷傷口是否被細(xì)菌感染、食品是否安全，預(yù)防和控制食源性傳染病的傳播以及快速診斷病原菌性食物中毒，必須要有一種能夠快速、準(zhǔn)確、及時(shí)、高效的檢測(cè)病原菌的方法。

隨著免疫學(xué)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，免疫熒光技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、基因探針技術(shù)和pcr技術(shù)等已被應(yīng)用于病原菌檢測(cè)領(lǐng)域。這些技術(shù)靈敏度高、 特異性強(qiáng)，在微生物檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。然而，這些檢測(cè)技術(shù)一次實(shí)驗(yàn)一般只能檢測(cè)一種微生物，而致病菌種類很多，尚不能滿足實(shí)際檢測(cè)工作的需要。

鏈置換技術(shù)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)主要利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶序列上6個(gè)特定區(qū)域，并利用一種具有鏈置換活性的dna聚合酶(bst酶)，在恒溫條件下快速擴(kuò)增核酸，保證了擴(kuò)增的高特異性和高效率。由于鏈置換技術(shù)獨(dú)特的核酸擴(kuò)增機(jī)制，它的產(chǎn)物是由多個(gè)重復(fù)靶序列的莖環(huán)狀dna和花椰菜狀dna所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳中會(huì)呈現(xiàn)出鏈置換反應(yīng)典型的階梯狀條帶；同時(shí)，核酸大量生成時(shí)，從dntps中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的擴(kuò)增反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀；另外，由于擴(kuò)增產(chǎn)物大量生成，加入熒光染料(如sybrgreen和evagreen)后，可在紫外燈下觀察到明顯熒光。因此，鏈置換反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果不但觀察方式多樣，且結(jié)果鑒定簡(jiǎn)便，非常適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

鑒于鏈置換技術(shù)具有眾多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)。但目前已有的方法只能在一個(gè)系統(tǒng)中針對(duì)某一種致病菌進(jìn)行檢測(cè)，在需要快速篩查多個(gè)致病菌時(shí)，需要分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，仍有較大的工作量。

生物芯片技術(shù)是九十年代建立的一種全新的分析檢測(cè)技術(shù)，它伴隨著人類基因組計(jì)劃的開展逐步發(fā)展起來(lái)。該技術(shù)綜合運(yùn)用了分子生物學(xué)技術(shù)、集成電路制造技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、共聚焦激光掃描技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)等，使樣品的檢測(cè)具有敏感度高、特異性強(qiáng)、大規(guī)模集成化、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)便、快速、高效率等優(yōu)點(diǎn)。目前，生物芯片技術(shù)主要應(yīng)用于生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究和生物制藥等方面。利用生物芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原菌的快速檢測(cè)鑒定也是一個(gè)蓬勃發(fā)展的科研領(lǐng)域，在臨床醫(yī)療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)傷口感染病原菌的引物組合及集成裝置。

本發(fā)明首先保護(hù)一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物組ⅰ、引物組ⅱ和引物組ⅲ組成；

(a2)由所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ、所述引物組ⅲ中的任意兩個(gè)組成；

(a3)所述引物組ⅰ或所述引物組ⅱ或所述引物組ⅲ；

所述引物組ⅰ由引物a1、引物a2、引物a3、引物a4、引物a5和引物a6組成；

所述引物a1為如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；

(b2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物a2為如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；

(b4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的dna分子；

所述引物a3為如下(b5)或(b6)；

(b5)序列表的序列3所示的單鏈dna分子；

(b6)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的dna分子；

所述引物a4為如下(b7)或(b8)；

(b7)序列表的序列4所示的單鏈dna分子；

(b8)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的dna分子；

所述引物a5為如下(b9)或(b10)；

(b9)序列表的序列5所示的單鏈dna分子；

(b10)將序列5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的dna分子；

所述引物a6為如下(b11)或(b12)；

(b11)序列表的序列6所示的單鏈dna分子；

(b12)將序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的dna分子；

所述引物組ⅱ由引物b1、引物b2、引物b3、引物b4、引物b5和引物b6組成；

所述引物b1為如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列7所示的單鏈dna分子；

(c2)將序列7經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的dna分子；

所述引物b2為如下(c3)或(c4)；

(c3)序列表的序列8所示的單鏈dna分子；

(c4)將序列8經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的dna分子；

所述引物b3為如下(c5)或(c6)；

(c5)序列表的序列9所示的單鏈dna分子；

(c6)將序列9經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的dna分子；

所述引物b4為如下(c7)或(c8)；

(c7)序列表的序列10所示的單鏈dna分子；

(c8)將序列10經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的dna分子；

所述引物b5為如下(c9)或(c10)；

(c9)序列表的序列11所示的單鏈dna分子；

(c10)將序列11經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的dna分子；

所述引物b6為如下(c11)或(c12)；

(c11)序列表的序列12所示的單鏈dna分子；

(c12)將序列12經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的dna分子；

所述引物組ⅲ由引物c1、引物c2、引物c3、引物c4、引物c5和引物c6組成；

所述引物c1為如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列13所示的單鏈dna分子；

(d2)將序列13經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的dna分子；

所述引物c2為如下(d3)或(d4)；

(d3)序列表的序列14所示的單鏈dna分子；

(d4)將序列14經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的dna分子；

所述引物c3為如下(d5)或(d6)；

(d5)序列表的序列15所示的單鏈dna分子；

(d6)將序列15經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的dna分子；

所述引物c4為如下(d7)或(d8)；

(d7)序列表的序列16所示的單鏈dna分子；

(d8)將序列16經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的dna分子；

所述引物c5為如下(d9)或(d10)；

(d9)序列表的序列17所示的單鏈dna分子；

(d10)將序列17經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的dna分子；

所述引物c6為如下(d11)或(d12)；

(d11)序列表的序列18所示的單鏈dna分子；

(d12)將序列18經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的dna分子。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(g1)或(g2)：

(g1)鑒定傷口感染病原菌；

(g2)用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有哪種或哪幾種傷口感染病原菌。

所述傷口感染病原菌為創(chuàng)傷弧菌和/或溶藻弧菌和/或金黃色葡萄球菌。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(g1)或(g2)：

(g1)鑒定傷口感染病原菌；

(g2)用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有哪種或哪幾種傷口感染病原菌。

所述試劑盒還可包括反應(yīng)試劑。所述反應(yīng)試劑包括dntps、dutp、ung、evagreen、bsa、dtt、bstdnapolymerasebuffer、tris-hcl、mgso4、m-mlvreversetranscriptase、rnasinplus、bstdnapolymerase和betaine中一種或任意組合。

所述反應(yīng)試劑具體可為鏈置換擴(kuò)增試劑。鏈置換擴(kuò)增試劑(26微升體系)具體為：含5.0ubst酶,0.3mmdutp,0.2mmdntps,0.1mg/mlbsa,1×evagreen,2.0mbetaine,10mmmgso4,0.5u/mluracil-dnaglycosylase，余量為水。

所述試劑盒還可包括反應(yīng)載體。所述反應(yīng)載體具體可為適合進(jìn)行微納升體系(1nl-10μl)的反應(yīng)的容器。所述反應(yīng)載體具體可為微流體芯片、微陣列芯片、ep管、96孔板或384孔板等。

所述微流體芯片包括芯片底座、薄膜膠層和蓋片，所述芯片底座上部通過(guò)所述薄膜膠層與所述蓋片粘貼在一起，并沖壓緊密壓合成一體；

位于所述芯片底座上，在所述芯片底座中心設(shè)置一中心定位孔，位于所述中心定位孔周圍的底座上設(shè)置有一條以上的微流控通道，每條所述微流控通道均包括一波浪形的微管道，所述微管道各波峰均遠(yuǎn)離所述中心定位孔，各波谷鄰近所述中心定位孔，在所述微管道的每一波峰位置處均連接有一反應(yīng)池；所述微管道一端均設(shè)置有進(jìn)樣孔，所述微管道的另一端均設(shè)置出氣孔，緊鄰所述出氣孔的微通道上設(shè)置有一緩沖通道。

所述傷口感染病原菌為創(chuàng)傷弧菌和/或溶藻弧菌和/或金黃色葡萄球菌。

本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)菌是否為創(chuàng)傷弧菌或溶藻弧菌或金黃色葡萄球菌的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)菌的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，分別所述引物組合中的每個(gè)引物組 進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行如下判斷：

如果采用所述引物組ⅰ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為創(chuàng)傷弧菌；

如果采用所述引物組ⅱ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為溶藻弧菌；

如果采用所述引物組?？梢詫?shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為金黃色葡萄球菌。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有傷口感染病原菌的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本的總dna；

(2)以步驟(1)提取的總dna為模板，分別采用所述引物組合中的每個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行如下判斷：

如果采用所述引物組ⅰ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有創(chuàng)傷弧菌；

如果采用所述引物組ⅱ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有溶藻弧菌；

如果采用所述引物組?？梢詫?shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有金黃色葡萄球菌。

所述傷口感染病原菌為創(chuàng)傷弧菌和/或溶藻弧菌和/或金黃色葡萄球菌。

所述待測(cè)樣本具體可為傷口分泌物、排泄物、腸積液、嘔吐物、土壤、水樣、食品或化妝品等。

本發(fā)明還保護(hù)包埋有所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ和所述引物組ⅲ的微流體芯片；

所述微流體芯片包括芯片底座、薄膜膠層和蓋片，所述芯片底座上部通過(guò)所述薄膜膠層與所述蓋片粘貼在一起，并沖壓緊密壓合成一體；

位于所述芯片底座上，在所述芯片底座中心設(shè)置一中心定位孔，位于所述中心定位孔周圍的底座上設(shè)置有一條以上的微流控通道，每條所述微流控通道均包括一波浪形的微管道，所述微管道各波峰均遠(yuǎn)離所述中心定位孔，各波谷鄰近所述中心定位孔，在所述微管道的每一波峰位置處均連接有一反應(yīng)池；所述微管道一端均設(shè)置有進(jìn)樣孔，所述微管道的另一端均設(shè)置出氣孔，緊鄰所述出氣孔的微通道上設(shè)置有一緩沖通道；

所述微流體芯片中，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有所述引物組ⅰ中的各條引物，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有所述引物組ⅱ中的各條引物，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有所述引物組ⅲ中的各條引物，上述三個(gè)引物組分別包埋在不同的反應(yīng)池內(nèi)。

一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)，引物a1和引物a2各包埋0.01nmol、引物a3和引物a4各包埋5nmol、 引物a5和引物a6各包埋0.05nmol。一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)，引物b1和引物b2各包埋0.01nmol、引物b3和引物b4各包埋5nmol、引物b5和引物b6各包埋0.05nmol。一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)，引物c1和引物c2各包埋0.01nmol、引物c3和引物c4各包埋5nmol、引物c5和引物c6各包埋0.05nmol。

所述微流體芯片中，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有陽(yáng)性質(zhì)控，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有陰性質(zhì)控，陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控與所述三個(gè)引物組分別包埋在不同的反應(yīng)池內(nèi)。

陽(yáng)性質(zhì)控為能產(chǎn)生熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品指標(biāo)核酸探針，陰性質(zhì)控為不能產(chǎn)生熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品指標(biāo)探針或者是空白探針。

在各反應(yīng)池內(nèi)可以采用低聚糖或低熔點(diǎn)生物相融性材料進(jìn)行引物包埋。

所述陽(yáng)性質(zhì)控具體可為釀酒酵母，accc20034。所述陰性質(zhì)控具體可為1g/100ml的瓊脂糖水溶液。

本發(fā)明還保護(hù)一種用于同時(shí)檢測(cè)多種傷口感染病原菌的檢測(cè)集成裝置，其特征在于包括如下部件：以上任一所述的包埋有所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ和所述引物組ⅲ的微流體芯片。

所述檢測(cè)集成裝置還包括如下部件：檢測(cè)集成裝置硬件；

所述檢測(cè)集成裝置硬件包括光學(xué)檢測(cè)模塊、加熱溫控模塊、運(yùn)動(dòng)控制模塊、信號(hào)處理系統(tǒng)、微流體芯片；所述微流體芯片在所述運(yùn)動(dòng)控制模塊驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，由所述信號(hào)處理系統(tǒng)向所述運(yùn)動(dòng)控制模塊傳輸運(yùn)動(dòng)控制信號(hào)；所述微流控芯片周圍設(shè)置所述加熱溫控模塊，所述加熱溫控模塊連接至所述信號(hào)處理系統(tǒng)，由所述信號(hào)處理系統(tǒng)控制所述加熱溫控模塊的輸出溫度；位于所述微流體芯片上方還設(shè)置有所述光學(xué)檢測(cè)模塊，所述光學(xué)檢測(cè)模塊將采集到的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)信號(hào)傳輸至所述信號(hào)處理系統(tǒng)。

反應(yīng)平臺(tái)及檢測(cè)平臺(tái)主要包括水浴鍋、熒光定量pcr儀、微納升體系流體芯片檢測(cè)系統(tǒng)和普通pcr儀。產(chǎn)物檢測(cè)方法包括用凝膠電泳顯示所述擴(kuò)增產(chǎn)物、用熒光掃描顯示所述擴(kuò)增產(chǎn)物、用染料sybrgreen或evagreen顯示所述擴(kuò)增產(chǎn)物、通過(guò)生成焦磷酸鎂白色沉淀顯示所述擴(kuò)增產(chǎn)物、通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液濁度變化檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述檢測(cè)集成裝置還包括如下組件：反應(yīng)試劑。

所述反應(yīng)試劑包括dntps、dutp、ung、evagreen、bsa、dtt、bstdnapolymerasebuffer、tris-hcl、mgso4、m-mlvreversetranscriptase、rnasinplus、bstdnapolymerase和betaine中一種或任意組合。

所述反應(yīng)試劑具體可為鏈置換擴(kuò)增試劑。鏈置換擴(kuò)增試劑(26微升體系)具體為：含5.0ubst酶,0.3mmdutp,0.2mmdntps,0.1mg/mlbsa,1×evagreen,2.0mbetaine,10mmmgso4,0.5u/mluracil-dnaglycosylase，余量為水。

本發(fā)明提供的引物組合及集成裝置的優(yōu)勢(shì)：快速、并行、低樣品試劑消耗。

本發(fā)明克服了目前ep管、孔板方法只能在一個(gè)單元體系中針對(duì)單一種病原菌進(jìn)行檢測(cè)，而不能同時(shí)對(duì)多種病原菌進(jìn)行快速鑒定判斷的缺陷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)每個(gè)引物組應(yīng)用八個(gè)區(qū)段，六條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，特異性強(qiáng)。

(2)利用本發(fā)明的多種病原菌快速檢測(cè)引物組，能在同一反應(yīng)體系中和同一反應(yīng)溫度條件下，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)，同一檢測(cè)樣品的dna提取液中只要含有這3種病原菌的基因組dna中的一種或幾種，即可快速檢測(cè)、準(zhǔn)確判斷出來(lái)，從而克服現(xiàn)有技術(shù)只能在一個(gè)封閉反應(yīng)系統(tǒng)中檢測(cè)單一種致病菌指標(biāo)、而不能同時(shí)對(duì)多種致病菌進(jìn)行檢測(cè)的缺陷，大大提高檢測(cè)效率。

(3)本發(fā)明的快速檢測(cè)方法整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程最快可在50min內(nèi)完成，產(chǎn)物擴(kuò)增效率高，對(duì)上述3種致病菌的檢測(cè)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。

(4)本發(fā)明的快速檢測(cè)方法中，鏈置換反應(yīng)擴(kuò)增可在恒定溫度下完成，且允許的溫度波動(dòng)范圍較大(±1.5℃)，因此對(duì)溫控的儀器設(shè)備要求不高，水浴鍋、板式加熱器、熒光定量pcr儀、微納升體系流體芯片檢測(cè)系統(tǒng)和普通pcr儀均可滿足要求。

(5)本發(fā)明的快速檢測(cè)方法靈敏度高，3種致病菌的陽(yáng)性擴(kuò)增檢出結(jié)果最低限優(yōu)于10拷貝/反應(yīng)體系基因組dna。

(6)本發(fā)明的快速檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求低、適應(yīng)性較強(qiáng)，且判定方法簡(jiǎn)便，可采用觀察電泳條帶、觀察濁度或觀察熒光等不同方法判定結(jié)果。

(7)與常規(guī)的平板培養(yǎng)法相比，本發(fā)明的快速檢測(cè)方法可大大縮短檢測(cè)周期，減少檢測(cè)環(huán)節(jié)，從而降低因檢測(cè)環(huán)節(jié)過(guò)多或人員技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)差異造成的誤判的幾率，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，并可為傷口感染、感染性腹瀉診斷、食品安全突發(fā)事件的處置、食品和化妝品檢驗(yàn)檢疫提供重要的技術(shù)支持。

本發(fā)明可以達(dá)到的具體性能指標(biāo)如下：

1、系統(tǒng)適應(yīng)的微流體腔體樣品檢測(cè)范圍為1nl-10μl。

2、系統(tǒng)檢測(cè)的靈敏度對(duì)應(yīng)被測(cè)樣品10個(gè)分子拷備數(shù)/體系。

3、系統(tǒng)溫度控制范圍0℃-100℃，等溫?cái)U(kuò)增應(yīng)用的可控有效擴(kuò)增溫度范圍為50℃-65℃，溫控精度0.1℃。

4、系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)的實(shí)時(shí)采樣頻率范圍≤200khz。

5、系統(tǒng)適應(yīng)的微流體芯片幾何形狀大小為直徑(或邊長(zhǎng))1mm-200mm，厚度0.1mm-100mm。

6、系統(tǒng)并行檢測(cè)病原菌指標(biāo)≥3個(gè)，包括但不限于創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌。

本發(fā)明涉及一種多種傷口感染病原菌快速并行檢測(cè)方法，以檢測(cè)包括創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌。本發(fā)明還涉及所述傷口感染病原菌檢測(cè)用引物組及試劑，微流體芯片和集成檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，使用微量樣本即可實(shí)現(xiàn)多種傷口感染病原菌快速、準(zhǔn)確、高效的并行檢測(cè)，靈敏度達(dá)到10核酸片段拷貝/指標(biāo)。本發(fā)明可以用于傷口感染病原菌檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有較大的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明的微流控芯片封裝示意圖。

圖3為本發(fā)明的便攜式微流控芯片病原菌檢測(cè)集成裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為本發(fā)明的臨床樣本檢測(cè)結(jié)果圖示。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。瓊脂糖：biowest，132030。accc的全稱為中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，網(wǎng)址為http://www.accc.org.cn/htdocs/pages.asp？id＝3。創(chuàng)傷弧菌：accc01745。溶藻弧菌：accc02676。金黃色葡萄球菌：accc01332。

實(shí)施例1、制備各個(gè)引物組

用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的引物組由如下六條引物組成(5’→3’)：

引物a1(序列表的序列1)：acaacgatctctgcctaga；

引物a2(序列表的序列2)：ccaataccatttctgtgctaag；

引物a3(序列表的序列3)：tgacagctccagccgttaacttatggtgagaacggtgacaa；

引物a4(序列表的序列4)：cgtagccgagtggcatcccgcaccacactgttcga；

引物a5(序列表的序列5)：aaccacccgcaaccg；

引物a6(序列表的序列6)：ttgaccgtaaacgcagacaaaa。

用于檢測(cè)溶藻弧菌的引物組由如下六條引物組成(5’→3’)：

引物b1(序列表的序列7)：tgaggtcatcatcactatgg；

引物b2(序列表的序列8)：aaatcgcctaaagctttgg；

引物b3(序列表的序列9)：tgggcgtattgatcattccaacgagcttgcagcacgcgtact；

引物b4(序列表的序列10)：cggttaacggtgttttcactattttgtccgtttggttgccaat；

引物b5(序列表的序列11)：ccactgggtcacttgcggta；

引物b6(序列表的序列12)：gggcagtggaacgagca；

用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物組由如下六條引物組成(5’→3’)：

引物c1(序列表的序列13)：gtgcctttacagatagcatg；

引物c2(序列表的序列14)：gaaaaagtgtacgagttcttga；

引物c3(序列表的序列15)：gtttcataaccttcagcaagctttccatacagtcatttcacgca；

引物c4(序列表的序列16)：gaggtcattgcagcttgcttacttcgatcactggaccgcg；

引物c5(序列表的序列17)：aactcatagtggccaaca；

引物c6(序列表的序列18)：gtacctgttatgaaagtgttca。

用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的引物組命名為引物組ⅰ，用于檢測(cè)溶藻弧菌的引物組命名為引物組ⅱ，用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物組命名為引物組ⅲ。

實(shí)施例2、制備微納升體系流體芯片

如圖1所示，微流體芯片mc采用三層夾心結(jié)構(gòu)，其包括芯片底座bc、薄膜膠層jm和蓋片gp，芯片底座bc上部通過(guò)薄膜膠層jm與蓋片gp粘貼在一起，并沖壓緊密壓合成一體。其中，薄膜膠層jm具有雙面膠合特性，厚度≤10μm；底座bc、蓋片gp為透明材料，厚度≤1mm。

如圖2所示，位于芯片底座bc上，在芯片底座bc中心設(shè)置一中心定位孔zx，中心定位孔zx的邊緣設(shè)置一定位凹槽。位于中心定位孔zx周圍的底座上設(shè)置有一條以上的微流控通道，每條微流控通道均包括一波浪形的微管道m(xù)t，微管道m(xù)t的各波峰均遠(yuǎn)離中心定位孔zx，各波谷鄰近中心定位孔zx，在微管道m(xù)t的每一波峰位置處均連接有一反應(yīng)池t。微管道m(xù)t的一端均設(shè)置有進(jìn)樣孔ik，進(jìn)樣孔ik與移液器槍頭緊密配合，在進(jìn)樣過(guò)程中通過(guò)預(yù)置一段空氣柱在移液器頂端，來(lái)保證微流控芯片加樣結(jié)束拔出移液器槍頭后，進(jìn)樣孔ik沒(méi)有液體泄露，有利于進(jìn)樣孔的密封；微管道m(xù)t的另一端均設(shè)置出氣孔ck，緊鄰出氣孔ck的微通道m(xù)t上設(shè)置有一緩沖通道bt，用于收集多余液體，保證出氣孔ck在進(jìn)樣中沒(méi)有液體泄露，有利于出氣孔ck的密封。至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有引物組ⅰ中的各條引物，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有引物組ⅱ中的各條引物，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有引物組ⅲ中的各條引物，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有陽(yáng)性質(zhì)控pt，至少一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有陰性質(zhì)控nt。陽(yáng)性質(zhì)控為能產(chǎn)生熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品指標(biāo)核酸探針，陰性質(zhì)控為不能產(chǎn)生熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品指標(biāo)探針或者是空白探針，通過(guò)陽(yáng)性質(zhì)控pt和陰性質(zhì)控nt對(duì)核酸特異性檢測(cè)識(shí)別結(jié)果進(jìn)行有效性指示。其中，在各反應(yīng)池內(nèi)可以采用低聚糖或低熔點(diǎn)生物相融性材料進(jìn)行引物包埋。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，芯片直徑為60mm左右，進(jìn)樣孔ik和出氣孔ck直徑均為1mm左右，適合用移液器槍頭向芯片注入樣品和試劑。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，微流體芯片可以根據(jù)使用要求設(shè)置成不同形狀，例如圓形、橢圓形等。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，芯片底座bc采用普通機(jī)械加工或注塑加工制成，并采用超聲、低濃度酒精和純凈水等清洗干凈。

用于進(jìn)行實(shí)施例4和實(shí)施例5的微納升體系流體芯片具體如下：

采用一條微流控通道，該微流控通道上設(shè)置有12個(gè)反應(yīng)池，按照由進(jìn)樣孔至出氣孔的方向，第四個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有引物組ⅰ中的各條引物(引物a1和引物a2各0.01nmol、引物a3和引物a4各5nmol、引物a5和引物a6各0.05nmol)，第六個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有引物組ⅱ中的各條引物(引物b1和引物b2各0.01nmol、引物b3和引物b4各5nmol、引物b5和引物b6各0.05nmol)，第八個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有引物組ⅲ中的各條引物(引物c1和引物c2各0.01nmol、引物c3和引物c4各5nmol、引物c5和引物c6各0.05nmol)，第十個(gè)反應(yīng)池內(nèi)包埋有陽(yáng)性質(zhì)控(陽(yáng)性質(zhì)控即釀酒酵母，accc20034，每個(gè)反應(yīng)池包埋100ng)，剩余的反應(yīng)池內(nèi)均包埋有陰性質(zhì)控(陰性質(zhì)控即1g/100ml的瓊脂糖水溶液，每個(gè)反應(yīng)池包埋2μl)。

實(shí)施例3、微納升體系流體芯片檢測(cè)集成裝置

如圖3所示，微納升體系流體芯片檢測(cè)集成裝置硬件包括光學(xué)檢測(cè)模塊ods、加熱溫控模塊pid、運(yùn)動(dòng)控制模塊mcd、信號(hào)處理系統(tǒng)sps、微流體芯片mc。微流體芯片mc通過(guò)中心定位孔zx固定在運(yùn)動(dòng)控制模塊mcd上，并通過(guò)運(yùn)動(dòng)控制模塊mcd控制其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；微流控芯片mc周圍設(shè)置加熱溫控模塊pid，微流控芯片mc與加熱溫控模塊pid之間保持亞毫米的空氣層，加熱溫控模塊pid電連接至信號(hào)處理系統(tǒng)sps；在微流體芯片mc上方還設(shè)置有光學(xué)檢測(cè)模塊ods，光學(xué)檢測(cè)模塊ods與信號(hào)處理系統(tǒng)sps連接。光學(xué)檢測(cè)模塊ods將采集到的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)信號(hào)傳輸至信號(hào)處理系統(tǒng)sps；信號(hào)處理系統(tǒng)sps將運(yùn)動(dòng)控制信號(hào)傳輸至運(yùn)動(dòng)控制模塊mcd，運(yùn)動(dòng)控制模塊mcd根據(jù)接收到的運(yùn)動(dòng)控制信號(hào)控制旋轉(zhuǎn)速度，帶動(dòng)微流控芯片mc轉(zhuǎn)動(dòng)；同時(shí)，信號(hào)處理系統(tǒng)sps將溫度控制信號(hào)輸送至加熱溫控模塊pid，加熱溫控模塊pid根據(jù)接收到的溫度控制信號(hào)控制對(duì)微流體芯片mc的加熱溫度。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，加熱溫控模塊pid根據(jù)接收到的溫度控制信號(hào)可以保證微流體芯片mc為恒定溫度(如65℃)或?yàn)橹芷谘h(huán)性變溫(例如：94℃高溫15秒鐘→60℃低溫30秒鐘→72℃溫度45秒鐘；例如：94℃高溫15秒鐘→60℃低溫30秒鐘→72℃溫度45秒鐘)，滿足等溫鏈置換反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的溫控要求。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，光學(xué)檢測(cè)模塊ods采用白光成像或單色激發(fā)光誘導(dǎo)熒光或光吸收等方法，通過(guò)凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物或激發(fā)光誘導(dǎo)熒光顯示擴(kuò)增產(chǎn)物或生成 焦磷酸鎂白色沉淀顯示擴(kuò)增產(chǎn)物或通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液濁度變化檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，反應(yīng)載體mc可以為微流控芯片、微陣列芯片、pcr管、96孔板或384孔板等。

本發(fā)明提供的微流控芯片mc和微納升體系流體芯片檢測(cè)集成裝置組合使用，可進(jìn)行多種傷感細(xì)菌快速并行分子診斷。

實(shí)施例4、集成裝置的應(yīng)用

待測(cè)樣本分別為創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌或金黃色葡萄球菌。

1、樣品處理

取0.1克待測(cè)樣本，置于裝有1l營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、100rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。

2、dna抽提

(1)完成步驟1后，取1ml培養(yǎng)體系，先置于冰浴中靜置孵育5分鐘，然后在室溫下3000rpm離心10分鐘，收集上清液。

(2)取步驟(1)得到的上清液，在室溫下10000rpm離心5分鐘，收集沉淀。

(3)將步驟(2)得到的沉淀轉(zhuǎn)移至ep管(裝有1毫升粒徑為0.5mm的玻璃珠)中，加入50μl1×te(ph8.0)，在室溫下10000rpm振蕩15分鐘，然后12000rpm離心5min，收集上清液，-20℃保存。

3、制備反應(yīng)混合液

將鏈置換擴(kuò)增試劑與步驟2的(3)得到的上清液等體積混合，得到52μl的反應(yīng)混合液。步驟2的(3)得到的上清液即為模板dna溶液，26微升模板dna溶液中模板dna的濃度為1000個(gè)拷貝數(shù)/μl。

鏈置換擴(kuò)增試劑(26微升體系)：含5.0ubst酶(neb，m0275l),0.3mmdutp(fermentas，r0133),0.2mmdntps(neb，4030),0.1mg/mlbsa(經(jīng)科宏達(dá),5004),1×evagreen(上海開放科技，31000),2.0mbetaine(sigma，14300),10mmmgso4,0.5u/mluracil-dnaglycosylase(fermentas，en0362)，余量為水。

4、將52微升步驟3得到的反應(yīng)混合液從進(jìn)樣口注入微納升體系流體芯片中，用封口膜密封進(jìn)樣口和出樣口，形成密閉反應(yīng)體系。

5、完成步驟4后，將微納升體系流體芯片置于微納升體系流體芯片檢測(cè)集成裝置上，設(shè)置反應(yīng)程序如下：37℃反應(yīng)3分鐘，65℃反應(yīng)47分鐘。

反應(yīng)過(guò)程中，微納升體系流體芯片檢測(cè)集成裝置將實(shí)時(shí)檢測(cè)顯示熒光信號(hào)。

待測(cè)樣本為金黃色葡萄球菌時(shí)的熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)結(jié)果見圖4。只有包埋有引物組ⅲ的第八個(gè)反應(yīng)池和包埋陽(yáng)性質(zhì)控的第十個(gè)反應(yīng)池顯示陽(yáng)性的擴(kuò)增曲線，其他反應(yīng)池均 顯示為陰性。

待測(cè)樣本為創(chuàng)傷弧菌時(shí)，只有包埋有引物組ⅰ的第四個(gè)反應(yīng)池和包埋陽(yáng)性質(zhì)控的第十個(gè)反應(yīng)池顯示陽(yáng)性的擴(kuò)增曲線，其他反應(yīng)池均顯示為陰性。

待測(cè)樣本為溶藻弧菌時(shí)，只有包埋有引物組ⅱ的第六個(gè)反應(yīng)池和包埋陽(yáng)性質(zhì)控的第十個(gè)反應(yīng)池顯示陽(yáng)性的擴(kuò)增曲線，其他反應(yīng)池均顯示為陰性。

進(jìn)行六次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果均與上述結(jié)果一致。

通過(guò)16sdna測(cè)序方法檢測(cè)各個(gè)待測(cè)樣本，結(jié)果與上述結(jié)果一致。

實(shí)施例5、集成裝置的靈敏度

待測(cè)樣本分別為創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌或金黃色葡萄球菌。

1、樣品處理

同實(shí)施例4的步驟1。

2、dna抽提

同實(shí)施例4的步驟2。

3、取步驟2得到的上清液，采用1×te(ph8.0)進(jìn)行梯度稀釋，得到各個(gè)稀釋液。

4、制備反應(yīng)混合液

將鏈置換擴(kuò)增試劑與步驟3得到的稀釋液等體積混合，得到52μl的反應(yīng)混合液。26微升步驟3得到的稀釋液中模板dna的濃度分別為10、100、1000或10000個(gè)拷貝數(shù)/μl。

鏈置換擴(kuò)增試劑的配方同實(shí)施例4的步驟3。

5、將52微升步驟4得到的反應(yīng)混合液從進(jìn)樣口注入微納升體系流體芯片中，用封口膜密封進(jìn)樣口和出樣口，形成密閉反應(yīng)體系(每個(gè)反應(yīng)池內(nèi)的反應(yīng)體系的體積約為1-2μl)。

6、完成步驟5后，將微納升體系流體芯片置于微納升體系流體芯片檢測(cè)集成裝置上，設(shè)置反應(yīng)程序如下：37℃反應(yīng)3分鐘，65℃反應(yīng)47分鐘。

檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的靈敏度為10個(gè)拷貝數(shù)/體系(體系指的是反應(yīng)池中的體系)。

檢測(cè)溶藻弧菌的靈敏度為10個(gè)拷貝數(shù)/體系(體系指的是反應(yīng)池中的體系)。

檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度為10個(gè)拷貝數(shù)/體系(體系指的是反應(yīng)池中的體系)。