本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域和作物遺傳育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及用于培育轉(zhuǎn)基因玉米的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
玉米是我國(guó)重要的糧食作物和飼料作物，在我國(guó)糧食生產(chǎn)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。然而自2010年以來(lái)，我國(guó)已從玉米凈出口國(guó)轉(zhuǎn)變?yōu)閮暨M(jìn)口國(guó)。2012年我國(guó)進(jìn)口玉米521萬(wàn)噸，價(jià)值17億美元。因此，通過(guò)育種技術(shù)的應(yīng)用提高玉米產(chǎn)量，掌握玉米產(chǎn)業(yè)主動(dòng)權(quán)是保持國(guó)內(nèi)玉米供需平衡的關(guān)鍵，也將對(duì)我國(guó)糧食安全和應(yīng)對(duì)可能出現(xiàn)的糧食危機(jī)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多優(yōu)于傳統(tǒng)育種技術(shù)的新型育種技術(shù)不斷涌現(xiàn)。傳統(tǒng)育種技術(shù)周期長(zhǎng)，需要不斷地回交才能獲得純合后代。生物技術(shù)育種很大程度上縮短了育種周期，因而得到了較快發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種便是其中的一種。在轉(zhuǎn)化方法方面，除了基因槍法，還包括電擊法、超聲波法、微注射法、peg法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率較高，費(fèi)用低，且導(dǎo)入的外源基因多為單拷貝，是目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)化方法。
在玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)上，直到80年代后期才在遺傳轉(zhuǎn)化方面取得突破。1975年第一例玉米自交系(a188)轉(zhuǎn)化再生植株見(jiàn)于報(bào)道。1988年，klein等人以玉米的胚狀體和非胚狀體細(xì)胞為外植體，用基因槍法轉(zhuǎn)移cat基因，觀察到瞬時(shí)表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法直到1996年才成功用于轉(zhuǎn)化玉米自交系a188。除了轉(zhuǎn)化方法的限制，基因型也是限制玉米遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展的重要因素。因此，開(kāi)發(fā)適合商業(yè)化生產(chǎn)的玉米品種的高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因方法，對(duì)于掌握轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)主動(dòng)權(quán)具有至關(guān)重要的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供用于培育轉(zhuǎn)基因玉米的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的用于培育轉(zhuǎn)基因玉米的培養(yǎng)基組合，包括共培養(yǎng)培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基；
其中，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加naa(萘乙酸)、tdz(噻二唑苯基脲)和/或kt(6-糠基氨基嘌呤)，它們的終濃度分別為0.5-1.0mg/l、0.005-0.05mg/l、0-0.1mg/l；優(yōu)選地，tdz和naa終濃度分別為0.005mg/l和0.5mg/l，kt的終濃度為0.1mg/l。
所述篩選培養(yǎng)基中添加有草丁膦，其終濃度為5-200mg/l，優(yōu)選10-40mg/l，更優(yōu)選20mg/l。
所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如下：ms鹽0.8-1.2g/l+n6鹽0.8-1.5g/l+蔗糖15-30g/l+葡萄糖5-15g/l+脯氨酸0.1-0.3g/l+鹽酸硫胺素0.1-1mg/l+agno3(硝酸銀)10-20μm+l-半胱氨酸100-500mg/l+2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)1-1.5mg/l+naa0.5-1.0mg/l+tdz0.005-0.05mg/l和/或kt0-0.1mg/l+乙酰丁香酮100-500μm+mes(2-嗎啉乙磺酸)0.5-1g/l+1000×ms維生素1ml/l+植物凝膠6-10g/l。
所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如下：ms鹽1.6-2.4g/l+n6鹽1.6-3g/l+蔗糖20-40g/l+脯氨酸1-2g/l+mes0.5-1g/l+1000×ms維生素1ml/l+agno310-20μm+水解酪蛋白0.3-1.0g/l+2,4-d1-1.5mg/l+naa0.5-1.0mg/l+tdz0.005-0.05mg/l和/或kt0-0.1mg/l+特美汀100-300mg/l+植物凝膠2.5-3.5g/l。
所述篩選培養(yǎng)基的組成如下：ms鹽1.6-2.4g/l+n6鹽1.6-3g/l+蔗糖20-40g/l+脯氨酸1.0-2.0g/l+1000×ms維生素1ml/l+agno310-20μm+水解酪蛋白0.3-1.0g/l+2,4-d1.0-1.5mg/l+naa0.5-1.0mg/l+mes0.5-1.0g/l+特美汀100-300mg/l+草丁膦5-200mg/l+植物凝膠2.5-3.5g/l。
所述分化培養(yǎng)基包括分化培養(yǎng)基i和分化培養(yǎng)基ii，它們的組成如下：
分化培養(yǎng)基i：ms鹽4-5g/l+蔗糖20-30g/l+1000×ls維生素1ml/l+硫酸銅5-15μm+mes0.5-1.0g/l+6-ba(6-芐氨基嘌呤)2-4mg/l+特美汀100-300mg/l+雙丙氨膦2-5mg/l+植物凝膠2.5-3.5g/l；
分化培養(yǎng)基ii：ms鹽4-5g/l+蔗糖20-30g/l+1000×ls維生素1ml/l+硫酸銅5-15μm+mes0.5-1.0g/l+特美汀100-300mg/l+雙丙氨膦2-5mg/l+植物凝膠2.5-3.5g/l。
所述生根培養(yǎng)基的組成如下：ms鹽4-5g/l+蔗糖20-30g/l+mes0.5-1.0g/l+iba(吲哚丁酸)0.1-0.5mg/l+植物凝膠2.5-3.5g/l。
其中，ms鹽的組成如下：
n6鹽的組成如下：
本發(fā)明還提供上述培養(yǎng)基組合在轉(zhuǎn)基因玉米遺傳育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)基因玉米的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)將玉米的幼胚浸入攜帶目的基因和bar標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌菌液中侵染；
(2)將幼胚移至所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
(3)將幼胚移至所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)初級(jí)愈傷組織；
(4)將初級(jí)愈傷組織移至所述篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗性愈傷組織，再轉(zhuǎn)移到所述分化培養(yǎng)基上，分化形成再生幼苗；
(5)再生幼苗在所述生根培養(yǎng)基上生根后煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因玉米。
前述的方法，步驟(1)中玉米的幼胚是從授粉后6-15天，待玉米幼胚長(zhǎng)至0.5-2.0mm時(shí)，從玉米幼穗上剝?nèi)～@得。即，將玉米幼穗進(jìn)行滅菌后剝?nèi)?.5-2.0mm長(zhǎng)的幼胚，將幼胚浸入如下侵染液中侵染，侵染時(shí)間不超過(guò)15min(5-15min)。
侵染液組成為：ms鹽1.5-2.5g/l+蔗糖60-80g/l+葡萄糖20-40g/l+l-脯氨酸0.1-0.3g/l+乙酰丁香酮100-500μm+od600值0.1-0.5(優(yōu)選od600值0.3)攜帶目的基因和bar標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌菌液。優(yōu)選使用農(nóng)桿菌菌株為eha105。
步驟(2)中培養(yǎng)條件為：23℃黑暗培養(yǎng)48-96h。
步驟(3)中培養(yǎng)條件為：26-34℃黑暗培養(yǎng)1-2周。
所述步驟(4)具體為：將初級(jí)愈傷組織移至所述篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：28℃黑暗培養(yǎng)4-6周，誘導(dǎo)抗性愈傷組織，再轉(zhuǎn)移到所述分化培養(yǎng)基i上，培養(yǎng)條件為：25℃，5000lx，光照培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)移到所述分化培養(yǎng)基ii上，培養(yǎng)條件為：25℃，5000lx，光照培養(yǎng)2周，分化形成再生幼苗。
本發(fā)明還提供利用上述方法獲得的轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞、植株部分和轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明中涉及的玉米品種包括但不限于玉米自交系ay63。ay63為玉米品種安玉2166的母本，安玉2166以其豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性好、品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性廣、抗倒伏，抗絲黑穗病，高抗莖腐病、穗粒腐病和大小斑病等特點(diǎn)得到大面積推廣種植。以自交系ay63作為受體材料，建立組織培養(yǎng)體系，通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源基因，可加快大穗型玉米品種育種進(jìn)程，具有較大的商業(yè)價(jià)值，同時(shí)可為玉米育種提供新的種質(zhì)資源。
利用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，以玉米幼胚為外植體，通過(guò)將外源基因成功地轉(zhuǎn)入玉米組織中，可實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米的高轉(zhuǎn)化頻率、高重復(fù)性的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率可達(dá)10-20％，為玉米遺傳育種提供新的種質(zhì)資源；另外，本方法具有周期短、陽(yáng)性率高、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米提供了新的方法。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中外源基因gfp在組織中的表達(dá)情況；其中，a為篩選結(jié)束后愈傷組織gfp表達(dá)情況，b為a中愈傷組織在自然光下組織形態(tài)；c為篩選結(jié)束后另一塊愈傷組織gfp表達(dá)情況，d為c中愈傷組織在自然光下組織形態(tài)。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中外源基因bar的real-timepcr檢測(cè)結(jié)果。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中外源基因gfp在組織中的southern-blot檢測(cè)結(jié)果；其中，泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為空白對(duì)照，泳道3-10為不同轉(zhuǎn)基因植株hindiii酶切基因組dna雜交結(jié)果。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中外源基因bar的pcr檢測(cè)結(jié)果；其中，泳道m(xù)為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為陽(yáng)性質(zhì)粒，泳道2為陰性對(duì)照，泳道3-10為不同轉(zhuǎn)基因植株基因組dna的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因玉米的制備方法
本實(shí)施例中所用玉米自交系為ay63，由中國(guó)種子集團(tuán)有限公司提供。
1、玉米果穗處理與幼胚的分離
(1)玉米植株授粉6-15d后，幼胚長(zhǎng)至0.5-2.0mm時(shí)，收獲玉米幼穗，去除苞葉，準(zhǔn)備滅菌；
(2)將濃度為6.15％的次氯酸鈉母液用滅菌水按體積比稀釋到15％-20％，每升溶液加入5-10μltween-20混勻制成滅菌液；
(3)將玉米幼穗放入滅菌液中浸泡15分鐘，無(wú)菌水沖洗3-5次，備用；
(4)在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌的手術(shù)刀片削去種子頂端，用無(wú)菌刮鏟掘取胚乳使幼胚從種子中暴露出來(lái)，剝?nèi)∮着撸瑢⒎蛛x出的幼胚放入含有1.8ml懸浮液的2ml塑料離心管中。
2、侵染與共培養(yǎng)
(1)吸去離心管中的懸浮液，加入200μl新鮮的懸浮液，4000rpm離心15s，45℃水浴熱擊3min，然后轉(zhuǎn)入0℃冰浴1min；
(2)用移液槍吸去離心管中的懸浮液，加入1.0mlod600值為0.3攜帶目的基因(外源基因gfp)和bar標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌侵染液，菌株為eha105，侵染5-15min；
(3)將離心管中的幼胚懸浮后倒入共培養(yǎng)培養(yǎng)基，并用移液槍吸去表面多余的農(nóng)桿菌侵染液，將幼胚盾片朝上放置，于23℃黑暗共培養(yǎng)2-4d。
3、誘導(dǎo)與篩選
(1)共培養(yǎng)后，將幼胚轉(zhuǎn)移到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于26℃-34℃黑暗培養(yǎng)7-14d，誘導(dǎo)初級(jí)愈傷組織；
(2)初級(jí)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，將初級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)入含草丁膦(5-200mg/l)的篩選培養(yǎng)基上，于28℃黑暗培養(yǎng)。定期觀察愈傷的生長(zhǎng)狀況及是否產(chǎn)生污染，若發(fā)生污染及時(shí)更換新的培養(yǎng)基。篩選2-3輪，一輪為2周。
4、植株再生與移栽
(1)篩選培養(yǎng)結(jié)束后，將表現(xiàn)抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基i中，25℃，5000lx，光照培養(yǎng)1周；
(2)將出現(xiàn)綠點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基ii中，光照培養(yǎng)2周；
(3)將分化出的幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，25℃，5000lx，光照培養(yǎng)直至生根；
(4)將轉(zhuǎn)基因再生苗轉(zhuǎn)入專用穴盤(pán)中生長(zhǎng)，煉苗后移栽于溫室中，3-4個(gè)月后即可收獲后代種子。
上述方法中使用的培養(yǎng)基配方如下：
①懸浮液：ms鹽2g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36g/l+l-脯氨酸0.115g/l，以水配制；
②侵染液：ms鹽2g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36g/l+l-脯氨酸0.115g/l+乙酰丁香酮200μm+od600值0.3農(nóng)桿菌液，以水配制；
③共培養(yǎng)培養(yǎng)基：ms鹽1.0825g/l+n6鹽1.0g/l+蔗糖20g/l+葡萄糖10g/l+脯氨酸0.115g/l+鹽酸硫胺素0.5mg/l+agno320μm+l-半胱氨酸200mg/l+2,4-d1.5mg/l+naa0-1.0mg/l+tdz0-0.05mg/l或kt0-0.1mg/l+乙酰丁香酮200μm+mes0.5g/l+1000×ms維生素1ml/l+植物凝膠8g/l；
④愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：ms鹽2.165g/l+n6鹽2g/l+蔗糖30g/l+脯氨酸1.38g/l+mes0.5g/l+1000×ms維生素1ml/l+agno320μm+水解酪蛋白0.5g/l+2,4-d1.5mg/l+naa0-1.0mg/l+tdz0-0.05mg/l或kt0-0.1mg/l+特美汀200mg/l+植物凝膠3g/l；
⑤篩選培養(yǎng)基：ms鹽2.165g/l+n6鹽2g/l+蔗糖30g/l+脯氨酸1.38g/l+1000×ms維生素1ml/l+agno320μm+水解酪蛋白0.5g/l+2,4-d1.5mg/l+naa0.5mg/l+mes0.5g/l+特美汀200mg/l+草丁膦5-200mg/l+植物凝膠3g/l；
⑥分化培養(yǎng)基i：ms鹽4.3g/l+蔗糖20g/l+1000×ls維生素1ml/l+硫酸銅10μm+mes0.5g/l+6-ba3.5mg/l+特美汀200mg/l+雙丙氨膦3mg/l+植物凝膠3g/l；
⑦分化培養(yǎng)基ii：ms鹽4.3g/l+蔗糖20g/l+1000×ls維生素1ml/l+硫酸銅10μm+mes0.5g/l+特美汀200mg/l+雙丙氨膦3mg/l+植物凝膠3g/l；
⑧生根培養(yǎng)基：ms鹽4.3g/l+蔗糖20g/l+mes0.5g/l+iba0.2mg/l+植物凝膠3g/l。
其中，ms鹽的組成如下：
n6鹽的組成如下：
實(shí)施例2ay63幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
1、共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加naa
在共培養(yǎng)和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中除了添加適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-d之外，不同濃度naa的添加對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定的影響。其添加效果如表1所示，在共培養(yǎng)和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5mg/lnaa或1.0mg/lnaa，轉(zhuǎn)化率得到了大幅提高，平均值由1.63％分別提高到3.66％和3.42％。
表1共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度naa的轉(zhuǎn)化率(％)對(duì)比
2、共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加kt
在共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中除了添加適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-d和naa之外，kt的添加對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定的影響。其添加與否的對(duì)比效果如表2所示，在共培養(yǎng)和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.1mg/lkt，轉(zhuǎn)化率得到了提高，平均值由4.00％提高到4.67％。
表2共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中kt添加與否的轉(zhuǎn)化率(％)對(duì)比
3、共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加tdz
在共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中除了添加適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-d和naa之外，不同濃度tdz的添加對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定的影響，其添加效果如表3所示。tdz濃度范圍在0.005-0.05mg/l時(shí)，均可以得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。在共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.005mg/ltdz，可使轉(zhuǎn)化率的平均值由3.98％提高到11.66％。
表3共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度tdz的轉(zhuǎn)化率(％)對(duì)比
4、篩選培養(yǎng)階段篩選劑濃度的確定
轉(zhuǎn)化幼胚經(jīng)過(guò)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)后，需要篩選培養(yǎng)2個(gè)周期，每個(gè)周期為1-2周。如表4所示，在外植體實(shí)驗(yàn)條件一致的前提下，不同濃度草丁膦篩選是轉(zhuǎn)化率不同，在篩選培養(yǎng)基中草丁膦的添加濃度范圍在5-200mg/l時(shí)，均能得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。因此，篩選培養(yǎng)基中草丁膦的添加量為終濃度范圍在5-200mg/l之間，優(yōu)選10-40mg/l，更優(yōu)選20mg/l。
表4不同濃度草丁膦篩選的轉(zhuǎn)化率(％)對(duì)比
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)
1、外源基因gfp在轉(zhuǎn)基因玉米組織中的表達(dá)觀察
取實(shí)施例1的ay63轉(zhuǎn)化愈傷組織觀察外源基因gfp在組織中的表達(dá)，在熒光下見(jiàn)綠色熒光，說(shuō)明外源基因成功表達(dá)，否則為陰性材料，陰性材料與陽(yáng)性材料相比，在熒光下無(wú)典型綠色熒光，愈傷組織呈黃色(圖1)。
2、real-timepcr檢測(cè)
使用abi7900熒光定量pcr儀。
內(nèi)參基因?yàn)閕vr，正向引物為5-actaggcatccaaggcgaacg-3；反向引物為5-agtgcgagaagaacgagtgtcc-3’。目標(biāo)檢測(cè)基因?yàn)閎ar，正向引物為5-gacctccaccgtgaacttcc-3；反向引物為5-gtccagtcgtaggcgttgc-3’。
pcr反應(yīng)體系(10μl)：mix(rochefaststartuniversalsybrgreenmaster[rox]cat.no.04913914001)5μl，引物溶液(含正向引物和反向引物)2.5μl，玉米葉片dna模板2.5μl。
pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性10秒，60℃延伸55秒，35個(gè)循環(huán)。
realtime-pcr反應(yīng)完成后，根據(jù)熒光定量pcr儀生成的內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的平均ct(擴(kuò)增循環(huán)數(shù))值，判定陽(yáng)性和陰性樣品，在整個(gè)擴(kuò)增區(qū)間中內(nèi)有擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性(圖2)。
3、southern-blot檢測(cè)
選取若干樣品進(jìn)行southern雜交。southern雜交探針標(biāo)記及雜交與顯影采用roche公司dighighprimerdnalabelinganddetectionstarterkiti。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：
(1)ctab法抽提轉(zhuǎn)化植株總基因組dna
分單株取葉片0.5-1g，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速將葉片研磨成粉末，倒入2ml離心管中。加入700μl預(yù)熱至65℃的1.5％ctab提取液并搖勻，65℃水浴保溫30-60min，期間搖動(dòng)幾次；
室溫冷卻后，加入700μl氯仿，搖勻后，顛倒輕搖10min，室溫下8000rpm離心10min；
移上清至另一離心管，加入等體積的沉淀液(異丙醇)，-20℃下沉淀30分鐘，室溫下8000rpm離心10min；
用700μl75％乙醇漂洗2-3次，風(fēng)干后溶于50μlte中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(2)基因組dna的酶切
選用合適的限制性內(nèi)切酶酶切轉(zhuǎn)化植株總基因組dna，酶切反應(yīng)體系如下：
混勻后，于37℃酶切10-18h左右，酶切后先取少量進(jìn)行預(yù)電泳檢測(cè)酶切效果，然后用酶切好的總dna在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行低電壓(30-40v)電泳過(guò)夜，使dna充分分離。
(3)轉(zhuǎn)膜
將凝膠修整后切去右下角作為標(biāo)記，浸泡在0.25mol/lhcl至溴酚藍(lán)變黃，蒸餾水洗兩次；堿變性液(1.5mnacl,0.5mnaoh)中變性45min，去離子水漂洗；中和液[1mtris-hcl(ph7.4),1.5mnacl]中漂洗30min，更換中和液漂洗15min；置于搭好的轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，用10×ssc作為轉(zhuǎn)膜液，hybond-n和尼龍膜漂洗于去離子水液面，直至完全濕潤(rùn)，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中；用10×ssc溶液進(jìn)行毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移16-20h，將膠上的dna轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜用2×ssc溶液簡(jiǎn)單漂洗后，紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)1min后，室溫晾干，用保鮮膜將膜包好，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)探針合成及雜交與顯影
探針標(biāo)記：取1μg或(10ng-3μg)回收的dna，加滅菌ddh2o至16μl；pcr儀95℃，10分鐘，迅速放冰上；加入4μldig-highprime，短暫離心；37℃pcr儀或水浴，1h或過(guò)夜(o/n)；65℃，10分鐘或加入2μl0.2mol/ledta(ph8.0)以終止反應(yīng)。
(5)探針效率檢測(cè)
將已完成標(biāo)記的探針，稀釋成8個(gè)濃度梯度；每個(gè)稀釋度各取1μl點(diǎn)于尼龍膜上，120℃下烘30分鐘；將膜放入雜交管，在雜交管中加入20ml馬來(lái)酸，雜交爐里室溫轉(zhuǎn)動(dòng)2分鐘；倒掉馬來(lái)酸，加入10ml1×blockingsolution，室溫轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘；倒掉1×blockingsolution，加入10mlantibodysolution，室溫轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘；倒掉antibodysolution，加入20mlwashingbuffer，室溫轉(zhuǎn)動(dòng)15分鐘；倒掉washingbuffer，加入10mldetectionbuffer，室溫轉(zhuǎn)動(dòng)2-5分鐘；隨后將膜用鑷子輕輕取出，放入封口袋，在袋中加入2mlclor-substrate，5-10分鐘暗處顯影，忌搖動(dòng)。
顯色適時(shí)，將膜放于te或ddh2o中浸泡沖洗。
(6)雜交
加熱雜交液digeasyhyb(10ml/100cm2)，在雜交爐中42℃下預(yù)雜交30分鐘；
95℃下變性探針(25ng/ml)，5分鐘后置于冰上；
將變性探針加入到預(yù)先加熱的digeasyhyb中(3.5ml/100cm2)，混勻；倒掉預(yù)雜交液，加入變性好的探針；雜交爐中42℃下雜交4h-o/n。
(7)洗膜
倒掉雜交液，然后用2×ssc，0.1％sds室溫下洗滌兩次，每次5分鐘；最后用0.5×ssc，0.1％sds，65℃下洗滌兩次，每次15分鐘。
(8)顯色：同探針檢測(cè)操作。
本實(shí)施例選擇目的基因gfp上不存在識(shí)別位點(diǎn)，并且在插入片段中只具有單一位點(diǎn)的高活性內(nèi)切酶hindiii處理植物基因組。所得包含目的基因的植物基因組片段較小，有利于進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)膜等處理。
結(jié)果如圖3所示，檢測(cè)的8個(gè)玉米轉(zhuǎn)基因事件中，有2個(gè)為單拷貝植株，5個(gè)雙拷貝植株，1個(gè)四拷貝植株。說(shuō)明目的基因bar已經(jīng)成功插入玉米基因組中。
4、pcr檢測(cè)
提取轉(zhuǎn)基因植株基因組dna，根據(jù)bar基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
f：5’-gtccagtcgtaggcgttgc-3’
r：5’-gacctccaccgtgaacttcc-3’
pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性10秒，60℃延伸55秒，35個(gè)循環(huán)。
結(jié)果如圖4所示，陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照的pcr擴(kuò)增片段大小為168bp，轉(zhuǎn)化植株的基因擴(kuò)增片段大小與陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照的pcr擴(kuò)增片段大小一致。表明bar基因整合到轉(zhuǎn)化植株的基因組中。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。