本發(fā)明涉及一種用于檢測具有國家限量標(biāo)準(zhǔn)的5種食品致病菌的引物組合及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌o157、單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌是重要的食源性致病菌，已被我國列為食品安全的常規(guī)檢測項目，并且針對這5種菌制訂了致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)。沙門氏菌病是重要的人畜共患病原菌，其廣泛分布于自然界，主要以家畜、家禽、肉制品和蛋為傳播載體，可引起食物中毒、胃腸炎、人類的傷寒及副傷寒等腸道疾病，嚴重者可導(dǎo)致死亡，是各國公認、全球報道最多、世界最常見引發(fā)食源性疾病暴發(fā)的首要病原菌，也是我國食源性疾病的主要病原體；金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界，近年來由其引起的食物中毒已呈現(xiàn)出全球的分布狀態(tài)，已經(jīng)成為世界公共衛(wèi)生的一個重要問題。它不僅存在于速凍米面制品中，乳制品和肉類等也通常含有金黃色葡萄球菌的腸毒性菌株，進食被金黃色葡萄球菌污染的食物易導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀，嚴重的會導(dǎo)致死亡；大腸埃希氏菌o157是近幾十年來新發(fā)現(xiàn)的食源性強致病菌，牛肉、生奶、雞肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的傳播載體。感染少量即可致病，致死率高，能夠引起頑固性腹瀉及溶血性尿毒癥等各種并發(fā)癥，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全；單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，，主要傳播媒介為乳制品、肉制品、水產(chǎn)品、果蔬和即食食品，人類受感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀。嬰幼兒，老年人及免疫耐受病人臨床死亡率為30％左右，很多國家都已經(jīng)采取措施以控制食品中的單核細胞增生李斯特氏菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)；副溶血性弧菌廣泛分布于海水和海產(chǎn)品中，是引起食源性疾病暴發(fā)的重要病原菌之一，能夠引起人類腸胃炎，我國沿海城市副溶血性弧菌引起的食源性疾病暴發(fā)在全部食源性疾病暴發(fā)中已占首位，部分地區(qū)已占到60％左右。
基于傳統(tǒng)分離方法的國標(biāo)法gb依然是目前很多檢測機構(gòu)在進行具有國家限量標(biāo)準(zhǔn)的5種食品致病菌檢測的主要依據(jù)。主要包括增菌培養(yǎng)，平板分離，生化鑒定等步驟。檢測方法繁瑣，檢測時間長，靈敏度低，容易發(fā)生漏檢和錯檢，傳統(tǒng)的檢測方法已無法滿足目前食品快速檢測的要求。近幾年發(fā)展起來的分子檢測技術(shù),特別是pcr技術(shù),在微生物快速鑒定和檢測方面的應(yīng)用,為食源性致病菌的快速檢測開辟了新的途徑。但是,pcr存在檢測時間長、易污染、假陽性率高的缺點,使其應(yīng)用受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是近年來發(fā)展出的一種敏感、特異、簡便、快捷的核酸擴增技術(shù),其原理是在一種具有鏈置換活性的dna聚合酶的作用下，識別6～8個區(qū)域的4～6條引物，在等溫條件下快速、特異地擴增目的基因，可推廣應(yīng)用于快速、準(zhǔn)確的檢測常見的食源性微生物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測具有國家限量標(biāo)準(zhǔn)的5種食品致病菌的引物組合及其應(yīng)用。
本發(fā)明首先提供了一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物組ⅰ、引物組ⅱ、引物組ⅲ、引物組ⅳ和引物組ⅴ組成；
(a2)由所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ、所述引物組ⅲ、所述引物組ⅳ和所述引物組ⅴ 中的任意兩個、任意三個或任意四個組成；
(a3)所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ、所述引物組ⅲ、所述引物組ⅳ或所述引物組ⅴ；
所述引物組ⅰ由引物ⅰ-f3、引物ⅰ-b3、引物ⅰ-fip、引物ⅰ-bip、引物ⅰ-lf和引物ⅰ-lb組成；
所述引物ⅰ-f3為如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；
(b2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-b3為如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；
(b4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-fip為如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的單鏈dna分子；
(b6)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-bip為如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的單鏈dna分子；
(b8)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-lf為如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的單鏈dna分子；
(b10)將序列5經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-lb為如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的單鏈dna分子；
(b12)將序列6經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅱ由引物ⅱ-f3、引物ⅱ-b3、引物ⅱ-fip、引物ⅱ-bip、引物ⅱ-lf和引物ⅱ-lb組成；
所述引物ⅱ-f3為如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的單鏈dna分子；
(c2)將序列7經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-b3為如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的單鏈dna分子；
(c4)將序列8經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-fip為如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的單鏈dna分子；
(c6)將序列9經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-bip為如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的單鏈dna分子；
(c8)將序列10經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-lf為如下(c9)或(c10)；
(c9)序列表的序列11所示的單鏈dna分子；
(c10)將序列11經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-lb為如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的單鏈dna分子；
(c12)將序列12經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅲ由引物ⅲ-f3、引物ⅲ-b3、引物ⅲ-fip、引物ⅲ-bip、引物ⅲ-lf和引物ⅲ-lb組成；
所述引物ⅲ-f3為如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的單鏈dna分子；
(d2)將序列13經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-b3為如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的單鏈dna分子；
(d4)將序列14經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-fip為如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的單鏈dna分子；
(d6)將序列15經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-bip為如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的單鏈dna分子；
(d8)將序列16經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-lf為如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的單鏈dna分子；
(d10)將序列17經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-lb為如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的單鏈dna分子；
(d12)將序列18經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅳ由引物ⅳ-f3、引物ⅳ-b3、引物ⅳ-fip、引物ⅳ-bip、引物ⅳ-lf和引物ⅳ-lb組成；
所述引物ⅳ-f3為如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的單鏈dna分子；
(e2)將序列19經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-b3為如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的單鏈dna分子；
(e4)將序列20經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-fip為如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的單鏈dna分子；
(e6)將序列21經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-bip為如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的單鏈dna分子；
(e8)將序列22經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-lf為如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的單鏈dna分子；
(e10)將序列23經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-lb為如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的單鏈dna分子；
(e12)將序列24經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅴ由引物ⅴ-f3、引物ⅴ-b3、引物ⅴ-fip、引物ⅴ-bip、引物ⅴ-lf和引物ⅴ-lb組成；
所述引物ⅴ-f3為如下(f1)或(f2)；
(f1)序列表的序列25所示的單鏈dna分子；
(f2)將序列25經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列25具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-b3為如下(f3)或(f4)；
(f3)序列表的序列26所示的單鏈dna分子；
(f4)將序列26經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列26具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-fip為如下(f5)或(f6)；
(f5)序列表的序列27所示的單鏈dna分子；
(f6)將序列27經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列27具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-bip為如下(f7)或(f8)；
(f7)序列表的序列28所示的單鏈dna分子；
(f8)將序列28經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列28具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-lf為如下(f9)或(f10)；
(f9)序列表的序列29所示的單鏈dna分子；
(f10)將序列29經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列29具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-lb為如下(f11)或(f12)；
(f11)序列表的序列30所示的單鏈dna分子；
(f12)將序列30經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的dna分子。
所述引物組ⅰ中，引物ⅰ-f3、引物ⅰ-b3、引物ⅰ-fip、引物ⅰ-bip、引物ⅰ-lf和引物ⅰ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅱ中，引物ⅱ-f3、引物ⅱ-b3、引物ⅱ-fip、引物ⅱ-bip、引物ⅱ-lf和引物ⅱ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅲ中，引物ⅲ-f3、引物ⅲ-b3、引物ⅲ-fip、引物ⅲ-bip、引物ⅲ-lf和引物ⅲ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅳ中，引物ⅳ-f3、引物ⅳ-b3、引物ⅳ-fip、引物ⅳ-bip、引物ⅳ-lf和引物ⅳ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅴ中，引物ⅴ-f3、引物ⅴ-b3、引物ⅴ-fip、引物ⅴ-bip、引物ⅴ-lf和引物ⅴ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
本發(fā)明還保護所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(g1)或(g2)：
(g1)鑒定沙門氏菌和/或金黃色葡萄球菌和/或大腸埃希氏菌o157和/或單核細胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌；
(g2)用于檢測待測樣本中是否含有沙門氏菌和/或金黃色葡萄球菌和/或大腸埃希氏菌o157和/或單核細胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌。
本發(fā)明還保護含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(g1)或(g2)：
(g1)鑒定沙門氏菌和/或金黃色葡萄球菌和/或大腸埃希氏菌o157和/或單核細胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌；
(g2)用于檢測待測樣本中是否含有沙門氏菌和/或金黃色葡萄球菌和/或大腸埃希氏菌o157和/或單核細胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌。
本發(fā)明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。
本發(fā)明還保護一種檢測待測菌是否為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌o157、單核細胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌的方法，包括如下步驟：
(1)提取待測菌的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，分別采用所述引物組合中的每個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，然后進行如下判斷：
如果采用所述引物組ⅰ可以實現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴增，待測菌為或候 選為沙門氏菌；
如果采用所述引物組ⅱ可以實現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴增，待測菌為或候選為金黃色葡萄球菌；
如果采用所述引物組?？梢詫崿F(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴增，待測菌為或候選為大腸埃希氏菌o157；
如果采用所述引物組ⅳ可以實現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴增，待測菌為或候選為單核細胞增生李斯特氏菌；
如果采用所述引物組ⅴ可以實現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴增，待測菌為或候選為副溶血性弧菌。
本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有沙門氏菌和/或金黃色葡萄球菌和/或大腸埃希氏菌o157和/或單核細胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌的方法，包括如下步驟：
(1)提取待測樣本的總dna；
(2)以步驟(1)提取的總dna為模板，分別采用所述引物組合中的每個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，然后進行如下判斷：
如果采用所述引物組ⅰ可以實現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有沙門氏菌；
如果采用所述引物組ⅱ可以實現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有金黃色葡萄球菌；
如果采用所述引物組ⅲ可以實現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有大腸埃希氏菌o157；
如果采用所述引物組ⅳ可以實現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有單核細胞增生李斯特氏菌；
如果采用所述引物組ⅴ可以實現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有副溶血性弧菌。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅰ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物ⅰ-f3、引物ⅰ-b3、引物ⅰ-fip、引物ⅰ-bip、引物ⅰ-lf和引物ⅰ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅱ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物ⅱ-f3、引物ⅱ-b3、引物ⅱ-fip、引物ⅱ-bip、引物ⅱ-lf和引物ⅱ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅲ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物ⅲ-f3、引物ⅲ-b3、引物ⅲ-fip、引物ⅲ-bip、引物ⅲ-lf和引物ⅲ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅳ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物ⅳ-f3、引物ⅳ-b3、引物ⅳ-fip、引物ⅳ-bip、引物ⅳ-lf和引物ⅳ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅴ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物ⅴ-f3、引物ⅴ-b3、引物ⅴ-fip、引物ⅴ-bip、引物ⅴ-lf和引物ⅴ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
本發(fā)明還保護所述引物組合在檢測待測菌是否為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希 氏菌o157、單核細胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌中的應(yīng)用。
本發(fā)明還保護所述引物組合在檢測待測樣本中是否含有沙門氏菌和/或金黃色葡萄球菌和/或大腸埃希氏菌o157和/或單核細胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌中的應(yīng)用。
以上任一所述鼠傷寒沙門氏菌具體可為atcc編號為14028的菌株。以上任一所述金黃色葡萄球菌具體可為atcc編號為6538的菌株。以上任一所述大腸埃希氏菌o157具體可為cicc編號為21530的菌株。以上任一所述單核細胞增生李斯特氏菌具體可為atcc編號為19115的菌株。以上任一所述副溶血性弧菌具體可為atcc編號為17802的菌株。
采用本發(fā)明提供的引物組合鑒定具有國家限量標(biāo)準(zhǔn)的5種食品致病菌，具有高特異性和高靈敏度，可以簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌o157、單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌。本發(fā)明具有重大的推廣價值。
附圖說明
圖1為實施例2中采用引物組ⅰ的結(jié)果。
圖2為實施例2中采用引物組ⅱ的結(jié)果。
圖3為實施例2中采用引物組ⅲ的結(jié)果。
圖4為實施例2中采用引物組ⅳ的結(jié)果。
圖5為實施例2中采用引物組ⅴ的結(jié)果。
圖6為實施例4中樣本一的結(jié)果。
圖7為實施例4中樣本二的結(jié)果。
圖8為實施例4中樣本三的結(jié)果。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。atcc網(wǎng)址：http://www.atcc.org/。cicc網(wǎng)址：http://www.china-cicc.org/。
實施例1、試劑盒的制備
試劑盒由五個lamp引物組組成，每個引物組用于檢測一種食品致病菌。
用于檢測沙門氏菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列1)：cgatctcgataaagtctctacag；
外引物b3(序列表的序列2)：tcattaatcaacaatacgatgct；
內(nèi)引物fip(序列表的序列3)：cgcaagttgagctttttccagataccgttgatattacttgtgcc；
內(nèi)引物bip(序列表的序列4)：cagttctttattgattatggcgtgcgttatcgtccaggccctc；
環(huán)引物lf(序列表的序列5)：tcttcacgccggctcttc；
環(huán)引物lb(序列表的序列6)：gcctgccggaagtattgttac。
用于檢測金黃色葡萄球菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列7)：cacgcaaactgttggcc；
外引物b3(序列表的序列8)：gaaaaagtgtacgagttcttga；
內(nèi)引物fip(序列表的序列9)：gctgcaatgacctcgttattattgtctatgagttaaagcttgctgaagg；
內(nèi)引物bip(序列表的序列10)：ttgcttacttactgctgtacctgttttcataatcgatcactggaccg；
環(huán)引物lf(序列表的序列11)：tcccactaaatgtgtttcat；
環(huán)引物lb(序列表的序列12)：gaaagtgttcaagtatttttattca。
用于檢測大腸埃希氏菌o157的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列13)：tgtgggaacatttggagat；
外引物b3(序列表的序列14)：tcagcaatttcacgttttcg；
內(nèi)引物fip(序列表的序列15)：cagctaatccttggcctttaaaatgaggtggaatggttgtcacg；
內(nèi)引物bip(序列表的序列16)：acataggcaatattggcatgacgaactgggctaatcctatagcag；
環(huán)引物lf(序列表的序列17)：aaacaacggtcataaagtgtttt；
環(huán)引物lb(序列表的序列18)：taggctacaattataggatgacaaa。
用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列19)：atcctcctgcatatatctcaa；
外引物b3(序列表的序列20)：tttgcggagccaccgta；
內(nèi)引物fip(序列表的序列21)：gcagcttttactttggtactatggggtgtggcatatggccgtc；
內(nèi)引物bip(序列表的序列22)：gctgccgtaagtgggaaatcgctttgaaggaagaatttttgatg；
環(huán)引物lf(序列表的序列23)：ttagttgataatttcaaataaactt；
環(huán)引物lb(序列表的序列24)：ctcaggtgatgtagaactgacaaa。
用于檢測副溶血性弧菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列25)：agcatctgcggttttgg；
外引物b3(序列表的序列26)：cgcgaatgtaatcgccat；
內(nèi)引物fip(序列表的序列27)：agcacttgctcaactttaaggtgtatctatccttttcagtggttgg；
內(nèi)引物bip(序列表的序列28)：gactgtgattactgataacttgccaggtacttaacgttcgactcca；
環(huán)引物lf(序列表的序列29)：cactgccccagtacaa；
環(huán)引物lb(序列表的序列30)：accgtaggcccgtta。
用于檢測沙門氏菌的引物組命名為引物組ⅰ。用于檢測金黃色葡萄球菌的引物組命名為引物組ⅱ。用于檢測大腸埃希氏菌o157的引物組命名為引物組ⅲ。用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的引物組命名為引物組ⅳ。用于檢測副溶血性弧菌的引物組命名為引物組ⅴ。
實施例2、特異性
待測菌分別為：
鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)，atcc編號為14028；
金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，atcc編號為6538；
大腸埃希氏菌o157，又稱出血性大腸埃希氏菌，英文為escherichiacolieheco157:h7，cicc編號為21530。
單核細胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)，atcc編號為19115；
副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)，atcc編號為17802。
1、提取待測菌的基因組dna。
2、以步驟1提取的基因組dna為模板，分別采用實施例1制備的各個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。
反應(yīng)體系(10μl)：7.0μl反應(yīng)液(博奧生物集團有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為cp.440020)、1μl引物混合物和50pg-50ng模板dna，補水至10μl。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物f3和外引物b3的濃度均為0.5μm，內(nèi)引 物fip和內(nèi)引物bip的濃度均為2μm，環(huán)引物lf和環(huán)引物lb的濃度均為1μm。
反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。
反應(yīng)過程中，采用熒光pcr儀檢測熒光信號。
采用引物組ⅰ的結(jié)果見圖1。只有當(dāng)待測菌為鼠傷寒沙門氏菌的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)待測菌為鼠傷寒沙門氏菌以外的其它四種菌的時候均不顯示陽性擴增曲線。
采用引物組ⅱ的結(jié)果見圖2。只有當(dāng)待測菌為金黃色葡萄球菌的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)待測菌為金黃色葡萄球菌以外的其它四種菌的時候均不顯示陽性擴增曲線。
采用引物組ⅲ的結(jié)果見圖3。只有當(dāng)待測菌為大腸埃希氏菌o157的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)待測菌為大腸埃希氏菌o157以外的其它四種菌的時候均不顯示陽性擴增曲線。
采用引物組ⅳ的結(jié)果見圖4。只有當(dāng)待測菌為單核細胞增生李斯特氏菌的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)待測菌為單核細胞增生李斯特氏菌以外的其它四種菌的時候均不顯示陽性擴增曲線。
采用引物組ⅴ的結(jié)果見圖5。只有當(dāng)待測菌為副溶血性弧菌的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)待測菌為副溶血性弧菌以外的其它四種菌的時候均不顯示陽性擴增曲線。
以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的五個引物組分別對其靶標(biāo)菌具有很高的特異性。
實施例3、靈敏度
待測菌分別為：
鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)，atcc編號為14028；
金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，atcc編號為6538；
大腸埃希氏菌o157，又稱出血性大腸埃希氏菌，英文為escherichiacolieheco157:h7，cicc編號為21530。
單核細胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)，atcc編號為19115；
副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)，atcc編號為17802。
一、引物組ⅰ檢測沙門氏菌的靈敏度
1、提取鼠傷寒沙門氏菌的基因組dna。
2、以步驟1提取的基因組dna為模板，采用實施例1制備的引物組ⅰ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。
反應(yīng)體系(10μl)：7.0μl反應(yīng)液(博奧生物集團有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為cp.440020)、1μl引物混合物和模板dna，補水至10μl。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物f3和外引物b3的濃度均為0.5μm，內(nèi)引物fip和內(nèi)引物bip的濃度均為2μm，環(huán)引物lf和環(huán)引物lb的濃度均為1μm。反應(yīng)體系中，模板dna的含量為10、102、103、104或105個拷貝數(shù)。
反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。
反應(yīng)過程中，采用熒光pcr儀檢測熒光信號。
結(jié)果表明，引物組ⅰ檢測沙門氏菌的靈敏度為103個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
二、引物組ⅱ檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度
用金黃色葡萄球菌代替鼠傷寒沙門氏菌，用引物組ⅱ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅱ檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度為103個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
三、引物組ⅲ檢測大腸埃希氏菌o157的靈敏度
用大腸埃希氏菌o157代替鼠傷寒沙門氏菌，用引物組ⅲ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅲ檢測大腸埃希氏菌o157的靈敏度為103個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
四、引物組ⅳ檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度
用單核細胞增生李斯特氏菌代替鼠傷寒沙門氏菌，用引物組ⅳ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅳ檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度為103個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
五、引物組ⅴ檢測副溶血性弧菌的靈敏度
用副溶血性弧菌代替鼠傷寒沙門氏菌，用引物組ⅴ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅴ檢測副溶血性弧菌的靈敏度為103個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
實施例4、應(yīng)用
待測樣本為如下樣本一、樣本二或樣本三：
樣本一：已通過細菌培養(yǎng)鑒定確認含有沙門氏菌的雞蛋；
樣本二：已通過細菌培養(yǎng)鑒定確認含有金黃色葡萄球菌的午餐肉；
樣本三：已通過細菌培養(yǎng)鑒定確認含有副溶血性弧菌的沙丁魚罐頭。
1、提取待測樣本的總dna。
2、以步驟1提取的總dna為模板，分別采用實施例1制備的各個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。
反應(yīng)體系(10μl)：7.0μl反應(yīng)液(博奧生物集團有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為cp.440020)、1μl引物混合物和50ng模板dna，補水至10μl。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物f3和外引物b3的濃度均為0.5μm，內(nèi)引物fip和內(nèi)引物bip的濃度均為2μm，環(huán)引物lf和環(huán)引物lb的濃度均為1μm。
反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。
反應(yīng)過程中，采用熒光pcr儀檢測熒光信號。
樣本一的結(jié)果見圖6。只有采用引物組ⅰ的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)采用引物組ⅰ以外的其它四個引物組的時候均不顯示陽性擴增曲線。
樣本二的結(jié)果見圖7。只有采用引物組ⅱ的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)采用引物組ⅱ以外的其它四個引物組的時候均不顯示陽性擴增曲線。
樣本三的結(jié)果見圖8。只有采用引物組ⅴ的時候顯示陽性擴增曲線。當(dāng)采用引物組ⅴ以外的其它四個引物組的時候均不顯示陽性擴增曲線。
以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明提供的引物組合進行具有國家限量標(biāo)準(zhǔn)的5種食品致病菌的檢測，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。