本發(fā)明涉及醫(yī)藥科技領(lǐng)域，具體地，涉及一種枸杞糖肽及其制備方法和在制備免疫增強(qiáng)藥物或保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
枸杞是茄科枸杞屬植物枸杞的成熟果實(shí)，具有多種保健功效，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用食物。
枸杞的主要活性成分是枸杞糖肽。它是一種水溶性糖蛋白，現(xiàn)在已有很多研究表明枸杞糖肽具有促進(jìn)免疫、抗衰老、抗腫瘤、清除自由基、抗疲勞、抗輻射、保肝、生殖功能保護(hù)和改善等作用。傳統(tǒng)的枸杞糖肽的提取方法多采用高溫煮提，而且文獻(xiàn)多以sevage法脫蛋白，所以枸杞中存在的糖肽類成分被破壞，因此較少見諸報(bào)道。
在zl98111644.2中，袁曉振等報(bào)道了“枸杞糖肽及其生產(chǎn)工藝”,生產(chǎn)工藝包括浸泡提取、醇沉收集沉淀等步驟。醇沉提取多糖是一個(gè)較為常用的方法，但是乙醇在生產(chǎn)中存在防爆和溶劑回收的問題，因此如果能有新的簡便環(huán)保的提取生產(chǎn)方法來取代醇沉操作具有很大應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的簡便環(huán)保的枸杞糖肽提取生產(chǎn)方法來取代醇沉操作。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有優(yōu)異的藥理活性的枸杞糖肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種枸杞糖肽的制備方法，所述方法包括以下步驟：
(a).枸杞果實(shí)加水浸泡，離心去除沉淀，得到第一提取液；
(b).將第一提取液升溫，提取液中不溶物團(tuán)聚成沉淀，離心去除絮狀沉淀，得到第二提取液；
(c).將第二提取液通過超濾膜分離，取截留溶液，并濃縮干燥，從而得到枸杞糖肽。
在另一優(yōu)選例中，所述枸杞果實(shí)包括枸杞干果和枸杞鮮果。
在另一優(yōu)選例中，枸杞果實(shí)浸泡前進(jìn)行粉碎。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，使用去離子水浸泡。
在另一優(yōu)選例中，所述第一提取液為渾濁的水提液。
在另一優(yōu)選例中，所述第二提取液為澄清溶液。
在另一優(yōu)選例中，所述第二提取液透光率大于60％。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，干燥方法包括冷凍干燥和噴霧干燥。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，用超濾膜分離時(shí)，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至1000us/cm以下，糖度降至1.2以下，收集截留溶液并濃縮干燥。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，枸杞果實(shí)與加水量的質(zhì)量比為1：1-15，浸泡溫度為10-35℃，浸泡時(shí)間為2-10小時(shí)。
在另一優(yōu)選例中，枸杞干果與加水量的質(zhì)量比為1：5～15。
在另一優(yōu)選例中，枸杞鮮果與加水量的質(zhì)量比為1：1～3。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，離心速度為1000-4000rpm，離心時(shí)間為10秒至1分鐘。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，將第一提取液升溫至45-70℃，保持時(shí)間為0.5-5小時(shí)。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，離心速度為6000-16000rpm，離心時(shí)間為5秒至5分鐘。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，超濾膜的截留分子量范圍為1000-2000da。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種枸杞糖肽，所述枸杞糖肽的分子量分布為1000-10000da部分占50-85％；且所述枸杞糖肽中，蛋白質(zhì)含量為 20-35％，中性多糖含量為20-35％，糖醛酸含量為5-20％。
在另一優(yōu)選例中，所述枸杞糖肽是由權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法制備。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種如本發(fā)明第二方面所述的枸杞糖肽的用途，其特征在于，用于制備免疫增強(qiáng)藥物或保健品。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種枸杞糖肽制品，所述枸杞糖肽制品含有如本發(fā)明第二方面所述的枸杞糖肽。
應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
附圖1為實(shí)施例1制備的枸杞糖肽hplc紫外圖譜。
附圖2為實(shí)施例1制備的枸杞糖肽hplc示差折光圖譜。
附圖3為實(shí)施例2制備的枸杞糖肽hplc紫外圖譜。
附圖4為實(shí)施例2制備的枸杞糖肽hplc示差折光圖譜。
附圖5為實(shí)施例3制備的枸杞糖肽hplc紫外圖譜。
附圖6為實(shí)施例3制備的枸杞糖肽hplc示差折光圖譜。
附圖7為實(shí)施例4制備的枸杞糖肽hplc紫外圖譜。
附圖8為實(shí)施例4制備的枸杞糖肽hplc示差折光圖譜。
附圖9為實(shí)施例5制備的枸杞糖肽hplc紫外圖譜。
附圖10為實(shí)施例5制備的枸杞糖肽hplc示差折光圖譜。
附圖11為實(shí)施例6制備的枸杞糖肽hplc紫外圖譜。
附圖12為實(shí)施例6制備的枸杞糖肽hplc示差折光圖譜。
應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過長期廣泛而深入的研究，通過大量篩選和測(cè)試，首次發(fā)現(xiàn)了一種提取分離枸杞糖肽的方法，該法在傳統(tǒng)水提取方法的基礎(chǔ)上，以升溫法促成不溶物自身絮凝從而離心去除部分雜質(zhì)，這樣避免了大量使用乙醇帶來的安全隱患和巨大的溶劑回收、環(huán)境污染等問題，大幅降低了生產(chǎn)成本，極大提高了生產(chǎn)安全性，提高了分子量1000-10000da這部分的糖肽組分的占比，可提高最終糖肽產(chǎn)品的收率，而且獲得的枸杞糖肽產(chǎn)品活性未發(fā)生改變。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
1.本發(fā)明的生產(chǎn)方法以升溫法促成不溶物自身絮凝從而離心去除部分雜質(zhì)，這樣避免了大量使用乙醇或其他有機(jī)溶劑帶來的安全隱患和巨大的溶劑回收、環(huán)境污染等問題，大幅降低了生產(chǎn)成本，極大提高了生產(chǎn)安全性；
2.本發(fā)明的生產(chǎn)方法提高了分子量1000-10000da這部分的糖肽組分的占比，可提高最終糖肽產(chǎn)品的收率，而且獲得的枸杞糖肽產(chǎn)品活性未發(fā)生改變，因此具有較好的市場推廣和應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
實(shí)施例1
100g枸杞干果粉碎后加入15倍質(zhì)量比的去離子水浸泡，浸泡溫度10℃，浸泡時(shí)間10小時(shí)。浸泡液置于cr22g離心機(jī)中以1000rpm轉(zhuǎn)速度離心1分鐘，離心獲得的上清液仍渾濁。將上清液置于水浴中升溫至40℃ 并保持5小時(shí)，在上清液中殘存的果肉果膠聚合成絮狀沉淀，將此料液再置于cr22g離心機(jī)中以16000rpm轉(zhuǎn)速度離心5秒鐘，得到澄清溶液，透光率為83％。將所得澄清溶液置于超濾裝置中超濾，超濾膜截留分子量1000da，工作壓力5公斤，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至500us/cm,糖度降至0.7，收集超濾膜截留的大分子部分的溶液，濃縮，冷凍干燥，獲得枸杞糖肽0.85g。獲得的枸杞糖肽經(jīng)hplc測(cè)定其中分子量1000-10000da的部分占80％，凱氏定氮法測(cè)得蛋白含量35％，蒽酮硫酸法測(cè)得中性多糖含量20％，咔唑法測(cè)得糖醛酸含量20％，其hplc圖譜如附圖1、2所示。
實(shí)施例2
100g枸杞干果粉碎加入10倍質(zhì)量比的去離子水浸泡，浸泡溫度20℃，浸泡時(shí)間5小時(shí)。浸泡液置于cr22g離心機(jī)中以4000rpm轉(zhuǎn)速度離心10秒鐘，離心獲得的上清液仍渾濁。將上清液置于水浴中升溫至60℃并保持2小時(shí)，上清液中殘存的果肉果膠聚合成絮狀沉淀，將此料液再置于cr22g離心機(jī)中以13000rpm速度離心5分鐘，得到澄清溶液，透光率為78％。將所得澄清溶液置于超濾裝置中超濾，超濾膜截留分子量1000da，工作壓力5公斤，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至900us/cm，糖度降至1.0，收集超濾膜截留的大分子部分的溶液，濃縮，冷凍干燥，獲得枸杞糖肽1.1g。獲得的枸杞糖肽經(jīng)hplc測(cè)定分子量1000-10000da的部分占60％，凱氏定氮法測(cè)得蛋白含量30％，蒽酮硫酸法中性多糖含量25％，咔唑法測(cè)得糖醛酸含量10％，其hplc圖譜如附圖3、4所示。
實(shí)施例3
100g枸杞干果粉碎加入5倍質(zhì)量比的去離子水浸泡，浸泡溫度30℃，浸泡時(shí)間2小時(shí)。浸泡液置于cr22g離心機(jī)中以3000rpm轉(zhuǎn)速度離心1分鐘，離心獲得的上清液仍渾濁。將此上清液置于水浴中升溫至70℃保持并0.5小時(shí)，上清液中殘存的果肉果膠聚合成絮狀沉淀，將此料液再置于 cr22g離心機(jī)中以6000rpm轉(zhuǎn)速分離5分鐘，得到澄清溶液，透光率為60％。將所得澄清溶液置于超濾裝置中超濾，超濾膜截留分子量2000da，工作壓力5公斤，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至300us/cm，糖度降至0.6，收集超濾膜截留的大分子部分的溶液，濃縮，冷凍干燥，得到枸杞糖肽0.8g。所獲得的枸杞糖肽經(jīng)hplc測(cè)定分子量1000-10000da的部分占85％，凱氏定氮法測(cè)得蛋白含量20％，蒽酮硫酸法中性多糖含量35％，咔唑法測(cè)得糖醛酸含量5％，其hplc圖譜如附圖5、6所示。
實(shí)施例4
400g枸杞鮮果粉碎加入1倍質(zhì)量比的去離子水浸泡，浸泡溫度10℃，浸泡時(shí)間10小時(shí)。浸泡液置于cr22g離心機(jī)中4000rpm轉(zhuǎn)離心1分鐘，離心獲得的上清液仍渾濁。置于水浴中升溫至40℃并保持3小時(shí)，上清液中殘存的果肉果膠聚合成絮狀沉淀，將此料液再置于cr22g離心機(jī)中10000rpm轉(zhuǎn)速分離0.5分鐘，得到澄清溶液，透光率為67％。將所得澄清溶液置于超濾裝置中超濾，超濾膜截留分子量1000da，工作壓力5公斤，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至1000us/cm，糖度降至1.2，收集超濾膜截留的大分子部分的溶液，濃縮，冷凍干燥，獲得枸杞糖肽1.1g。所獲得的枸杞糖肽經(jīng)hplc測(cè)定分子量1000-10000da的部分占50％，凱氏定氮法測(cè)得蛋白含量20％，蒽酮硫酸法中性多糖含量35％，咔唑法測(cè)得糖醛酸含量10％，其hplc圖譜如附圖7、8所示。
實(shí)施例5
400g枸杞鮮果粉碎加入2倍質(zhì)量比的去離子水浸泡，浸泡溫度20℃，浸泡時(shí)間5小時(shí)。浸泡液置于cr22g離心機(jī)中以1000rpm轉(zhuǎn)速度離心1分鐘，離心獲得的上清液仍渾濁。將此上清液置于水浴中升溫至50℃并保持1.5小時(shí)，上清液中殘存的果肉果膠聚合成絮狀沉淀，將此料液再置于cr22g離心機(jī)中以11000rpm轉(zhuǎn)速度離心20秒鐘，得到澄清溶液，透光率為73％。將所得澄清溶液置于超濾裝置中超濾，超濾膜截留分子量2000da， 工作壓力5公斤，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至900us/cm，糖度降至0.9，收集超濾膜截留的大分子部分的溶液，濃縮，冷凍干燥，獲得枸杞糖肽1.0g。獲得的枸杞糖肽經(jīng)hplc測(cè)定分子量1000-10000da的部分占65％，凱氏定氮法測(cè)得蛋白含量30％，蒽酮硫酸法中性多糖含量25％，咔唑法測(cè)得糖醛酸含量15％，其hplc圖譜如附圖9、10所示。
實(shí)施例6
400g枸杞鮮果粉碎加入5倍質(zhì)量比的去離子水浸泡，浸泡溫度35℃，浸泡時(shí)間2小時(shí)。浸泡液置于cr22g離心機(jī)中以3000rpm轉(zhuǎn)速度離心1分鐘，離心獲得的上清液仍渾濁。將此上清液置于水浴中升溫至70℃并保持0.5小時(shí)，上清液中殘存的果肉果膠聚合成絮狀沉淀，將此料液再置于cr22g離心機(jī)中以13000rpm轉(zhuǎn)速度離心10秒鐘，得到澄清溶液，透光率為90％。將所得澄清溶液置于超濾裝置中超濾，超濾膜截留分子量1000da，工作壓力5公斤，不斷向截留溶液中補(bǔ)入去離子水，當(dāng)截留溶液的電導(dǎo)率降至900us/cm，糖度降至1.2，收集超濾膜截留的大分子部分的溶液，濃縮，冷凍干燥，獲得枸杞糖肽1.05g。獲得的枸杞糖肽經(jīng)hplc測(cè)定分子量1000-10000da的部分占55％，凱氏定氮法測(cè)得蛋白含量25％，蒽酮硫酸法中性多糖含量30％，咔唑法測(cè)得糖醛酸含量15％，其hplc圖譜如附圖11、12所示。
實(shí)施例7枸杞糖肽對(duì)t、b淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
正常balb/c小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組與樣品干預(yù)組，每組10只。用純水溶解待測(cè)樣品，配制成所需干預(yù)濃度(2mg/kg)。樣品干預(yù)組每天每只給予0.2ml待測(cè)樣品灌胃，正常對(duì)照給予相同方式的等體積溶劑，連續(xù)干預(yù)9天。于樣品干預(yù)終點(diǎn)，脫脊椎處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胸腺與脾臟。用純水加干枸杞研碎，配置成所需濃度200mg/kg，生藥對(duì)照組每天每只給予0.2ml待測(cè)樣品灌胃。
水提醇沉枸杞糖肽參照黃琳娟等“枸杞子中免疫活性成份的分離純 化、及物理化學(xué)性質(zhì)的研究”一文中方法制備，本方法枸杞糖肽收率0.8％，中性糖含量35％，糖醛酸含量5％，蛋白含量35％。
t、b淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：將每份細(xì)胞樣品的細(xì)胞濃度調(diào)至4×106/ml。于96孔板中每孔加入100μl的細(xì)胞懸液，100μl的有絲分裂原(cona或lps)，總體積200μl。另設(shè)不加有絲分裂原對(duì)照細(xì)胞樣本作為細(xì)胞增殖的本底對(duì)照。細(xì)胞于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束前12小時(shí)每孔加入20μl3h-胸腺嘧啶核苷酸。測(cè)定時(shí)將標(biāo)記的細(xì)胞樣品用細(xì)胞收集儀收集至玻璃纖維膜上，加入閃爍液后于beta計(jì)數(shù)儀上讀取摻入細(xì)胞dna的3h-胸腺嘧啶核苷酸量，以cpm值代表細(xì)胞增殖的情況。
檢測(cè)結(jié)果：
mean±se，*p<0.05，***p<0.001
mean±se，*p<0.05，***p<0.001
本發(fā)明所獲得的枸杞糖肽與水提醇沉獲得的枸杞糖肽相比較，中性糖的含量略低，但是糖醛酸的含量顯著提高。
通過藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在施用本發(fā)明的枸杞糖肽后，t細(xì)胞與b細(xì)胞的增值水平改變與對(duì)照組相比，差異具有顯著性，提示本發(fā)明的枸杞糖肽與水提醇沉枸杞糖肽一樣具有顯著的免疫活性。
此外，本發(fā)明工藝減少了醇沉工藝，在工業(yè)化生產(chǎn)上更具操作性，防爆要求降低，工業(yè)三廢減少，因而具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。