本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種松葉化學(xué)成分的分離方法。

背景技術(shù)：

松葉(松針)為松科(pinaceae)植物最主要的副產(chǎn)物，是松屬藥用的代表部位。我國(guó)松科植物主要有馬尾松、油松、華山松、樟子松、濕地松等等，其中，馬尾松是我國(guó)南方最主要的松屬植物。近百年的研究發(fā)現(xiàn)，松針提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤等一系列藥理活性，由于其資源豐富、功效多樣而引起學(xué)者們對(duì)松針化學(xué)成分的深入研究。近些年對(duì)松針中主藥的化學(xué)成分的研究主藥集中在揮發(fā)油、黃酮類(lèi)化合物、原花青素、木脂素、莽草酸、維生素、酚類(lèi)等物質(zhì)上；分離制備松針中具有代表性的高純度化合物單體成為一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容，尤其是松針中的部分專(zhuān)屬性化學(xué)成分的提取分離對(duì)于松針?biāo)幉牡馁|(zhì)量研究具有重要意義。目前松針中單體化學(xué)成分的分離方法主要是從植物原料中提取分離，所涉及的分離手段以硅膠和凝膠柱層析為基礎(chǔ)，這些傳統(tǒng)方法制備得到的單體化合物純度較低，且步驟繁瑣、周期長(zhǎng)、重復(fù)性較差，難以應(yīng)用于工業(yè)大生產(chǎn)。因此松針中化合物單體的分離方法急需改善，需要有一種快速、高效、重現(xiàn)性好的分離手段來(lái)滿(mǎn)足對(duì)松針中高純度單體化合物制備的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、高效地從松針中提取分離單體化合物的方法，其技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供一種松葉化學(xué)成分的分離方法，其中，所述化學(xué)成分為樺木糖苷和massonianosidec，具體方法包含以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：稱(chēng)取松葉提取物適量，加入有機(jī)溶劑提取，提取液靜止沉淀，取上清液，濃縮后冷凍干燥，將干燥產(chǎn)物溶解于超純水中，過(guò)濾后收集濾液即得；

(2)分離：取步驟(1)中供試品溶液，以極性反相十八烷基硅烷色譜柱為固定相，以含有甲酸的甲醇溶液-含有甲酸的水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，分別收集保留時(shí)間為8.0-9.0min的餾分f1和保留時(shí)間為20.5-22min的餾分f2；

(3)純化：取步驟(2)中餾分f1和f2，分別以反相十八烷基硅烷色譜柱為固定相，20:80的含有甲酸的乙腈溶液-含有甲酸的水溶液為流動(dòng)相，等度洗脫，分別收集保留時(shí)間為3.8-4.6min的餾分f1-1和保留時(shí)間為14.6-15.5min的餾分f2-1；

(4)分離：取步驟(3)中餾分f1-1和餾分f2-1，分別以親水性填料色譜柱為固定相， 90:10的含有甲酸的乙腈溶液-含有甲酸的水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫，收集f1-1中保留時(shí)間為12.3-12.7min的餾分f1-2和f2-1中保留時(shí)間為16.7-17.3min的餾分f2-2；其中f1-2為樺木糖苷，f2-2為massonianosidec。

其中，步驟(2)中所述含有甲酸的甲醇溶液優(yōu)選為含有0.1％甲酸的甲醇溶液；所述含有甲酸的水溶液優(yōu)選為含有0.1％甲酸的水溶液；所述梯度洗脫條件優(yōu)選為：0-35min，25％-60％含有0.1％甲酸的甲醇溶液，35-36min，60％-95％含有0.1％甲酸的甲醇溶液，36-55min，95％-95％含有0.1％甲酸的甲醇溶液。

所述步驟(3)或(4)中所述含有甲酸的乙腈溶液優(yōu)選為含有0.1％甲酸的乙腈溶液；所述含有甲酸的水溶液優(yōu)選為含有0.1％甲酸的水溶液。

所述步驟(2)、(3)、(4)檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選為280nm；

所述步驟(1)中所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、水中的一種或多種的混合物，更優(yōu)選為甲醇溶液或70％的乙醇溶液；所述過(guò)濾方式優(yōu)選為微孔濾膜，其中微孔過(guò)濾的孔徑為0.22μm或0.45μm；所述提取步驟優(yōu)選為回流提取或超聲提取。

所述步驟(1)最優(yōu)選為稱(chēng)取松葉提取物，分兩次各加入甲醇，每次超聲1小時(shí)，靜置沉淀，取上清液，60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后冷凍干燥，將干燥產(chǎn)物溶解于水中，過(guò)0.45μm濾膜，即得；其中松葉提取物與每次超聲提取所用甲醇的質(zhì)量體積比為7:100；或最優(yōu)選為稱(chēng)取松葉提取物350g，加入70％乙醇，加熱回流1小時(shí)，靜置沉淀，取上清液，60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后冷凍干燥，將干燥產(chǎn)物溶解于400ml超純水中，過(guò)0.45μm濾膜，即得，其中松葉提取物與70％的乙醇的質(zhì)量體積比為7:100。所述步驟(2)中極性反相十八烷基硅烷色譜柱優(yōu)選為硅膠表面同時(shí)具有極性官能團(tuán)和十八烷基官能團(tuán)的色譜柱，符合條件的填料柱可自制或選擇市售成品柱，如選自atlantisdc18系列，ultimateaq-c18系列，xbridgec18系列，xaquac18系列的色譜柱均可滿(mǎn)足本發(fā)明的實(shí)施目的，其中尤以xaquac18系列效果最好，所述色譜柱填料粒徑為5-60μm，優(yōu)選10μm；

步驟(3)中反相十八烷基硅烷色譜柱優(yōu)選為硅膠表面鍵合十八烷基官能團(tuán)的色譜柱，可自制或選擇市售成品柱，如選自xterrams系列，inertsilods-sp系列，zorbaxsbc18系列，sunfirec18系列等；最優(yōu)選sunfirec18系列，色譜柱填料粒徑為5-60μm，優(yōu)選5μm；

所述步驟(4)中親水性填料色譜柱優(yōu)選為硅膠表面鍵合極性官能團(tuán)的色譜柱或硅膠色譜柱，可自制或選擇市售成品柱，如選自atlantishilicsilica系列，venusilhilic系列、xamide系列，clickxion系列等，最優(yōu)選為clickxion系列，色譜柱填料粒徑為5-60μm，優(yōu)選10μm。

本發(fā)明分離方法中所述松葉提取物是指以松針為原料，以水或含水醇溶劑為提取溶液；申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)水、50％甲醇或乙醇、70％甲醇或乙醇、95％甲醇或乙醇、甲醇、乙醇均可以 做本發(fā)明的提取溶劑，尤以甲醇或70％乙醇效果最優(yōu)；優(yōu)選取鮮松葉，加水煎煮兩次，第一次加8倍量溶劑，煎煮1.5小時(shí)，第二次加6倍量溶劑，煎煮1.5小時(shí)；濾液減壓濃縮成相對(duì)密度在70℃時(shí)檢測(cè)為1.2的浸膏；噴霧干燥，即得。

由于松針中樺木糖苷(betuloside)和massonianosidec這兩種成分的含量較低，一般的提取分離方法很難得到高純度的單體成分，且目前尚無(wú)可行的化學(xué)合成方法用于制備這兩種化合物單體。采用傳統(tǒng)植化研究的系統(tǒng)分離方法雖能分離得到少量的單體成分，但方法步驟繁瑣，分離周期極長(zhǎng)，且收率極低，無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)大生產(chǎn)的需求。本申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的摸索研究，獲得了本發(fā)明制備樺木糖苷和massonianosidec的方法，該方法分離效率高，產(chǎn)物純度高達(dá)95％以上，其同等純度化合物的收率為傳統(tǒng)方法的3-4倍左右，制備時(shí)間周期僅為傳統(tǒng)方法的9％；且隨著制備量的加大，其快速分離的效果更明顯。同時(shí)，本發(fā)明分離方法大大減少了有機(jī)溶劑的使用量，其分離環(huán)境相對(duì)密閉，溶劑易于回收，因此更加環(huán)保安全；并且，本發(fā)明簡(jiǎn)單方便、易于放大，可實(shí)現(xiàn)全儀器自動(dòng)化分離，大大節(jié)約了產(chǎn)品制備的時(shí)間、人力和經(jīng)濟(jì)成本，適合于工業(yè)大生產(chǎn)應(yīng)用。本發(fā)明的松針化學(xué)成分分離方法可應(yīng)用于馬尾松、濕地松等松針原料中的樺木糖苷和massonianosidec提取分離，是制備樺木糖苷和massonianosidec對(duì)照品的理想途徑，彌補(bǔ)了目前這兩種化合物對(duì)照品市場(chǎng)空白。

具體實(shí)施方式

松針原料：

松針?biāo)幉牟勺灾袊?guó)四川省自貢市富順縣、廣元市朝天區(qū)、巴中市南江縣的松科松屬馬尾松(pinusmassonianalamb.)的松針。

試劑及材料：

甲醇：hplc，4l/瓶，merck(darmstadt,德國(guó))；

乙腈：hplc，4l/瓶，merck(darmstadt,德國(guó))；

甲酸：hplc，500ml/瓶，sigma-aldrich(st.louis,mo,美國(guó)).；

去離子水由milli-qwaterpurificationsystem(billerica,ma,美國(guó))制備；

純水來(lái)自娃哈哈公司；

大孔樹(shù)脂，供應(yīng)商：成都科龍化工試劑廠，型號(hào)：d101，(60-16目)0.3-1.25mm≧90％；

小孔樹(shù)脂凝膠(mci)，供應(yīng)商：成都科普生物有限公司，型號(hào)：sbcmcigel反相色譜填料f型，75-150μm；

葡聚糖凝膠，供應(yīng)商：gehealthcarelifesciences，型號(hào)：sephadexg25medium，50μm；

c18鍵合硅膠(ods)，供應(yīng)商：sepaxtechnologies，inc，型號(hào)：gp-c18，50μm；

色譜柱：sunfire50*150mm*10μm(waters,美國(guó))；xaquac1820*250mm*10μm(華譜 acchrom色譜柱,中國(guó))；clickxion4.6*250mm*10μm(華譜acchrom色譜柱,中國(guó))；clickxion50*250mm*10μm(華譜acchrom色譜柱,中國(guó))。

儀器：

zntd-50提取濃縮機(jī)組：長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠，中國(guó)

b-191噴霧干燥機(jī)：buchi，瑞士

純化工廠：waters，美國(guó)。包括一個(gè)2525二元高壓制備泵、一個(gè)2777自動(dòng)進(jìn)樣器、2757餾分收集器和一個(gè)2489雙波長(zhǎng)檢測(cè)器。

分析色譜：waters，美國(guó)。包括alliancee2695液相系統(tǒng)與2998二極管陣列檢測(cè)器。

液相色譜：agilent，美國(guó)。包括一套1260液相分離及dad檢測(cè)器。

高分辨質(zhì)譜：agilent，6450超高解析度四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(q-tof)，美國(guó)。

固體核磁共振儀：brukeravanceii600mhz，德國(guó)。

實(shí)施例一松葉提取物的制備

鮮松葉，加入zntd-50提取濃縮機(jī)組，加水煎煮兩次，第一次加8倍量水，煎煮1.5小時(shí)，第二次加6倍量水，煎煮1.5小時(shí)；濾液減壓濃縮成相對(duì)密度在70℃時(shí)檢測(cè)為1.2的浸膏；噴霧干燥，即得。

實(shí)施例二傳統(tǒng)植化分離方法制備松針化合物

(1)供試品溶液制備

取松葉提取物1200g，依次用醋酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，分別得到醋酸乙酯萃取浸膏、水飽和正丁醇萃取浸膏以及水層剩余浸膏，編號(hào)為pr.1～3。耗時(shí)5d。

(3)粗分

取pr.2(水飽和正丁醇浸膏)，經(jīng)大孔樹(shù)脂d101吸附，3倍柱體積水洗脫，再經(jīng)sbcmci凝膠分離，以3倍柱體積30％乙醇洗脫分離得到pr.2a1，以3倍柱體積40％乙醇洗脫分離得到pr.2a2。耗時(shí)3d。

取pr.2a2(40％乙醇洗脫液)經(jīng)sephadexg25柱，3倍柱體積水洗脫，得到3個(gè)部分pr.2a2a、pr.2a2b、pr.2a2c。耗時(shí)2d。

(4)精分

①massonianosidec

pr.2a2b經(jīng)sbcmci柱，3倍柱體積20％乙醇洗脫，得到1個(gè)部分pr.2a2b1。耗時(shí)1.5d。

②樺木糖苷

pr.2a2c經(jīng)sbcmci柱，20％-30％乙醇梯度洗脫，以3倍柱體積20％乙醇洗脫分離得到得到pr.2a2c1，以3倍柱體積30％乙醇洗脫分離得到pr.2a2c2。耗時(shí)2d。

取pr.2a2c2經(jīng)c18鍵合硅膠(ods)色譜分離，用3倍柱體積的20％乙醇洗脫，得到pr.2a2c3。耗時(shí)0.5d。

(5)純化

①massonianosidec

pr.2a2b1經(jīng)硅膠柱色譜，依次用3倍柱體積.的二氯甲烷-乙醇(5∶1)、石油醚-丙酮(1∶3)洗脫，收集石油醚-丙酮(1:3)洗脫液，得到化合物massonianosidec，純度為95％(hplc，37mg)。耗時(shí)1d。

②樺木糖苷

取pr.2a2c3洗脫液經(jīng)硅膠柱色譜，依次用3倍柱體積的二氯甲烷-乙醇(5∶1)、石油醚-丙酮(1∶3)洗脫，收集石油醚-丙酮(1:3)洗脫液，得到化合物樺木糖苷，純度為95％(hplc，93.67mg)。耗時(shí)1d。

實(shí)驗(yàn)證明，采用系統(tǒng)植化分離方法從松針中制備massonianosidec和樺木糖苷存在操作過(guò)程復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)步驟較多，有機(jī)溶劑用量大等問(wèn)題，且涉及到二氯甲烷、石油醚、丙酮等有毒試劑，安全性較低。并且，該方法單獨(dú)分離得到2個(gè)化合物，總共需時(shí)19天，制備周期較長(zhǎng)，且產(chǎn)物收率極低，massonianosidec收率(相對(duì)于松葉提取物)約為十萬(wàn)分之三，樺木糖苷收率(相對(duì)于松葉提取物)約為十萬(wàn)分之八。

實(shí)施例三松針化合物的制備

(1)供試品溶液制備

稱(chēng)取松葉提取物35g，分兩次各加入500ml甲醇，每次超聲1小時(shí)，靜置沉淀，取上清液，60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后冷凍干燥，將干燥產(chǎn)物溶解于40ml超純水中，過(guò)0.45μm濾膜，即得。耗時(shí)9h。

(2)一維制備液相分離

儀器：waters純化工廠，色譜柱：xaquac18(250mm×20mm×10μm)，每次進(jìn)樣量為8ml。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的甲醇(有機(jī)相)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件為0-35min，25％-60％的有機(jī)相，35-36min，60％-95％有機(jī)相，36-55min，95％-95％有機(jī)相，流速為20ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。取供試品溶液按照上述色譜條件進(jìn)行分離，分別收集保留時(shí)間8.0-9.0min的餾分f1和保留時(shí)間20.5-22min的餾分f2。耗時(shí)7h。

(3)反相十八烷基硅烷純化

儀器：waters純化工廠，色譜柱：sunfire(150mm×50mm×5μm)，每次進(jìn)樣量為20ml。流動(dòng)相：20:80的乙腈/水，雙相加0.1％甲酸(v/v)，等度洗脫，流速為80ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。取餾分f1和f2按上述色譜條件進(jìn)行分離純化，分別收集保留時(shí)間為3.8-4.6min 的餾分f1-1和保留時(shí)間為14.6-15.5min的餾分f2-1。耗時(shí)3.5h。

(3)二維制備液相分離

儀器：waters純化工廠，色譜柱：clickxion(250mm×20mm×10μm)，每次進(jìn)樣量為8ml。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的乙腈(有機(jī)相)溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，有機(jī)相:水相(90:10)，流速80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。取餾分f1-1和f2-1分別按上述色譜條件進(jìn)行分離，收f(shuō)1-1中保留時(shí)間12.5-13.5min的餾分，得到樺木糖苷(f1-2)11.15mg，純度98％(hplc)，收率(相對(duì)于松葉提取物)0.032％，耗時(shí)13h。

收集f2-1中1保留時(shí)間16.5-17.5min的餾分，得到massonianosidec(f2-2)3.8mg,純度95％(hplc)，收率(相對(duì)于松葉提取物)0.011％，耗時(shí)17h。

實(shí)施例四松針化合物的制備

(1)供試品溶液的制備

稱(chēng)取松葉提取物350g，加入5l的70％乙醇，加熱回流1小時(shí)，靜置沉淀，取上清液，60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后冷凍干燥，將干燥產(chǎn)物溶解于400ml超純水中，過(guò)0.45μm濾膜，即得。耗時(shí)10h。

(2)一維制備液相分離

制備液相儀：waters純化工廠，色譜柱：xaquac18(250mm×100mm×10μm)，每次進(jìn)樣量為40ml。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的甲醇(有機(jī)相)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件為：0-35min，25％-60％的有機(jī)相，35-36min，60％-95％的有機(jī)相，36-55min，95％-95％的有機(jī)相，流速為300ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，取供試品溶液按照上述色譜條件進(jìn)行分離，分別收集保留時(shí)間8.0-9.0min的餾分f1和保留時(shí)間20.5-22min的餾分f2。耗時(shí)12h。

(3)反相十八烷基硅烷純化

儀器：waters純化工廠，色譜柱：sunfire(150mm×50mm×5μm)，每次進(jìn)樣量為20ml。流動(dòng)相：20:80的乙腈/水，雙相加0.1％甲酸(v/v)，等度洗脫，流速為80ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。取餾分f1和f2按上述色譜條件進(jìn)行分離純化，收集f1中保留時(shí)間為3.8-4.6min的餾分f1-1和f2中保留時(shí)間為14.6-15.5min的餾分f2-1。耗時(shí)12h。

(4)二維制備液相分離

儀器：waters純化工廠，色譜柱：clickxion(250mm×50mm×10μm)，每次進(jìn)樣量為20ml。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的乙腈(有機(jī)相)溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，有機(jī)相:水相＝10:90，流速80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。分別取餾分f1-1和f2-1按上述色譜條件分離，收集f1-1中保留時(shí)間12.5-13.5min的餾分，得到樺木糖苷(f1-2)100.8mg， 化合物純度97％(hplc)，收率(相對(duì)于松葉提取物)0.03％。收集f2-1中保留時(shí)間16.5-17.5min的餾分，得到massonianosidec(f2-2)35.4mg，純度96％(hplc)，收率(相對(duì)于松葉提取物)0.01％。耗時(shí)12h。

實(shí)施例五化合物結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

(1)液相和質(zhì)譜

取實(shí)施例三、四中分離得到的化合物，利用agilent1260液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜柱：clickxioncolumn(4.6×250mm,10μm)，用含有0.1％甲酸的水溶液(水相)和含有0.1％甲酸的乙腈溶液(有機(jī)相)作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，有機(jī)相:水相(90:10)，流速1.0ml/min。液相分析物直接接入agilent6540q-tofms。氣體溫度設(shè)定為325℃,霧化氣壓力設(shè)定在30psi，干燥氣體流速設(shè)定為8l/min.毛細(xì)管電壓設(shè)定在3.5kv。.

純度和液相色譜數(shù)據(jù)分析軟件為watersempowersoftware(version3.0)和masslynxsoftware(version4.1)(milford,ma,usa)

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件為agilentmasshuntersoftware(version4.0)(santaclara,ca,usa)

(2)核磁共振

采用brukeravanceii600mhz核磁共振儀進(jìn)行分析。氫譜：600mhz，樣品溶劑為meod。碳譜：150mhz，樣品溶劑為meod。

1hnmrand13cnmr核磁數(shù)據(jù)分析軟件為brukertopspinsoftware(version3.0).

(3)鑒定結(jié)果

f1-2(樺木糖苷，betuloside)化合物光譜、質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)下表1，化合物分子式如式ⅰ所示：

表1化合物f1-2結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)

f2-2(massonianosidec)化合物光譜、質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)下表2，化合物分子式如式ⅱ所示：

表2化合物f2-2結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)