本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體地，本發(fā)明涉及一種t淋巴細胞、一種慢病毒、一種轉基因淋巴細胞、一種構建體、一種用于治療癌癥的治療組合物和一種提高淋巴細胞活性的方法。

背景技術：

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，腫瘤細胞通過誘導免疫抑制性受體的表達，而關閉其受到免疫反應。在免疫調節(jié)機制方面,激活的細胞毒性t淋巴細胞(ctls)表達負調控的監(jiān)管機制,即在細胞表面表達免疫檢查點分子，其中，一種主要的免疫檢查點分子——程序性細胞死亡受體1(pd1)表達在活化ctls上，其與腫瘤細胞上表達的程序性死亡配體1(pd-l1b7-h1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細胞反應。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達pd-l1。pd-l1與其配體pd1的結合，會導致t淋巴細胞增生性反應的下調,細胞因子的分泌減少,和t細胞的無能或凋亡。細胞毒性t淋巴細胞抗原4(ctla4)是另一個t細胞的關鍵負面調節(jié)因子，其可抑制t細胞活化，抑制機制是通過與表達在抗原遞呈細胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)在相互作用實現(xiàn)。

t細胞攻擊并摧毀腫瘤的潛力一直是公認的。過繼t細胞療法是將來自體內的t細胞在體外活化、擴張，隨后回輸入體內進行自身免疫治療的一種療法。

然而，過繼t細胞療法仍有待進一步開發(fā)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

cd19靶向性的嵌合抗原受體t細胞可有效地殺傷cd19⁺的惡性b細胞。但許多cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤患者，仍然對于cd19靶向性的嵌合抗原受體t細胞療法沒有反應。本發(fā)明針對上述問題，提出了一種攜帶沉默細胞表面免疫檢查點的核酸分子和編碼cd19靶向性的嵌合抗原受體的核酸分子的構建體和以此構建體導入后形成的轉基因淋巴細胞，本發(fā)明提出的構建體和轉基因淋巴細胞用于過繼t細胞的免疫治療，可以大大提高t淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞的殺傷能力，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病 的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果顯著增強。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述t淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默；以及表達嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識別抗原cd19；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細胞的細胞膜中；胞內區(qū)，所述胞內區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內區(qū)包括cd28的胞內段以及cd3ζ鏈。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出的t淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力顯著增強，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果大大提高。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細胞表面免疫檢查點的核酸分子，所述沉默細胞表面免疫檢查點的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一。

mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno：1)。

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgc ttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa(seqidno：2)。

ggccaggatggttcttagact(seqidno：3)。

ggatttccagtggcgagagaa(seqidno：4)。

gccuguguucucuguggacuaug(seqidno：5)。

ggugcugcuagucuggguccugg(seqidno：6)。

gacagagagaagggcagaagugc(seqidno：7)。

cagcuucuccaacacaucggaga(seqidno：8)。

ccgugucacacaacugcccaacg(seqidno：9)。

uaugccaccauugucuuuccuag(seqidno：10)。

ugcuaaacugguaccgcaugagc(seqidno：11)。

gugacagagagaagggcagaagu(seqidno：12)。

cugaggauggacacugcucuugg(seqidno：13)。

aucggagagcuucgugcuaaacu(seqidno：14)。

ggcaacggaacccagatttat(seqidno：15)。

ggaacccaaattacgtgtact(seqidno：16)。

gaacccaaattacgtgtacta(seqidno：17)。

gggagaagactatattgtaca(seqidno：18)。

gacgtttatagccgaaatgat(seqidno：19)。

gacactaatacaccaggtaga(seqidno：20)。

accucacuauccaaggacugagg(seqidno：21)。

augaguugaccuuccuagaugau(seqidno：22)。

ggggaaugaguugaccuuccuag(seqidno：23)。

cucuggauccuugcagcaguuag(seqidno：24)。

cuccucuggauccuugcagcagu(seqidno：25)。

uuugugugugaguaugcaucucc(seqidno：26)。

caccuccaguggaaaucaaguga(seqidno：27)。

cacgggacucuacaucugcaagg(seqidno：28)。

uucugacuuccuccucuggaucc(seqidno：29)。

aagucugugcggcaaccuacaug(seqidno：30)。

ggtcggtcagaatgcctatct(seqidno：31)。

gccaatgacttacgggactct(seqidno：32)。

gcagagggaattcgctcagaa(seqidno：33)。

ggaaattcgggcacatcatat(seqidno：34)。

gattaagagatgactggacta(seqidno：35)。

gagatgactggactaggtcta(seqidno：36)。

aggaaauucgggcacaucauaug(seqidno：37)。

gacugaugaaagggaugugaauu(seqidno：38)。

gccacugauuuucaaagagaucu(seqidno：39)。

agcagaguuuucccauuuucaga(seqidno：40)。

aacuuaaacaggcaugucauugc(seqidno：41)。

uucagaagauaaugacucacaug(seqidno：42)。

gccucuguauuuaagccaacaga(seqidno：43)。

ugcucaugugauuguggaguaga(seqidno：44)。

auguuuucacaucuucccuuuga(seqidno：45)。

gagagacuucacugcagccuuuc(seqidno：46)。

gattgcctctactcatcacta(seqidno：47)。

uccuaaugacaaugggucauacc(seqidno：48)。

aagacauugccugccaugcuugg(seqidno：49)。

gucauaccgcuguucugcaaauu(seqidno：50)。

cuccuguauaguuuacuuccuuu(seqidno：51)。

uaccgcuguucugcaaauuuuca(seqidno：52)。

aaaacaaaccaggcauuguuuau(seqidno：53)。

aacuagaaugcccugugaaauac(seqidno：54)。

gugacuuggugcaagcucaaugg(seqidno：55)。

auccaugggaaagaaucauguga(seqidno：56)。

uggugcaagcucaauggaacaac(seqidno：57)。

gctgctcacccttatgaacct(seqidno：58)。

aggacauggugguggacgagugc(seqidno：59)。

ugcucuuccugcacgauaucagu(seqidno：60)。

accucuacugguuccuguacauc(seqidno：61)。

cccuccaacucugcuccucuagg(seqidno：62)。

cccugaguggacagucgucuucg(seqidno：63)。

cugcuccagggaagcuucuaugg(seqidno：64)。

cgcucaagguccuguaugccacc(seqidno：65)。

gaguucaccaagcucaacauuua(seqidno：66)。

ugcugcugcucacccuuaugaac(seqidno：67)。

cccaucuccgugcucuucuuuga(seqidno：68)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的慢病毒導入淋巴細胞所得的轉基因淋巴細胞，該t淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：69所示的核苷酸序列。

agatctactagttctagaatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatcta ccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaaagcttggtaccctcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatc(seqidno： 69)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導入淋巴細胞所得的轉基因淋巴細胞，該轉基因淋巴細胞的細胞因子的產生以及對腫瘤細胞的殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：70所示的核苷酸序列。

agatctactagttctagaatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaaagcttggtacc ctcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccgcatcacttgggattaatattcaagagatattaatcccaagtgatgctttttagctatcgatatc(seqidno：70)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導入淋巴細胞所得的轉基因淋巴細胞，該轉基因淋巴細胞的細胞因子的產生以及對腫瘤細胞的殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：71所示的核苷酸序列。

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatc tacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatcctactgcgtcgacttcgaactcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatcgatagctaaaaagcatcacttgggattaatatctcttgaatattaatcccaagtgatgcggggaagatctgtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatattgcagggcgccactcccctgtccctcacagccatcttcctgccagggcgcacgcgcgctgggtgttcccgcctagtgacactgggcccgcgattccttggagcgggttgatgacgtcagcgttcgaattgtcgac(seqidno：71)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導入淋巴細胞所得的轉基因淋巴細胞，該轉基因淋巴細胞的細胞因子的產生以及對腫瘤細胞的殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉基因淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默；以及表達嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)能夠與抗原特異性結合；跨膜區(qū)；以及胞內區(qū)，所述胞內區(qū) 包括免疫共刺激分子胞內段，所述抗原是腫瘤抗原，所述胞外區(qū)包括抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述抗體結合所述抗原，所述抗體為單鏈抗體，所述抗原為cd19。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，細胞表面免疫檢查點被沉默和表達特異性結合cd19的嵌合抗原受體的淋巴細胞，該淋巴細胞的細胞因子產生以及對cd19⁺腫瘤細胞的殺傷能力大大提高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述轉基因淋巴細胞還可以具有下列附加技術特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點獨立地選自ctla4、pd1、tim3、btla、lag3至少之一。上述分子具有負向調控和減弱細胞免疫應答的作用。在本發(fā)明中，細胞表面免疫檢查點的成功沉默，進一步提高了轉基因淋巴細胞，該轉基因淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力進一步加強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變和鋅指核酸酶至少之一實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，細胞表面免疫檢查點的成功沉默，進一步提高了轉基因淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞的殺傷能力進一步加強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內段獨立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內段的表達和細胞表面免疫檢查點的沉默的聯(lián)合具有正向調控和增強細胞免疫應答的作用，使得轉基因淋巴細胞對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點是ctla4或pd1。根據(jù)本發(fā)明的時候例，細胞細胞表面免疫檢查點ctla4或pd1被沉默，使得轉基因淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默是通過shrna實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明所提出的shrna具有高效、特異性的沉默細胞表面免疫檢查點的作用，細胞表面免疫檢查點的成功沉默，使得轉基因淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力進一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內段是4-1bb或cd28的胞內段。本發(fā)明中的轉基因淋巴細胞的嵌合抗原受體的免疫共刺激分子胞內段是cd28或者4-1bb的胞內段。根據(jù)本發(fā)明的實施例，免疫共刺激分子胞內段是cd28或者4-1bb的胞內段，顯著增強了轉基因淋巴細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞是cd3⁺t淋巴細胞或自然殺傷細胞或自然殺傷t細胞。在本發(fā)明中，上述淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默和表達嵌合抗原受體，使得上述淋巴細胞的細胞免疫作用靶向性更強，該t淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力進一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種構建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子沉默細胞表面免疫檢查點；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼嵌合抗原受體，其中，所述細胞表面免疫檢查點和所述嵌合抗原受體如前所述。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構建成功導入上述淋巴細胞并成功沉默細胞表面免疫檢查點和表達嵌合抗原受體后，使得淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大幅提高，對腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構建體還可以進一步包括下列附加技術特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，其特征在于所述第一核酸分子與所述第二核酸分子被設置在前面所述的淋巴細胞中沉默細胞表面免疫檢查點和表達所述嵌合抗原受體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，成功設置上述第一核酸分子和第二核酸分子的淋巴細胞具有更強的腫瘤殺傷效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包括：第一啟動子，所述第一啟動子與所述第一核酸分子可操作地連接；以及第二啟動子，所述第二啟動子與所述第二核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一和第二啟動子的引入，使得第一核酸分子和第二核酸分子分別獨立的表達，有效沉默了細胞表面免疫檢查點和保證了嵌合抗原受體的生物學作用，使得淋巴細胞靶向作用更強，對腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一啟動子和所述第二啟動子分別獨立地選自u6，h1，cmv,ef-1,rsv啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述啟動子具有啟動效率高的特點，從而保證了細胞表面免疫檢查點的高效沉默和嵌合抗原受體的高效表達，使得淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大大提高，對腫瘤的定向殺傷效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體載體是非致病性病毒。非致病性病毒載體的引入大大提高了構建體在淋巴細胞中的復制和擴增效率，從而大大提高了細胞表面免疫檢查點的沉默和嵌合抗原受體在淋巴細胞中的高效表達，使得淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大大提高，淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述非致病性病毒載體選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺關聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的病毒的載體在病毒包裝和感染過程中，病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細胞，又可感染處于分裂期的細胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細胞表面免疫檢查點被高效沉默和嵌合抗原受體在淋巴細胞中的高效表達，使得淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大大提高，淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細胞或者轉基因淋巴 細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將前面所述的構建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細胞中或者t淋巴細胞。所述構建體或慢病毒成功引入上述淋巴細胞或者t淋巴細胞中，實現(xiàn)了淋巴細胞的細胞表面免疫檢查被沉默和特異性結合抗原cd19的嵌合抗原受體的表達，從而使得所得淋巴細胞或t淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大大提高，淋巴細胞或t淋巴細胞對cd19⁺腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述治療組合物包括：上述構建體、慢病毒、t淋巴細胞或者轉基因淋巴細胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實現(xiàn)轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點的沉默和特異性結合抗原cd19的嵌合抗原受體在轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達，從而使得所得轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞的細胞因子產生以及對腫瘤細胞殺傷能力大大提高，轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞對cd19⁺腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述治療組合物還可以進一步包括下列附加技術特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括選自b細胞淋巴瘤和b細胞白血病的至少之一。細胞表面免疫檢查點的沉默和嵌合抗原受體在轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達，使得所得淋巴細胞或t淋巴細胞對b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種提高淋巴細胞活性的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞攜帶嵌合抗原受體，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默，所述細胞表面免疫檢查點、所述淋巴細胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細胞活性包括所述淋巴細胞的細胞因子的分泌能力和所述淋巴細胞殺傷腫瘤細胞能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默，細胞因子分泌增多，對腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

需要說明的是，本發(fā)明中所使用的術語“細胞表面免疫檢查點”是一種淋巴細胞表面的膜蛋白，它是一種負調控的監(jiān)管機構，其與腫瘤細胞上表達的配體相互作用，可以抑制抗腫瘤淋巴細胞反應。本發(fā)明中所提到的“細胞因子分泌增多”是細胞生理功能增強的表現(xiàn)。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默人細胞表面免疫檢查點的慢病毒載體的結構示意圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的結果圖；以及

圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細胞分泌干擾素-γ的結果圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，下面描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

t淋巴細胞或轉基因淋巴細胞

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細胞或轉基因淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述t淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默；以及表達嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識別抗原cd19；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細胞的細胞膜中；胞內區(qū)，所述胞內區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內區(qū)包括cd28的胞內段以及cd3ζ鏈。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出的t淋巴細胞殺傷能力顯著增強，尤其對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果大大提高。

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，通過刺激免疫抑制性受體的表達而關閉免疫反應。作為免疫負調節(jié)機制,激活的細胞毒性t淋巴細胞(ctls)表達負調控的監(jiān)管機構,即細胞表面的免疫檢查點分子。程序性細胞死亡1受體(pd1)表達在活化ctls上，其與腫瘤細胞上表達的程序性死亡配體1(pd-l1b7-h1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細胞反應。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達pd-l1。pd-l1與其配體pd1的結合，導致ctls增生性反應的下調,細胞因子的分泌減少,和t細胞的無能或凋亡。細胞毒性t淋巴細胞抗原4(ctla4)是另一個t細胞的關鍵負面調節(jié)因子，其可抑制t細胞活化，其通過與表達在抗原遞呈細胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)的相互作用而抑制t細胞的活化。因此，本發(fā)明中提出的t淋巴細胞或轉基因淋巴細胞的免疫檢查點被沉默，t淋巴細胞或轉基因淋巴細胞的在腫瘤病人體內的增殖和生存能力以及細胞因子的分泌能力顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體為單鏈抗體。單鏈抗體可去除非特異性反應的競爭性表面蛋白，同時單鏈抗體更易滲透腫瘤組織增加藥物治療濃度。本發(fā)明提出的轉基因淋巴細胞表達單鏈抗體的嵌合抗原受體，大大提高了轉基因淋巴細胞對靶向腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗原為cd19。因此所述轉基因淋巴細胞針對表達抗原cd19的細胞具有定向性殺傷作用，抗原抗體的特異性結合作用更強，大大提高了本發(fā)明的轉基 因淋巴細胞對cd19抗原表達腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點獨立地選自ctla4、pd1、tim3、btla、lag3至少之一。上述分子能夠與腫瘤細胞表面表達的抗原特異性結合，負向調控和減弱細胞免疫應答。在本發(fā)明中，細胞表面免疫檢查點的成功沉默，進一步提高了轉基因淋巴細胞對腫瘤細胞的定向殺傷作用進一步加強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變和鋅指核酸酶至少之一實現(xiàn)的。

小發(fā)夾rna或短發(fā)夾rna(shrna)是sirna(小干擾rna)的導入形式，sirna是一種小rna分子(由21～25個核苷酸組成)，由dicer(rnaaseⅲ家族中對雙鏈rna具有特異性剪切作用的酶)加工而成；sirna在rna沉默通路中起中心作用，對特定信使rna(mrna)進行降解，為轉錄水平后調控。

反義核酸包括反義rna和反義dna，反義rna是指能和mrna完全互補的一段小分子rna或寡聚核苷酸片段，反義dna是指能與基因dna雙鏈中的有義鏈互補結合的短小dna分子，反義rna和反義dna主要是通過mrna的翻譯和基因dna的轉錄而發(fā)揮作用的；反義核酸一方面通過與靶mrna結合形成空間位阻效應，阻止核糖體與mrna結合，另一方面其與mrna結合后激活內源性rna酶或核酶，進而降解mrna；反義dna與基因dna雙螺旋的調控區(qū)特異結合形成dna三聚體，或與dna編碼區(qū)結合，終止正在轉錄的mrna鏈的延長；反義核酸還可抑制轉錄后mrna的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾、中間剪接和內部堿基甲基化等，并阻止成熟mrna由細胞核向細胞漿內運輸，因此，反義rna是一種有效的沉默目的基因的技術。

核酶是具有催化功能的rna分子，是生物催化劑，可降解特異的mrna序列，核酶通過催化轉磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應參與rna自身剪切、加工過程，與一般的反義rna相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結構，不易受到rna酶的攻擊，更重要的是，核酶在切斷mrna后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結合和切割其它的mrna分子。

顯性負性突變是指某些信號轉導蛋白突變后不僅自身無功能，還能抑制或阻斷同一細胞內的野生型信號轉導蛋白的作用，其主要通過和野生型蛋白形成二聚物的方式實現(xiàn)，這種突變毒性作用大，能顯著抑制或阻斷細胞內目標信號轉導蛋白的作用。

鋅指核酸酶由一個dna識別域和一個非特異性核酸內切酶構成，dna識別域是由一系列cys2-his2鋅指蛋白串聯(lián)組成(一般3～4個)，每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯(lián)體堿基，鋅指蛋白形成α-β-β二級結構，其中α螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的dna結合特異性，骨架結構保守，對決定dna結合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的dna結合特異性，從而可以針對不同的目的基因設計不同的氨基酸引入序列，實現(xiàn)不同 目的基因的特異性沉默。

綜上所述，shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變、crispr、鋅指核酸酶為特異性沉默目標基因的有效手段，沉默基因的手段不受特別限制，本領域技術人員可根據(jù)具體的實驗目的和條件選擇，如本發(fā)明實施例所采用的shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變，或鋅指核酸酶的至少之一，實現(xiàn)目的基因的特異性沉默。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默優(yōu)選采用shrna實現(xiàn)。shrna所攜帶的sirna分子通常是一個長度在10和30之間的堿基對的雙重區(qū)域。本發(fā)明實施例的pd1或ctla4sirna被設計為同源于pd1或ctla4mrna的編碼區(qū)域，通過mrna的降解來抑制基因表達。sirna關聯(lián)于被稱為誘導rna沉默復合物(risc)的多重蛋白復合物，在此期間正義鏈被酶裂解。被激活的risc中基于序列同源性，指引risc到對應的mrna；相同的核酸酶切割靶向pd1或ctla4mrna，產生特定基因pd1或ctla4沉默，抑制特定基因pd1或ctla4的表達。sirna以shrna的形式導入細胞(shrna包含大約18-23的核苷酸sirna序列，后跟一個9-15長度的核苷酸環(huán)和一個sirna序列的反向補充)，shrna的設計較好的避免了在3’utr細胞基因中的匹配點；確保了適當?shù)逆溸x擇。一個單一sirna分子可被重復應用于多靶向mrna分子的分裂。rnai(rna干擾)可通過引入合成sirna的方式被誘導。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的shrna不斷產自細胞內，因此其效果更加持久，從而延長shrna周期，本發(fā)明實施例采用的shrna具有高效、特異性的沉默細胞表面免疫檢查點的作用，細胞表面免疫檢查點的成功沉默，使得轉基因淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤介導的免疫抑制的特性，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內段獨立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內段的表達和細胞表面免疫檢查點的沉默的聯(lián)合具有正向調控和增強細胞免疫應答的作用，使得轉基因淋巴細胞對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點是ctla4或pd1。根據(jù)本發(fā)明的時候例，細胞細胞表面免疫檢查點ctla4或pd1被沉默，使得轉基因淋巴細胞在腫瘤病人體內的增殖和生存能力得到進一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

本發(fā)明中的淋巴細胞是cd3⁺淋巴細胞或自然殺傷細胞或自然殺傷t細胞。cd3⁺淋巴細胞是總t細胞，自然殺傷細胞是免疫細胞的一種，非特異性性識別靶細胞，自然殺傷t細胞是具有t細胞和自然殺傷細胞受體的t細胞亞群。上述淋巴細胞中免疫共刺激分子被沉默和表達嵌合抗原受體，使得上述淋巴細胞的細胞免疫作用靶向性更強，對腫瘤細胞的殺傷作用效果更加顯著。

慢病毒或構建體

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒或構建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒或構建體攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細胞表面免疫檢查點的核酸分子，所述沉默細胞表面免疫檢查點的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一。其中，seqidno：3～14是人類程序性細胞死亡受體1(pd1)sirna的核苷酸序列，seqidno：15～30是人類細胞毒性t淋巴細胞抗原4(ctla4)sirna的核苷酸序列，seqidno：31～46是人類t細胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(tim3)sirna的核苷酸序列，seqidno：47～57是人類t淋巴細胞衰減因子(btla)sirna的核苷酸序列，seqidno：58～68是人類淋巴細胞活化基因3蛋白(lag3)sirna的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的慢病毒或構建體導入淋巴細胞所得的轉基因淋巴細胞，其細胞表面的免疫檢查點pd1、ctla4、tim3、btla、lag3被特異性沉默，特意向結合抗原cd19的嵌合抗原受體高效表達，使得轉基因淋巴細胞抗調亡能力和增殖能力增強、定向殺傷能力顯著提高，從而使得基因淋巴細胞對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明地實施例，本發(fā)明提出的慢病毒或構建體攜帶含有seqidno：69、70或71所示的核苷酸序列。其中，seqidno：69是共表達抗cd19嵌合抗原受體和沉默細胞表面免疫檢查點pd-1的核酸分子(cd19-car/ipd1)，seqidno：70是共表達抗cd19嵌合抗原受體和沉默細胞表面免疫檢查點ctla4的核酸分子(cd19-car/ictla4)，seqidno：71是共表達抗cd19嵌合抗原受體和沉默細胞表面免疫檢查點pd-1和ctla4的核酸分子(cd19-car/ipd1/ictla4)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的慢病毒導入淋巴細胞所得的轉基因淋巴細胞，其細胞表面的免疫檢查點pd1、ctla4被特異性沉默，抗cd19的嵌合抗原受體高效表達，使得轉基因淋巴細胞抗調亡能力和增殖能力增強、定向殺傷能力顯著提高，從而使得轉基因淋巴細胞對cd19⁺惡性b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人是通過如下方式實現(xiàn)上述細胞嵌合抗原受體以及細胞表面免疫檢查點shrna分別獨立地表達的，其中，需要說明的是，此處的表達既指蛋白的表達又指rna轉錄。

啟動子：第一啟動子，所述第一啟動子與編碼嵌合抗原受體的核酸分子可操作地連接；以及第二啟動子，所述第二啟動子與沉默免疫檢查點的核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一啟動子和所述第二啟動子分別獨立地選自u6，h1，cmv,ef-1,rsv啟動子，第一和第二啟動子的引入，使得編碼嵌合抗原受體的核酸分子和沉默細胞表面免 疫檢查點的核酸分子分別獨立的表達，有效沉默了細胞表面免疫檢查點和保證了嵌合抗原受體的高效表達，使得淋巴細胞的靶向作用更強，對腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，也可進一步引入第三啟動子，第三啟動子與沉默細胞表面的免疫檢查點的核酸分子可操作的連接，第三啟動子和第二啟動子所連接的沉默細胞表面的免疫檢查的核酸分子不同，第三啟動子和第二啟動子分別啟動沉默不同免疫檢查點的shrna。

通過上述第一、第二啟動子或進一步第三啟動子的的引入，使得免疫檢查點被高效沉默和嵌合抗原受體高效地表達在上述轉基因淋巴細胞膜上，從而高效抑制了免疫檢查點的免疫負調控和保證了嵌合抗原受體的生物學作用，從而使得淋巴細胞靶向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體的載體是非致病性病毒載體。非致病性病毒載體的引入大大提高了構建體在淋巴細胞中的復制和擴增效率，使得淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述非致病性病毒載體選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺病毒關聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構建體病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細胞，又可感染處于分裂期的細胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細胞表面免疫檢查點被高效沉默和抗cd19的嵌合抗原受體在淋巴細胞中的高效表達，使得淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對cd19⁺腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，以構建一個慢病毒載體為例，發(fā)明人為了構建一個慢病毒載體，在某些病毒序列的位置，將目的核酸插入到病毒基因組中，從而產生復制缺陷的病毒。為了產生病毒體，發(fā)明人進而構建包裝細胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括ltr和包裝成分)。發(fā)明人將含有目的基因的重組質粒，連同慢病毒ltr和包裝序列，一起引入包裝細胞系中。包裝序列允許重組質粒rna轉錄產物被包裝到病毒顆粒中，然后被分泌到培養(yǎng)基中。進而發(fā)明人收集包含重組慢病毒的基質，有選擇性地濃縮，并用于基因轉移。慢載體可以感染多種細胞類型，包括可分裂細胞和不可分裂細胞。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒是復合慢病毒，除了常見的慢病毒基因gag，pol和env，還包含有調控和結構功能的其他基因。慢病毒載體是本領域技術人員所熟知的，慢病毒包括：人類免疫缺陷病毒hiv–1，hiv–2和猿猴免疫缺陷病毒siv。慢病毒載體通過多重衰減艾滋病毒致病基因產生，例如全部刪除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒載體形成生物安全型載體。重組慢病毒載體能夠感染非分裂細胞，同時可用于體內和體外基因轉移和核酸序列表達。例如：在合適的宿主細胞中，和帶有包裝功能(gag，pol，env，rev和tat)的兩個或更多的載體一起，能夠感染非分裂細胞。重組 病毒的靶向性，是通過抗體或特定配體(靶向特定細胞類型受體)與膜蛋白的結合來實現(xiàn)的。同時，重組病毒的靶向性通過插入一個有效序列(包括調控區(qū)域)到病毒載體中，連同另一個編碼了特定靶細胞上的受體的配體的基因，使載體具有了特定的靶向。各種有用的慢病毒載體，以及各種方法和操作等產生的載體，用于改變細胞的表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒載體可有效運送和共表達shrna(sirna的轉運形式)，該小shrna可以有效抑制pd1或ctla4的表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的腺關聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關聯(lián)病毒載體的dna構建。本領域技術人員構建一個合適的腺關聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4基因的表達。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的腺關聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關聯(lián)病毒載體的dna構建。本領域技術人員構建一個合適的腺關聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4基因的表達。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的也包含微基因。微基因意味著用組合(選定的核苷酸序列和可操作的必要的相關連接序列)來指導轉化、轉錄和/或基因產物在體內或體外的宿主細胞中的表達。應用“可操作的連接”序列包含連續(xù)目的基因的表達控制序列，和作用于反式或遠距離控制目的基因的表達控制序列。

另外，本發(fā)明實施例的載體還包括常規(guī)控制元素，在和質粒載體一起的細胞轉染或/和病毒載體一起的細胞感染中，這些元素允許轉錄、轉化和/或小發(fā)夾rna的表達。大量的表達控制序列(包括天然的，可誘導和/或特定組織的啟動子)可能被使用。根據(jù)本發(fā)明的實施例，表達shrna的啟動子為rna聚合酶啟動子。同時，根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為選自u6,h1,poli,polii和poliii的ran聚合酶啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為組織特異型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為誘導型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為選自基于所選載體的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，當選擇慢病毒載體時，啟動子為u6,h1,cmvie基因,ef-1α,泛素c,或磷酸甘油激酶(pgk)啟動子。其他常規(guī)表達控制序列包括可選標記或報告基因，包括編碼遺傳霉素，潮霉素，氨芐青霉素或嘌呤霉素耐藥性等的核苷酸序列。載體的其他組件包括復制起點。

構建載體的技術為本領域技術人員所熟知的，這些技術包括常規(guī)克隆技術，例如在本發(fā)明實施例中所使用的shrna、聚合酶鏈反應和任何適當?shù)奶峁┧璧暮塑账嵝蛄械姆椒ā?/p>

根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人構建了共表達小發(fā)夾rna(shrna)(用來抑制免疫檢查點)以及嵌合抗原受體(car)的病毒載體。本發(fā)明實施例的運送沉默pd1或ctla4的sirna的小發(fā)夾rna以及表達嵌合抗原受體(car)的病毒載體或質粒是復合的，此病毒 載體或質?？山Y合聚合物或其他材料來增加其穩(wěn)定性，或協(xié)助其靶向運動。

制備轉基因淋巴細胞的方法

本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細胞或者轉基因淋巴細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將前面所述的構建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細胞中或者t淋巴細胞。引入方式可以選自電轉或病毒感染宿主細胞的方式引入。所述構建體或慢病毒成功引入上述淋巴細胞或者t淋巴細胞中，實現(xiàn)了淋巴細胞的細胞表面免疫檢查被沉默和抗cd19的嵌合抗原受體的表達，從而使得所得淋巴細胞或t淋巴細胞對腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

治療癌癥的治療組合物

本發(fā)明的提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述治療組合物包括：上述構建體、慢病毒、t淋巴細胞或者轉基因淋巴細胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實現(xiàn)轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點的沉默和抗cd19嵌合抗原受體在轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達，從而使得所得轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞對腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

提供給患者的這些治療組合物,較好的應用于生物兼容溶液或可接受的藥學運載載體。作為準備的各種治療組合物被懸浮或溶解在醫(yī)藥上或生理上可接受的載體，如生理鹽水；等滲的鹽溶液或其他精于此道的人的比較明顯的配方中。適當?shù)妮d體在很大程度上取決于給藥途徑。其他有水和無水的等滲無菌注射液和有水和無水的無菌懸浮液，是醫(yī)藥上可接受的載體。

足夠數(shù)量的病毒載體被轉導入靶向t細胞中，并提供足夠強度的轉基因，沉默pd1或ctla4和表達特有的抗cd19嵌合抗原受體。治療試劑的劑量主要取決于治療狀況,年齡，體重，病人的健康程度，從而可能造成病人的變異性。

沉默pd1或ctla4或沉默pd1和ctla4和表達特有的cd19嵌合抗原受體的這些方法是聯(lián)合治療的一部分。這些病毒載體和用于過繼免疫治療的抗腫瘤t細胞，可以被單獨或結合其他治療癌癥的方法一起執(zhí)行。在合適的條件下，一個治療方法的發(fā)明包括使用一個或多個藥物療法。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括選自b細胞淋巴瘤或b細胞白血病的至少之一。細胞表面免疫檢查點的沉默和抗cd19的嵌合抗原受體在轉基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達，使得所得淋巴細胞或t淋巴細胞的細胞因子產生以及對對b細胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

提高淋巴細胞活性的方法

本發(fā)明提出了一種提高淋巴細胞活性的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞攜 帶嵌合抗原受體，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默，所述細胞表面免疫檢查點、所述淋巴細胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細胞活性所述淋巴細胞活性包括所述淋巴細胞的細胞因子的分泌能力和所述淋巴細胞殺傷腫瘤細胞能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細胞的細胞表面免疫檢查點被沉默，細胞因子分泌增多，對腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

下面將結合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。

本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。

實施例1

本發(fā)明實施例中所用到的細胞系和基本實驗技術如下所述：

細胞系

實施例中用到下述細胞系:oci-ly3細胞(cd19⁺彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞系(dlbcl)),jurkat細胞(cd19^-t淋巴細胞瘤細胞系),和k562(自然殺傷細胞的靶細胞)。以上細胞均都來自于atcc(美國細胞庫)及dsmz(德國細胞庫)，并且培養(yǎng)于加有10％或20％胎牛血清和2毫升的左旋谷胺酰胺的rpmi–1640培養(yǎng)基中(購自gibco-brl,sanfrancisco,ca,usa)。

慢病毒的產生和人t淋巴細胞的轉導

產生復制缺陷的慢病毒載體，并將慢病毒載體離心收集用于人t淋巴細胞的轉導。下面簡要介紹慢病毒載體的產生、收集的實驗過程：將293t細胞鋪在底面積為150-平方厘米的細胞培養(yǎng)皿中，并根據(jù)說明書，使用express-in(購自openbiosystems/thermoscientific,waltham,ma)對293t細胞進行病毒轉導。每盤細胞加入15μg的慢病毒轉基因質粒、5μg的pvsv-g(vsv糖蛋白表達質粒)、10μg的pcmvr8.74質粒(gag/pol/tat/rev表達質粒)和174μl的express-in(濃度為1μg/μl)。分別于24小時和48小時收集上清，并使用超速離心機在28,000rpm(離心機轉子為beckmansw32ti，購自beckmancoulter,brea,ca)的條件下離心2小時。最后用0.75ml的rpmi-1640培養(yǎng)基對病毒質粒沉淀進行重懸。

從健康志愿者供體上分離人原代t淋巴細胞。人t淋巴細胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并使用抗cd3和cd28的單克隆抗體包被的磁珠(購自invitrogen,carlsbad,ca)進行刺激激活。人t淋巴細胞激活后的18～24小時，采用自旋-接種的方法對t淋巴細胞進行轉導，轉導 過程如下所述：在24-孔板中，每孔鋪有0.5×10⁶t淋巴細胞，向每孔細胞中加入0.75ml的上述重懸的病毒上清和polybrene(濃度為8μg/ml)。細胞和病毒質粒的混合液在臺式離心機(購自sorvallst40；thermoscientific)中離心，離心條件是室溫，2500rpm，時間為90分鐘。人重組白細胞介素-2(il-2；購自novartis,basel,switzerland)每隔2～3天加入t淋巴細胞培養(yǎng)液中，il-2的終濃度為100-iu/ml,在t淋巴細胞培養(yǎng)過程中，保持細胞的密度為0.5×10⁶～1×10⁶/ml。一旦被轉導的t淋巴細胞出現(xiàn)休眠，例如細胞生長速度變慢和細胞變小，其中，細胞生長速度和大小是通過multisizer3coultercounter(購自beckmancoulter)評估的，或被轉導的t淋巴細胞在某個計劃的時間點上，t淋巴細胞即可用來做功能分析。

本申請的實施例中所用的流式細胞儀為bdfacscantoii(購自bdbiosciences)，并且流式細胞分析數(shù)據(jù)使用flowjoversion7.2.5軟件(購自treestar,ashland,or)進行分析。

測定細胞因子的分泌

在慢病毒載體轉導t細胞(細胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與oci-ly3淋巴瘤細胞(oci-ly3細胞表達cd19和pd-l1)共培養(yǎng)，實驗過程中改變不同的效靶細胞比例。應用特定的酶聯(lián)免疫吸附測定法(細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測試劑盒，購自r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)檢測細胞上清液中細胞因子的產量。上述細胞上清液取自培養(yǎng)了24小時、48小時和72小時之后的細胞的上清，測定結果用來衡量有代表性的細胞因子(干擾素-γ)(ifnγ)的產量。

簡要測定過程如下：酶標板中加入100微升/孔的作為一系列標準對照的細胞因子稀釋溶液(如ifnγ)或待測細胞上清溶液，并將酶標板在室溫下放置2小時。2小時后吸棄酶標板中溶液并用400微升的洗液潤洗酶標板，潤洗四次。潤洗后，向酶標板每個孔中加入200微升的酶聯(lián)抗細胞因子抗體。繼續(xù)在室溫下放置2個小時，之后向每孔中加入200微升的底物溶液。加入底物溶液后，將酶標板在室溫下放置30分鐘，之后，向每孔中加入50微升的終止反應液。在30分鐘內測定酶標板每孔的光密度。酶標儀設置在450nm。

鉻釋放實驗

實施例中應用4–小時⁵¹鉻釋放法分析評估表達抗cd19嵌合抗原受體t細胞的細胞毒活性。

具體步驟如下：目標測試細胞用⁵¹cr在37攝氏度下標記1小時。標記后，用含有10％胎牛血清(fcs)的rpmi培養(yǎng)基潤洗細胞。潤洗后，將細胞重懸在相同的培養(yǎng)基中，重懸細胞的濃度是1×10⁵/ml。轉導后t細胞以不同的效靶細胞比值(e：t)加入目標測試細胞懸浮液中，并將細胞種在96-孔中，每孔體積是200微升。將細胞培養(yǎng)在37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。4小時后，從每孔中取出30微升的上清放于計數(shù)器的96-微孔板進行計數(shù)分析。分析儀 器是頂級計數(shù)nxt微閃爍計數(shù)器(購自packardbioscience)。所有計數(shù)孔中效應細胞的數(shù)目是基于t細胞總數(shù)來計算的。被標記的目標測試細胞包括oci-ly3(cd19⁺,pd-l1⁺),和jurkat(cd19^–)細胞.

實施例2構建共表達pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的載體

本實施例中，發(fā)明人將編碼有抗人體cd19的單鏈抗體的序列、cd28胞內段和t細胞受體組合的ζ-鏈序列克隆到lv慢病毒載體上，克隆過程中，選擇的限制性酶切是xbai和noti雙酶切,以及noti和xhoi雙酶切,通過酶切、連接、篩選和目的質粒的擴增，生成連接有編碼抗cd19嵌合抗原受體核苷酸序列的慢病毒質粒(lv-cd19car)；u6啟動子和pd1-shrna(shpd1)的序列被克隆進上述lv-cd19car的慢病毒質粒，生成連接有shpd1序列和編碼抗cd19嵌合抗原受體的核苷酸序列的慢病毒質粒(lv-cd19car-shpd1)。載體示意圖如圖1所示。圖1顯示了構建相關lv慢病毒載體的示意圖(包含u6啟動子、編碼人體shpd1的序列和編碼抗cd19嵌合抗原受體序列)。

實施例3共表達pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞的靶向殺傷能力增強

在本實施例中，外周血淋巴細胞取自不記名供血者。外周血淋巴細胞通過梯度離心進行分離，梯度離心機為ficoll-hypaque。t淋巴細胞與t細胞激活因子磁珠cd3/cd28(購自invitrogen,carlsbad,ca)在5％co2、37攝氏度下孵育培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)基是加有2mmol/l谷氨酰胺,10％高溫滅活的胎牛血清(fcs)(購自sigma-aldrichco.)和100u/ml的青霉素/鏈霉素雙抗的rpmi培養(yǎng)基1640(購自invitrogengibcocat.no.12633-012)。激活培養(yǎng)72小時后，用洗液潤洗細胞，將磁珠洗去。將t細胞種在鋪有重組纖連蛋白片段(fnch-296；retronectin)細胞培養(yǎng)皿上，并用慢病毒載體轉導,轉導載體分別為lv-cd19car-shpd1，lv-cd19car，lv-shpd1或空載(lv-gfp)。轉導過程如實施例1所述。轉導后的t細胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并用重組人類il-2因子(100ng/ml；購自r&dsystems)進行誘導擴增7-10天，然后進行功能測試實驗。發(fā)明人測量轉導了不同慢病毒載體轉導的t細胞對(cd19^-和cd19⁺)淋巴瘤細胞的殺傷作用，效靶細胞比例是10：1，測量方法采用標準4–小時⁵¹鉻釋放法，4–小時⁵¹鉻釋放法如實施例1所述。結果如圖2所示。

如圖2結果所示,共表達shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的人t細胞比單獨表達抗cd19嵌合抗原受體或shpd1的t細胞,可更為有效的殺死oci-ly3淋巴瘤細胞(cd19⁺，pdl1⁺)。單獨表達shpd1的t細胞對cd19⁺淋巴瘤細胞沒有明顯的細胞毒性。表達抗cd19嵌合抗原受體的t細胞或共表達shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞對jurkat(cd19^-)淋巴瘤細胞 沒有顯著殺傷作用?？蛰d質粒轉導t淋巴細胞(對照t淋巴細胞)對cd19⁺或cd19^-淋巴瘤細胞均為明顯殺傷作用。

實施例4共表達shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的t淋巴細胞具有細胞因子分泌更的特點

在t淋巴細胞激活因子磁珠cd3/cd28存在下，被激活的t淋巴細胞經(jīng)過慢病毒載體轉導、體外擴增培養(yǎng)，方法如上所述.在慢病毒載體轉導t細胞(細胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與cd19⁺/pdl1⁺的oci-ly3淋巴瘤細胞共培養(yǎng)，3天后，用酶聯(lián)免疫吸附(elisa)法評估細胞因子的分泌和細胞的活性，elisa實驗方法如實施例1所述。實驗結果如圖3所示。圖3結果表明，轉導了lv-cd19car-shpd1的t淋巴細胞比轉導了lv-cd19car或lv-shpd1載體的t淋巴細胞分泌更多的ifnγ(p<0.05；lv-cd19car-shpd1vs.lv-cd19car)。

實施例5共表達ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞和共表達ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞的靶向殺傷能力增強，并且具有細胞因子分泌更多的特點

在本實施例中，發(fā)明人還考察共表達ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞的靶向殺傷能力、細胞因子分泌能力，實驗過程與實施例3和實施例4相同，實驗結論與共表達pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞類似，即共表達ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞比單獨表達抗cd19嵌合抗原受體或ctla4-shrna的t細胞的靶向殺傷能力增強，細胞因子分泌增多。

發(fā)明人還考察共表達ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞的靶向殺傷能力、細胞因子分泌能力，實驗過程與實施例3和實施例4相同，發(fā)現(xiàn)共表達ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞的靶向殺傷能力和細胞因子分泌能力強于共表達ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞或共表達pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細胞。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。