本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系的建立及其建立方法。

背景技術(shù)：

研究報(bào)道了胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(placentalsitetrophoblastictumor,pstt)起源于胎盤種植部位的中間型滋養(yǎng)細(xì)胞，是一種特殊類型的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestationaltrophoblasticneoplasia,gtn)；該疾患臨床相對(duì)少見(jiàn)，約占妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的1％～2％。

研究顯示，胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤大多數(shù)發(fā)生于生育期年齡，主要癥狀為閉經(jīng)后不規(guī)則陰道出血或月經(jīng)過(guò)多。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，pstt的臨床病程多為良性，但其中約10％～15％的病例表現(xiàn)為侵襲性。研究顯示，該疾患中大多數(shù)病灶局限于子宮，預(yù)后較好，但是一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，盡管接受手術(shù)和聯(lián)合化療，仍然預(yù)后不良；與其他類型的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤不同，pstt對(duì)化療不敏感，相應(yīng)機(jī)制尚未明確，因此手術(shù)是目前臨床主要的治療手段，而手術(shù)將導(dǎo)致育齡期患者失去自然懷孕的能力的后果；臨床實(shí)踐中對(duì)這類患者保留生育功能的治療干預(yù)方案尚處在探索階段。

因胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤較罕見(jiàn)，目前的文獻(xiàn)報(bào)道多為小樣本或個(gè)例報(bào)道，相關(guān)的基礎(chǔ)研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，目前僅有1例關(guān)于pstt細(xì)胞系建立的報(bào)道，2002年shih,i.m.等成功建立1例pstt細(xì)胞系ist-2；關(guān)于該細(xì)胞系的后續(xù)應(yīng)用亦僅見(jiàn)有1篇文獻(xiàn)報(bào)道，kobel,m.等應(yīng)用ist-2探索了mapk通路在pstt侵襲和遷移中的作用。

鑒于腫瘤細(xì)胞系的建立在腫瘤的基礎(chǔ)研究中具有重要作用，但是目前世界范圍內(nèi)尚無(wú)通用的pstt細(xì)胞株的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬建立胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，為進(jìn)一步探究胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的病因?qū)W、轉(zhuǎn)移機(jī)制、耐藥機(jī)理及臨床干預(yù)，等。

與本發(fā)明和相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：

1.ajithkumar,t.v.,etal.,placentalsitetrophoblastictumor.obstetgynecolsurv,2003.58(7):p.484-8.

2.behtash,n.andm.karimizarchi,placentalsitetrophoblastictumor.jcancerresclinoncol,2008.134(1):p.1-6.

3.schmid,p.,etal.,prognosticmarkersandlong-termoutcomeofplacental-sitetrophoblastictumours:aretrospectiveobservationalstudy.lancet,2009.374(9683):p.48-55.

4.zhao,j.,etal.,reservationoffertilityforseventeenpatientswithplacentalsitetrophoblastictumor，zhonghuafuchankezazhi,2014.49(4):p.265-9.

5.shih,i.m.,g.singer,andr.j.kurman,establishmentofintermediatetrophoblasticcelllinesfrompsttandcompletehydatidiformmole.modernpathology,2002.15(1):p.210a-210a.

6.kobel,m.,etal.,activationofmitogen-activatedproteinkinaseisrequiredformigrationandinvasionofplacentalsitetrophoblastictumor.amjpathol,2005.167(3):p.879-85.。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)目前世界范圍內(nèi)尚無(wú)通用的pstt細(xì)胞株以及相關(guān)腫瘤細(xì)胞系的建立在腫瘤的研究中具有重要作用的現(xiàn)狀，提供一種人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系pstt-1，該細(xì)胞系可用于胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤疾病的病因?qū)W、轉(zhuǎn)移機(jī)制、耐藥機(jī)理及臨床干預(yù)等的研究。

本發(fā)明提供了人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，命名為pstt-1，已于2015年6月4日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為no.10882。

本發(fā)明的人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系通過(guò)下述方法制得，

(一)取材

獲得離體的新鮮的胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤切除標(biāo)本，病灶組織浸入無(wú)菌hanks溶液清洗，并去除結(jié)締組織和壞死組織；

(二)原代培養(yǎng)

將腫瘤組織塊接種于t25培養(yǎng)瓶瓶壁，靜置培養(yǎng)，約3周后細(xì)胞從組織塊長(zhǎng)出；

(三)細(xì)胞純化

接種約7周后傳第1代，用0.25％胰蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，于倒置相差顯微鏡下觀察，見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；按上述方法，重復(fù)3次傳代，使腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞完全分開(kāi)；

(四)傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞布滿瓶底時(shí)，吸除培養(yǎng)液，pbs緩沖液漂洗，0.25％胰蛋白酶消化，按1:3的比例傳代，目前已傳至30余代；

經(jīng)生物學(xué)特性鑒定獲得人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，命名為pstt-1，保藏號(hào)為no.10882。

本發(fā)明中：體外常規(guī)培養(yǎng)條件為含10％fbs、1％丙酮酸鈉、1％l-谷氨酰胺、1％hepes、1％雙抗的rpmi1640細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃，氣體環(huán)境為5％co2/95％空氣，濕度為飽和濕度。

本發(fā)明的細(xì)胞系pstt-1具有以下生物學(xué)特性：

1.單層貼壁生長(zhǎng)，失去接觸抑制，形態(tài)不均一，呈多突起的星形或紡錘形扁平狀結(jié)構(gòu)；

2.體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，每5天傳代一次，能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代，目前已傳至30余代；

3.染色體核型分析結(jié)果為正常女性核型：46，xx；

4.pstt-1與腫瘤組織str(shorttandemrepeat)分析結(jié)果高度相似，pstt-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色與腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，證實(shí)pstt-1來(lái)源于腫瘤組織。

本發(fā)明提供一種人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系pstt-1，該細(xì)胞系可用于胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤疾病的病因?qū)W、轉(zhuǎn)移機(jī)制、耐藥機(jī)理及臨床干預(yù)等的研究。

附圖說(shuō)明

圖1，pstt-1細(xì)胞形態(tài)(倒置相差顯微鏡100×)。

圖2，pstt-1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

圖3，pstt-1染色體核型分析。

圖4，pstt-1與腫瘤組織str分析。

圖5，pstt-1與腫瘤組織he染色(100×)。

圖6，pstt-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色(100×)與腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色(100×)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系pstt-1

(1)取材：2014年9月從復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院獲得新鮮的胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤切除標(biāo)本(女，29歲，胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，病理診斷：{全子宮}子宮胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤)，取病灶組織1cm³浸入無(wú)菌hanks溶液清洗，并去除結(jié)締組織和壞死組織；

(2)原代培養(yǎng)

將腫瘤組織剪成約1mm³大小的小塊，將組織塊均勻接種于t25培養(yǎng)瓶瓶壁，靜置培養(yǎng)，每3天半量換液1次，約3周后觀察到細(xì)胞從組織塊長(zhǎng)出；

(3)細(xì)胞純化

接種約7周后傳第1代，用0.25％胰蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液接種于一個(gè)培養(yǎng)皿中(培液不含血清)靜置15～20min，于倒置相差顯微鏡下觀察，見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。下次傳代時(shí)再按上述方法處理，重復(fù)3次，可使腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞完全分開(kāi)；

(4)傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞布滿瓶底時(shí)，吸除原瓶中的舊培養(yǎng)液，用pbs緩沖液漂洗1遍，用0.25％胰蛋白酶消化，按1:3的比例傳代，目前已傳至30余代；制得人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，命名為pstt-1，已于2015年6月30日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為no.10882。

本實(shí)驗(yàn)體外常規(guī)培養(yǎng)條件為含10％fbs、1％丙酮酸鈉、1％l-谷氨酰胺、1％hepes、1％雙抗的rpmi1640細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃，氣體環(huán)境為5％co2/95％空氣，濕度為飽和濕度；

(5)生物學(xué)特性的鑒定

細(xì)胞形態(tài)：倒置相差顯微鏡下觀察，pstt-1細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，失去接觸抑制，胞體較大，呈多突起的星形或紡錘形扁平狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)不均一(如圖1所示)；

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2*10^3/ml，混勻后接種于96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；接種后連續(xù)6天在同一時(shí)間加入cck-8試劑反應(yīng)4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度(od)，以時(shí)間為橫軸，od均值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(如圖2所示)；

染色體核型分析：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25μg/ml秋水仙素處理6小時(shí)，37℃過(guò)夜，采集分裂中期細(xì)胞，固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)固定，標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，用giemsa染液染色，于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)21個(gè)細(xì)胞，染色體數(shù)目均為46條，選取分散良好，染色適中的分裂相進(jìn)行核型分析，結(jié)果為正常女性核型：46，xx(如圖3所示)；

str分析：用axygen試劑盒提取pstt-1細(xì)胞與腫瘤組織dna，pcr擴(kuò)增；選取20個(gè)位點(diǎn)(包括性別基因amelogenin)：d13s317、d7s820、d16s539、vwa、th01、amel、tpox、csf1po、d12s391、fga、d2s1338、d21s11、d18s51、d8s1179、d3s1358、d6s1043、pentae、d19s433、pentad，用abi3730xl型遺傳分析儀對(duì)str位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)；結(jié)果顯示，腫瘤組織與pstt-1細(xì)胞str分析結(jié)果高度相似，在amel和d13s317兩個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果不同，其余18個(gè)位點(diǎn)完全相同，表明pstt-1來(lái)源于腫瘤組織；圖4顯示了其中部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

將手術(shù)標(biāo)本以及單克隆pstt-1細(xì)胞用福爾馬林固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行he染色(如圖5所示)；選取ae1/ae3，hcg，hpl對(duì)單克隆pstt-1細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，與腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色相比對(duì)(如圖6所示)，結(jié)果表明，免疫細(xì)胞化學(xué)染色與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，證實(shí)其保留了原始腫瘤細(xì)胞的分化表型。