本發(fā)明涉及rna分子及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合和增強microrna的表達(dá)及活性的寡聚rna分子及其用途。

背景技術(shù)：

成熟的microrna(mirna)是一類長度約22個核苷酸(nt)(例如約18-25個核苷酸)的小rna，在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。mirna廣泛存在于真核生物中，它們能夠與那些和它的序列互補的mrna分子相結(jié)合發(fā)揮功能(例如導(dǎo)致基因的沉默)，這是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個重要策略。研究結(jié)果表明，mirna參與調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動，可以在疾病特別是癌癥的診斷和治療中發(fā)揮作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一些實施方案中，本文提供一種結(jié)合目標(biāo)microrna的單鏈rna序列，優(yōu)選的所述單鏈rna序列增強目標(biāo)microrna的活性(在本文中稱為mirancer分子)，所述單鏈rna序列具有5'端臂和3'端臂，所述5'端臂通過堿基互補配對與目標(biāo)microrna結(jié)合，所述3'端臂通過堿基互補配對與所述5'端臂結(jié)合，

所述單鏈rna序列從5'端到3'端具有以下通式1：

(n5-11)(n0-3)(n6-7)(n1)(n11-21)(n0-2)，

其中n為連續(xù)的核苷酸或其類似物，其后數(shù)字為核苷酸或其類似物的個數(shù)，每個n可以彼此獨立地選自下述核苷酸：a，u，g和c，或其核苷酸類似物，其中n1與目標(biāo)microrna的5'端第一位的核苷酸互補，相應(yīng)的n6-7對應(yīng)于目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-7位或第2-8位，從而(n5-11)(n0-3)(n6-7)為5'端臂，(n11-21)(n0-2)為3'端臂，其中n0-3為插入的c或g 以在所述5'端臂和3'端臂之間形成gc配對。

在一些實施方案中，本文提供的所述單鏈rna分子能夠結(jié)合目標(biāo)microrna和增強所述microrna的活性。發(fā)明人將所述可以增強microrna活性的rna分子稱為microrna增強子(micrornaenhancer)，簡稱mirancer。所述增強microrna活性可以包括例如穩(wěn)定所述microrna，延長所述microrna的半衰期，改變所述microrna所調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)等方面中的一種或多種。測量microrna和microrna所調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。

在一些實施方案中，本文描述的rna分子中除了插入的(n0-3)作為缺口不計算同一性之外，所述5'端臂與所述目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-18位核苷酸的互補鏈至少50％、60％、70％、80％、90％、或100％的同一性，優(yōu)選其中(n6-7)與所述目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-7位或第2-8位核苷酸的互補鏈具有至少80％、90％、或100％的同一性，優(yōu)選(n11-21)與(n5-11)(n0-3)(n6-7)中不配對核苷酸的個數(shù)小于6、5、4、3、2、或1對，優(yōu)選全部不配對的核苷酸在(n1)周圍。在一些實施方案中，(n5-11)(n0-3)(n6-7)與所述目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-18位核苷酸至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％互補。在一些實施方案中，(n6-7)與所述目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-7位或第2-8位核苷酸至少80％、90％、95％、99％或100％互補。在一些實施方案中，(n11-21)與(n5-11)(n0-3)(n6-7)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％互補。

在一些實施方案中，本文提供一種包含所述單鏈rna序列的載體，如質(zhì)粒。

在一些實施方案中，本文提供一種包含所述單鏈rna序列的多核苷酸序列的載體，如質(zhì)粒。

在一些實施方案中，本文提供一種所述單鏈rna序列的合成的或重組的rna分子。

在一些實施方案中，本文提供一種包含所述載體的細(xì)胞。

在一些實施方案中，本文提供所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子用于特異性增加內(nèi)源性和/或外源性目標(biāo)microrna或其它小rna的表達(dá)和/或活性的使用方法和/或用途。

在一些實施方案中，本文提供所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子用于體外和/或體內(nèi)特異性調(diào)節(jié)(例如增加)所述目標(biāo)microrna靶向的基因的表達(dá)的使用方法和/或用途。在一些實施方案中，本文提供所述單鏈rna序列可通過整合到基因組中調(diào)節(jié)microrna靶向的基因表達(dá)的區(qū)域(包括例如所述基因的5'utr區(qū))來特異性調(diào)節(jié)(例如增加)所述目標(biāo)microrna靶向的基因的表達(dá)。

在一些實施方案中，本文提供所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子用于感測所述目標(biāo)microrna或其它小rna的使用方法和/或用途。

在一些實施方案中，本文提供所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子用于感測所述目標(biāo)microrna或其它小rna的從而調(diào)節(jié)所述所述目標(biāo)microrna或其它小rna靶向的基因的表達(dá)的用途。

在一些實施方案中，本文提供一種方法，所述方法包括用于特異性增加內(nèi)源性和/或外源性目標(biāo)microrna或其它小rna的表達(dá)和/或活性的方法，用于體外和/或體內(nèi)特異性調(diào)節(jié)所述目標(biāo)microrna靶向的基因的表達(dá)的方法，用作感受器用于感測所述目標(biāo)microrna或其它小rna的方法，和用于通過感測所述目標(biāo)microrna或其它小rna從而調(diào)節(jié)所述所述目標(biāo)microrna或其它小rna靶向的基因的表達(dá)方法中的任意一種或多種，所述方法包括將本文提供所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子與包含目標(biāo)microrna或其它小rna的樣品(例如細(xì)胞、血液、組織等樣品)接觸的步驟。在一些實施方案中，通過將所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子引入到目的細(xì)胞中發(fā)揮作用。在一些實施方案中，通過將單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子與細(xì)胞裂解后釋放的目標(biāo)microrna相互作用，從而感測所述目標(biāo)microrna或其它小rna，并可以用于檢測所述microrna的在樣品中的存在。

在一些實施方案中，本文提供一種產(chǎn)生結(jié)合目標(biāo)microrna的單鏈rna序列的方法，所述方法包括選擇目標(biāo)microrna(例如根據(jù)希望調(diào)節(jié)的目的基因選擇相應(yīng)的microrna)，然后產(chǎn)生本文提供所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子。

在一些實施方案中，本文提供一種組合物，其包含所述單鏈rna序列、所述載體、和/或所述合成的rna分子，優(yōu)選的所述組合物可以用于本文描述的用途和方法。在一些實施方案中，本文提供一種試劑盒，其包含所述單鏈rna序列、所述載體、和/或所述合成的rna分子，以及使用說明書，優(yōu)選的所述試劑盒可以用于本文描述的用途和方法。在一些實施方案中，所述試劑盒來包括適合用于儲存所述單鏈rna序列、所述載體、和/或所述合成的rna分子的各種試劑如緩沖液等。在一些實施方案中，所述試劑盒包括適合進(jìn)行所述單鏈rna序列、所述載體、和/或所述合成的rna分子與目標(biāo)microrna反應(yīng)的各種試劑包括酶、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染試劑等。在一些實施方案中，所述試劑盒包括適合通過所述單鏈rna序列、所述載體、和/或所述合成的rna分子通過與目標(biāo)microrna反應(yīng)而調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)(如增強目的基因表達(dá)的)試劑。

在一些實施方案中，本文提供能夠被轉(zhuǎn)錄為所述單鏈rna序列的分離或重組多核苷酸，其中所述多核苷酸包含所述單鏈rna表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包含編碼所述單鏈rna的dna序列。

在一些實施方案中，本文提供一種結(jié)合目標(biāo)microrna和增強所述microrna的活性的方法，所述方法包括將所述單鏈rna序列、所述載體、或所述合成的rna分子引入靶細(xì)胞的步驟。所述增強microrna活性可以包括例如穩(wěn)定所述microrna，延長所述microrna的半衰期，改變所述microrna所調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)等方面中的一種或多種。

附圖說明

圖1：mir-7結(jié)合序列的不同形式。

圖2：mir-9結(jié)合序列的不同形式。

圖3：mir-7reporter和mir-9reporter的示意圖。

圖4：過表達(dá)mirancers后的mir-7reporter或mir-9reporter的熒光素酶活性。*,p<0.05,**,p<0.01bystudent'st-test.。

圖5：不同莖長的mir-7結(jié)合序列示意圖。

圖6：過表達(dá)不同莖長的mirancers后mir-7reporter的熒光素酶活性 **，p<0.01bystudent'st-test。

圖7:過表達(dá)mirancer后mir-7reporter或mir-9reporter的熒光素酶活性。**,p<0.01bystudent'st-test。

圖8：過表達(dá)mirancer后mir-7或mir-9的表達(dá)水平。***，p<0.001bystudent'sttest。

圖9：含有mirancer或sponge序列的熒光素酶報告載體示意圖。

圖10：過表達(dá)mir-7或mir-9對不同熒光素酶活性的影響。*，p<0.05,**,p<0.01,***,p>0.001bystudent’sttest。

具體實施方式

現(xiàn)將結(jié)合附圖更全面地描述本發(fā)明，其中描述了本發(fā)明的一部分而非全部實施方案。實際上，這些發(fā)明可以許多不同的形式來體現(xiàn)，并且不應(yīng)理解為受本文所示實施方案的限制，其修改形式和其他實施方案也包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

1.microrna增強子(micrornaenhancer)

在一些實施方案中，本文提供的所述單鏈rna分子能夠結(jié)合目標(biāo)microrna并增強所述microrna的活性，這種可以增強microrna活性的rna分子在本文中稱為microrna增強子(micrornaenhancer)，簡稱mirancer。在一些實施方案中，增強microrna活性可以包括例如穩(wěn)定所述microrna，延長所述microrna的半衰期，改變(例如增加或降低)所述microrna所調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)等方面中的一種或多種。測量microrna的半衰期和靶基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如本文實施例中例示的方法。

在一些實施方案中，mirancer為能夠結(jié)合目標(biāo)microrna的單鏈rna序列，所述單鏈rna序列具有5'端臂和3'端臂，所述5'端臂通過堿基互補配對與目標(biāo)microrna結(jié)合，所述3'端臂通過堿基互補配對與所述5'端臂結(jié)合。

在本文中，除另有明確說明外，核苷酸序列的順序均是指從5'端到3'端的順序。

在一些實施方案中，單鏈rna序列如mirancer分子從5'端到3'端包含以下通式1的分子或由所述通式1的分子組成：

(n5-11)(n0-3)(n6-7)(n1)(n11-21)(n0-2)，

其中n為連續(xù)的核苷酸或其類似物，其后數(shù)字為核苷酸或其類似物的個數(shù)，其中n1與目標(biāo)microrna的5'端第一位的核苷酸(通常是u)互補，相應(yīng)的n6-7對應(yīng)于目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-7位或第2-8位(稱為“種子序列”)，從而(n5-11)(n0-3)(n6-7)為5'端臂，(n11-21)(n0-2)為3'端臂，其中n0-3為插入的c或g以在所述5'端臂和3'端臂之間形成gc配對，(n0-2)可以為3'端懸突(overhang)，其可以是例如uu。

在一些實施方案中，(n1)為a。在一些實施方案中，其中除了插入的(n0-3)作為缺口不計算同一性之外，所述5'端臂與所述目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-18位核苷酸至少50％、60％、70％、80％、90％、或100％互補，例如，所述mirancer分子的5'端臂與所述microrna分子從5'至3'的第2-18位序列(或例如第2-17、2-16、2-15、2-14位序列)100％，約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％互補。在一些實施方案中，優(yōu)選其中(n6-7)與所述目標(biāo)microrna分子從5'至3'的第2-7位或第2-8序列100％，約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％互補。在一些實施方案中，(n5-11)(n0-3)(n6-7)與(n11-21)之間100％，約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％互補，形成莖結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，優(yōu)選(n11-21)與(n5-11)(n0-3)(n6-7)中不配對核苷酸的個數(shù)小于6、5、4、3、2、或1對，優(yōu)選全部不配對的核苷酸在(n1)周圍，形成環(huán)結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述莖結(jié)構(gòu)的長度為10-18對配對核苷酸，包括例如10對，11對，12對，13對，14對，15對，16對，17對，18對配對核苷酸。在一些實施方案中，所述環(huán)結(jié)構(gòu)包括1-13個核苷酸，包括例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13個核苷酸。在一些實施方案中，(n0-2)可以為3'端懸突(overhang)， 其可以是例如uu。在一些實施方案中，緊鄰(n1)周圍(包括(n1)在內(nèi))的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13個核苷酸形成環(huán)；例如，在(n1)的5'端和3'端各具有1，2，3，4，5或6個核苷酸形成5'端和3'端臂，所述5'端和3'端臂之間不互補，從而形成環(huán)。在一些實施方案中，在(n1)的5'端和3'端各具有1，2，3，4，5或6個核苷酸形成5'端和3'端臂，所述5'端和3'端臂之間不互補，從而形成環(huán)，而不形成環(huán)的剩余核苷酸之間至少50％、60％、70％、80％、90％、或100％互補，形成莖。在一些實施方案中，在(n1)的5'端和3'端各具有1，2，3，4，5或6個核苷酸形成5'端和3'端臂，所述5'端和3'端臂之間不互補，從而形成環(huán)，而不形成環(huán)的剩余核苷酸之間100％互補，形成莖。

在一些實施方案中，本文描述的核苷酸序列的每個n彼此獨立地選自下述核苷酸：a，u，t，g和c，或其核苷酸類似物，例如如果所述序列為rna序列，每個n可以彼此獨立地選自下述核苷酸：a，u，g和c，或其核苷酸類似物。

在一些實施方案中，(n1)為a。在一些實施方案中，(n6-7)與microrna的第2-7或第2-8位完全互補，(n0-3)為插入的胞苷(c)或鳥苷(g)其類似物，從而其相對應(yīng)的(n11-21)序列中的相應(yīng)位置為互補的鳥苷(g)或胞苷(c)其類似物，以在所述5'端臂和3'端臂之間形成gc配對，所述配對的個數(shù)可以是0，1，2，3個，所述插入的c在計算所述microrna與所述mirancer之間的互補性時作為缺口不計算在內(nèi)。在一些實施方案中，(n5-11)為5，6，7，8，9，10，或11個連續(xù)核苷酸。在一些實施方案中，(n6-7)為6或7個連續(xù)核苷酸。在一些實施方案中，(n11-21)為16、17或18個連續(xù)核苷酸，其中不配對核苷酸的個數(shù)小于6、5、4、3、2、或1對，優(yōu)選全部不配對的核苷酸在(n1)周圍，形成環(huán)結(jié)構(gòu)；在一些實施方案中，所述莖結(jié)構(gòu)的長度為10-18對配對核苷酸，包括例如10對，11對，12對，13對，14對，15對，16對，17對，18對配對核苷酸；所述環(huán)結(jié)構(gòu)包括1-13個核苷酸，包括例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13個核苷酸。在一些實施方案中，(n0-2)可以為3'端懸突(overhang)，其可以是例如uu。在一些實施方案中，所述3'端懸突可以例如促進(jìn)ago2的結(jié)合。在一些實施方案中，mirancer分子可以在3'端另外包含促進(jìn)ago2的結(jié)合 的序列，例如hdv核酶，其能夠促進(jìn)rna分子3'段額外序列的去除，產(chǎn)生短的3'端懸突，從而促進(jìn)rna分子與ago2的結(jié)合(參見例如renfushang等人，naturecommunications，6:8430，其全文通過引用并入本文)。

在一些實施方案中，單鏈rna序列如mirancer分子從5'端到3'端包含以下通式2的分子或由所述通式2的分子組成：

(n7-9)(n2)(n7)(n1)(n16-18)，

其中n為連續(xù)的核苷酸或其類似物，其后數(shù)字為核苷酸或其類似物的個數(shù)，其中n1與目標(biāo)microrna的5'端第一位的核苷酸(通常是u)互補，相應(yīng)的n7對應(yīng)于目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-8位，其中n2為插入的c或g以在所述5'端臂和3'端臂之間形成gc配對。在一些實施方案中，(n7)與目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-8位至少50％、60％、70％、80％、90％、或100％互補。在一些實施方案中，(n7)與目標(biāo)microrna從5'端到3'端的第2-8位完全互補。在一些實施方案中，緊鄰(n1)周圍(包括(n1)在內(nèi))的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13個核苷酸形成環(huán)；例如，在(n1)的5'端和3'端各具有1，2，3，4，5或6個核苷酸形成5'端和3'端臂，所述5'端和3'端臂之間不互補，從而形成環(huán)。在一些實施方案中，在(n1)的5'端和3'端各具有1，2，3，4，5或6個核苷酸形成5'端和3'端臂，所述5'端和3'端臂之間不互補，從而形成環(huán)，而不形成環(huán)的剩余核苷酸之間至少50％、60％、70％、80％、90％、或100％互補，形成莖。在一些實施方案中，在(n1)的5'端和3'端各具有1，2，3，4，5或6個核苷酸形成5'端和3'端臂，所述5'端和3'端臂之間不互補，從而形成環(huán)，而不形成環(huán)的剩余核苷酸之間100％互補，形成莖。

本文提供的mirancer可以是一種寡核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”是指通過共價連接兩種以上的核苷酸形成的分子。術(shù)語寡核苷酸通常包括寡核苷、寡核苷酸類似物、寡核苷酸模擬物和這些的嵌合組合。當(dāng)指核苷酸或單體序列時，其可以堿基序列，諸如，例如，a，t(或u)，g或c或其類似物的序列。

本文中“核苷酸”用在本文中是指包含糖結(jié)構(gòu)部分、堿基結(jié)構(gòu)部分和 共價連接的基團(如磷酸或硫代磷酸核苷酸間連接基團)的糖苷，并且包括天然存在的核苷酸(如dna或rna)和包含修飾的糖和/或堿基結(jié)構(gòu)部分的非天然存在的核苷酸，其在本文中還稱為“核苷酸類似物”。非天然存在的核苷酸包括具有修飾的糖結(jié)構(gòu)部分(如二環(huán)核苷酸或2’修飾的核苷酸，如2’取代的核苷酸)的核苷酸?！昂塑账犷愃莆铩笔翘烊淮嬖诘暮塑账?如dna或rna核苷酸)利用在糖和/或堿基結(jié)構(gòu)部分中的修飾產(chǎn)生的變體。類似物可以對所述寡核苷酸沒有功能性影響或具有功能性影響。例如，通過產(chǎn)生針對靶標(biāo)的增加的結(jié)合親和力和/或增加的對細(xì)胞內(nèi)核酸酶的抗性和/或增加的轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)的容易性。在一些實施方案中，所述mirancer分子包含1個、2個、3個或更多核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述寡聚體包含3-8個核苷酸類似物，例如6或7個核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述核苷酸類似物包括鎖定核酸(lna)。例如，所述核苷酸類似物中1個、2個、3個或更多核苷酸類似物可以是lna。

本文定義的修飾的rna分子可以含有核苷酸類似物/修飾，例如骨架修飾，糖修飾或堿基修飾。骨架修飾可以是核酸分子中包含的核苷酸骨架的磷酸酯被化學(xué)。修飾的修飾骨架的磷酸酯基團可以通過用不同取代基替代一個或多個氧原子來修飾，其實例包括例如硫代磷酸酯。糖修飾可以是核酸分子的核苷酸的糖的化學(xué)修飾，例如，2'羥基(oh)可以被很多不同"氧基"或"脫氧"取代基修飾或替代。堿基修飾可以是核酸分子的核苷酸的堿基部分的化學(xué)修飾。核苷酸類似物或修飾可以選自適于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸類似物。核苷酸類似物/修飾可以包括2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸酯，2'-氨基-2'-脫氧胞苷-三磷酸酯，2'-氟胸苷-5'-三磷酸酯，5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯，5-溴胞苷-5'-三磷酸酯，7-去氮雜鳥苷-5'-三磷酸酯，和假尿苷-5'-三磷酸酯等。修飾的核苷可以包括吡啶-4-酮核糖核苷，5-氮雜-尿苷，二氫假尿苷，2-硫代-二氫尿苷，2，6-二氨基嘌呤，n2,n2-二甲基鳥苷，n1-甲基-假尿苷，5,6-二氫尿苷，4-硫代-尿苷，5-羥基-尿苷，脫氧-胸苷，肌苷，α-硫代-鳥苷，6-甲基-鳥苷，5-甲基-胞苷，8-氧代-鳥苷，7-去氮雜-鳥苷，n1-甲基-腺苷，2-氨基-6-氯-嘌呤，假異-胞苷，6-氯-嘌呤等。

本文提供的mirancer分子可以包含或由長度總共為25，26，27，28， 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個連續(xù)的核苷酸序列組成。在一些實施方案中，所述寡核苷酸包含或由長度總共約為30–45個，諸如約33–40個，諸如約33-37個，諸如約33-35個連續(xù)核苷酸序列組成。在一些實施方案中，本發(fā)明所述的寡核苷酸由不超過40個核苷酸組成，諸如不超過38個核苷酸，諸如不超過34個核苷酸，諸如33、35或37個核苷酸。

2.組合物

本文提供包含mirancer分子的方法和組合物，所述mirancer當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時能增強microrna活性。此類方法和組合物包含mirancer表達(dá)載體?！癿irancer表達(dá)載體”是指包含mirancer分子的載體，其具有編碼mirancer的多核苷酸序列。mirancer表達(dá)載體被設(shè)計成從所述載體產(chǎn)生mirancer分子。

“microrna”或“mirna”是指寡核糖核酸，一般來講長度為約18至約25個核苷酸，其調(diào)控包含靶序列的多核苷酸的表達(dá)。microrna為非蛋白編碼rna，在動物和植物中已被鑒定。microrna被初始轉(zhuǎn)錄為長多腺苷酸化的rna，然后被加工形成具有形成穩(wěn)定發(fā)夾能力的較短序列。大多數(shù)microrna基因在rna聚合酶ⅱ的作用下合成pri-mirna。在細(xì)胞核內(nèi)pri-mirna經(jīng)drosha酶剪切，形成約70nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即pre-mirna。隨后，pre-mirna在dicer酶的作用下剪切產(chǎn)生microrna單鏈結(jié)構(gòu)，形成成熟microrna。

3.mirancer表達(dá)載體

本文提供mirancer表達(dá)載體。mirancer表達(dá)載體表達(dá)載體包含能被轉(zhuǎn)錄為mirancer序列的多核苷酸，所述mirancer序列能增強microrna活性。

在一些實施方案中，所述mirancer表達(dá)載體提供了形成具有類似發(fā) 夾rna結(jié)構(gòu)的mirancer分子。在一些實施方案中，所述mirancer分子可以穩(wěn)定microrna分子，從而調(diào)節(jié)所述microrna靶向基因的表達(dá)活性。所述mirna可來源于任何動物或植物。

在一些實施方案中，mirancer的5'端臂序列與mirna序列從第2位開始的連續(xù)核苷酸序列可以是100％、至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或更低互補的序列。在實施方案中，mirancer的5'端臂序列包含與mirna序列從第2位開始的連續(xù)核苷酸序列具有1、2、3、4、5或更多處錯配的序列，并仍具有足夠的互補與mirna序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)，生成mirna結(jié)合序列并增強所述microrna的活性。

由mirancer表達(dá)載體mirancer分子，并具有與microrna足夠互補的序列。與microrna靶序列的“足夠互補的序列”是指其互補性足夠使得mirancer分子與microrna結(jié)合并增加所述microrna的活性。在具體的實施方案中，具有與靶序列足夠互補的mirancer可與microrna靶序列共有100％互補的序列或可與靶序列共有小于100％互補的序列(即至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或更低互補的序列)。在其它實施方案中，mirancer與靶序列可具有1、2、3、4、5或至多6處錯配，只要mirancer與靶序列具有足夠的互補以增加靶序列的活性如半衰期。

在一些實施方案中，mirna序列可具有位于5'端的“u”。任選地，在mirna的5'端內(nèi)可加入一對堿基對變化，以使所述序列與靶序列相差一個核苷酸。

“靶序列”是指設(shè)計mirancer所靶向的microrna的序列。靶序列可以是內(nèi)源性序列，或者可以是導(dǎo)入的異源性序列。

由mirancer表達(dá)載體產(chǎn)生的mirancer能夠增加microrna的活性。用于測定microrna的活性的方法包括測量其靶向的基因/蛋白的表達(dá)的改變。在一些實施方案中，單個mirna可沉默蛋白和/或基因家族中的多個蛋白/基因或整個蛋白和/或基因家族。

“增加”表示相對于野生型生物體中microrna正常水平(或 microrna靶向的基因/蛋白水平)的增加。通過“增加mirancer活性”可以是增加表達(dá)活性至任一統(tǒng)計意義上的顯著性數(shù)量，例如相對于野生型表達(dá)活性增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％。

本文所述的mirancer分子可以被遞送到動物如哺乳動物包括人或植物細(xì)胞中的一種或多種中。

4.編碼mirancer表達(dá)載體的多核苷酸和制備方法

本文提供分離或重組體多核苷酸，其編碼mirancer表達(dá)載體、mirancer表達(dá)載體的各種組分、連同被加工成mirancer的mirancer表達(dá)載體的不同產(chǎn)物。

多核苷酸可以是rna或dna的聚合物，它們可以是單鏈或雙鏈，任選地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸堿基。dna聚合物形式的多核苷酸可由cdna、基因組dna、合成dna或它們的混合物的一個或多個片段構(gòu)成。多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。所述脫氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。本發(fā)明所述多核苷酸也涵蓋所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。

本文提供的組合物可包含分離或基本上經(jīng)純化的多核苷酸?！胺蛛x”或“純化的”多核苷酸，是基本上或本質(zhì)上不含那些在天然存在環(huán)境中正常伴隨多核苷酸或與其相互作用的游離組分。因此，分離或經(jīng)純化的多核苷酸基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)、或當(dāng)通過重組體技術(shù)生產(chǎn)時的培養(yǎng)基、或基本上不含當(dāng)通過化學(xué)合成時的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。在一些實施方案中，“分離”多核苷酸不含多核苷酸所來源于的生物的基因組dna中天然地存在于所述多核苷酸兩側(cè)(即，位于所述多核苷酸的5'和3'端)的序列。

還提供了包含mirancer表達(dá)載體和其不同組分的重組多核苷酸。重組載體包含人工的或異源的核酸序列的組合例如非天然共存的調(diào)控和編碼序列。在其它實施方案中，重組載體可包含來源于不同來源的調(diào)控序列 和編碼序列，或來源于相同來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。所述載體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。例如可以使用質(zhì)粒載體。為了成功地轉(zhuǎn)化、篩選和繁殖包括本發(fā)明任何分離核酸片段的宿主細(xì)胞，載體上可以包含的遺傳元件。因此為了獲得顯示期望的表達(dá)水平和模式的細(xì)胞系，可通過dna印跡分析、rna印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析等進(jìn)行篩選。

在具體的實施方案中，本文所述的一個或多個mirancer表達(dá)載體可以表達(dá)盒形式提供在不同細(xì)胞類型中表達(dá)。所述盒可包括5'和3'調(diào)控序列，其被可操作地與本文提供的多核苷酸連接。在轉(zhuǎn)錄的5'-3'方向中，所述表達(dá)盒可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、本文所提供的重組多核苷酸、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。

許多啟動子可用于本文提供的mirancer表達(dá)載體。通過在mirancer表達(dá)載體中使用不同啟動子，可以調(diào)節(jié)mirancer表達(dá)的時間、位置和/或水平。如果需要，mirancer表達(dá)載體可含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予誘導(dǎo)型、組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄起始開始位點、核糖體結(jié)合位點、rna加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。

5.導(dǎo)入的方法

本文提供的方法包括將mirancer表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，以提高目標(biāo)microrna的活性。本文提供的方法限于特定方法，只要使多核苷酸進(jìn)入宿主的至少一個細(xì)胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于病毒介導(dǎo)的方法。導(dǎo)入包括指將核酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且包括指將核酸或蛋白提供給細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方案以及用于將多核苷酸序列引入植物內(nèi)的方案可以根據(jù)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的類型而改變。

6.使用方法

提供了通過將mirancer表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞增加microrna活性的方法。本文提供的方法包括將mirancer表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中由mirancer表達(dá)載體產(chǎn)生的mirancer分子，其能增加microrna和/或改變(如增加或降低)所述microrna靶向的基因的活性。在一些實施方案中，可以將mirancer分子整合到基因組中目標(biāo)microrna靶向的基因的調(diào)節(jié)區(qū)(包括例如5'utr和/或3'utr和/或基因上游、下游、內(nèi)含子等區(qū)域)以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在一些實施方案中，本文提供的mirancer分子能夠增加microrna靶向的基因的基因表達(dá)，這是非常令人吃驚的，因為通常認(rèn)為microrna的作用是降低基因的表達(dá)。在一些實施方案中，本文提供的mirancer分子能夠改變目標(biāo)microrna的作用(例如，目標(biāo)microrna降低一些基因的表達(dá)，然后，通過將本文提供的mirancer分子或載體引入到所述基因的調(diào)節(jié)區(qū)，使得目標(biāo)microrna增加基因的表達(dá))。在一些實施方案中，可以通過針對期望調(diào)節(jié)的目的基因的相應(yīng)的microrna涉及相應(yīng)的mirancer分子，從而調(diào)節(jié)期望改變其表達(dá)的目的基因的表達(dá)。

7.活性變體

本文還提供在組合物和方法中應(yīng)用的多核苷酸的活性變體?！白凅w”是指基本上類似的序列。就多核苷酸而言，變體包括在多核苷酸的一個或多個內(nèi)部位點有一個或多個核苷酸的缺失和/或插入，和/或在多核苷酸的一個或多個位點有一個或多個核苷酸的置換。變體多核苷酸可包括合成來源的多核苷酸，諸如那些例如通過定點誘變生成的。一般來講，本文所公開的mirancer表達(dá)載體、單鏈rna分子、mirancer分子，與原型多核苷酸具有至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。用于比對的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的。比對序列、測定序列同一性的程序包括clustal、gap、bestfit、blast、fasta和tfasta等?？梢允褂媚J(rèn)參數(shù)進(jìn)行使用這些程序的比對。

8.目標(biāo)microrna分子

在一些實施方案中，本文的mirancer能夠作用的目標(biāo)microrna不受特定限制。例如，可以從現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中選擇希望被調(diào)節(jié)的目標(biāo)microrna分子。在一些實施方案中，可以根據(jù)希望調(diào)節(jié)的基因選擇所對應(yīng)的microrna分子。另外，可以通過生物信息學(xué)方法(例如應(yīng)用miranda、targetscan、rnahybrid等程序)尋找microrna所靶向的基因。

本文的mirancer分子可通過與目標(biāo)microrna分子結(jié)合提高所述microrna的活性。在一些實施方案中，當(dāng)與目標(biāo)microrna分子雜交時，所述寡核苷酸可以耐受1，2，3或4個(或更多個)錯配，并且仍然與所述靶標(biāo)充分結(jié)合，以顯示出需要的作用(例如，提高所述microrna的活性)。例如，錯配可以由所述核苷酸序列內(nèi)存在的增加長度的寡核苷酸序列和/或增加數(shù)量的核苷酸類似物(如鎖定核酸(lna))而得到補償。在一些實施方案中，當(dāng)與目標(biāo)microrna分子雜交時，所述連續(xù)的核苷酸序列包含不超過3個錯配(例如，不超過1個或不超過2個錯配)。在一些實施方案中，當(dāng)與目標(biāo)microrna分子雜交時，所述連續(xù)的核苷酸序列包含不超過一個錯配。

本發(fā)明的mirancer分子優(yōu)選地與microrna分子在互補區(qū)至少80％互補，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，諸如至少100％互補。

在一些實施方案中，所述mirancer可以包含另外的5’或3’核苷酸或修飾，諸如，獨立地1，2，3，4或5個另外的核苷酸5’和/或3’，其與靶序列不互補。在這一方面，在一些實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸可以包含在5’和或3’側(cè)連另外的核苷酸的連續(xù)的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述另外的5’或3’核苷酸是天然存在的核苷酸，諸如dna或rna。在一些實施方案中，所述另外的5’或3’核苷酸可以是核苷酸類似物?；パa區(qū)可以包括microrna分子的第2-12、2-13位，2-14、2-15、2-16、2-17、 2-18位。

9.藥物組合物

本發(fā)明的mirancer分子、載體、細(xì)胞可以用在藥物制劑和組合物中，也可制備成方便應(yīng)用的試劑盒。適當(dāng)?shù)?，所述組合物或試劑盒包含藥用溶劑，諸如水或鹽水，稀釋劑，載體，鹽或輔藥。

本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的寡核苷酸的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以多種方式施用，取決于是需要局部治療還是系統(tǒng)治療，以及取決于待治療的區(qū)域。

10.應(yīng)用

本發(fā)明的寡核苷酸可以用作研究試劑，例如，用于診斷、治療和預(yù)防。在研究中，所述寡核苷酸可以用于特異性結(jié)合目標(biāo)microrna，可以增加其活性，由此促進(jìn)對靶標(biāo)的功能性分析或?qū)ζ渥鳛橹委煾深A(yù)的靶標(biāo)的評估。

在診斷劑中，所述寡核苷酸可以用于通過rna印跡、原位雜交或相似的技術(shù)來檢測并定量細(xì)胞中組織中的目標(biāo)microrna水平。

對于治療劑，懷疑患有可以通過調(diào)節(jié)目標(biāo)microrna靶向的基因的表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病癥的動物或人可以通過施用本發(fā)明所述的寡核苷酸進(jìn)行治療。進(jìn)一步提供治療懷疑患有或傾向于患有與目標(biāo)microrna靶向的基因的表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥的哺乳動物(如治療人)的方法，所述通過通過施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的寡核苷酸或組合物。本發(fā)明所述的寡核苷酸或藥物組合物典型地以有效量施用。

本發(fā)明還提供用于治療疾病如腫瘤的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用本文所述的寡核苷酸分子或包含所述分子的藥物組合物。

11.實驗結(jié)果

試劑和材料

以下實驗中用到的細(xì)胞系為mcf-7人乳腺癌細(xì)胞系,購于atcc,培養(yǎng)基為rpmi-1640,購于gibco,胎牛血清fbs購于gibco。轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000,購于invitrogen.質(zhì)粒psilencer4.1cmv購于ambion公司，質(zhì)粒psicheck2及雙熒光素酶檢測試劑盒購于promega公司。引物合成由上海生工完成，mimics合成由上海吉瑪完成。

重組質(zhì)?？寺》椒槌Ｒ?guī)方法，測序由上海生工完成，細(xì)節(jié)在下文中闡述。

雙熒光素酶報告實驗按照試劑盒(promegae1910)說明書進(jìn)行。

實驗過程

1.設(shè)計有高級結(jié)構(gòu)的microrna結(jié)合序列。

首先，microrna的結(jié)合序列被設(shè)計為有類似發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈rna，發(fā)卡結(jié)構(gòu)5'端臂通過堿基互補配對與microrna結(jié)合，而3'端臂則通過堿基互補配對與5’端臂結(jié)合。為了防止dicer1的加工和類似sirna效應(yīng)發(fā)發(fā)生，優(yōu)選的雙鏈的長度在18個核苷酸以內(nèi)。

然后，在發(fā)卡結(jié)構(gòu)的拐角處分別引入7nt或13nt的環(huán)結(jié)構(gòu)，用以確定不同結(jié)構(gòu)可能帶來的潛在功能。

再后，在發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的中部插入兩對gc以穩(wěn)定rna二級結(jié)構(gòu)。

最后，也設(shè)計了一個線性的microrna結(jié)合序列作為陰性對照。

這樣，就得到了8種不同形式的示例性microrna結(jié)合序列(以mir-7和mir-9為例)。圖1顯示了mir-7結(jié)合序列的不同形式；圖2顯示了mir-9結(jié)合序列的不同形式。

2.制備表達(dá)載體。

選用psilencer4.1cmv質(zhì)粒作為小發(fā)卡rna的表達(dá)載體。質(zhì)粒經(jīng)過 bamhi和hindiii雙酶切后，用1％的瓊脂糖膠分離，然后用axyprepdnaextractionkit(ap-gx-50)回收，存放于-20℃。

3.制備插入序列。

合成了如下dna序列：

mir-7結(jié)合序列a正向:

gatccaaaatcactagtcttccaggaagactagtgatttta

mir-7結(jié)合序列a反向:

agcttaaaatcactagtcttcctggaagactagtgattttg

mir-7結(jié)合序列b正向:

gatccaaaatcactagtcttccacctagactagtgattta

mir-7結(jié)合序列b反向:

agcttaaaatcactagtctaggtggaagactagtgattttg

mir-7結(jié)合序列c正向:

gatccaaaatcactagtcttccaccttctctagtgatttta

mir-7結(jié)合序列c反向:

agcttaaaatcactagagaaggtggaagactagtgattttg

mir-7結(jié)合序列d正向:

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mir-7結(jié)合序列d反向:

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mir-7結(jié)合序列e正向:

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mir-7結(jié)合序列e反向:

agcttaatcactaccgtcttcctggaagacggtagtgattg

mir-7結(jié)合序列f正向:

gatccaatcactaccgtcttccacctagacggtagtgatta

mir-7結(jié)合序列f反向:

agcttaatcactaccgtctaggtggaagacggtagtgattg

mir-7結(jié)合序列g(shù)正向:

gatccaatcactaccgtcttccaccttctcggtagtgatta

mir-7結(jié)合序列g(shù)反向:

agcttaatcactaccgagaaggtggaagacggtagtgattg

mir-7結(jié)合序列h正向:

gatccaatcactaccgtcttccaa

mir-7結(jié)合序列h反向:

agctttggaagacggtagtgattg

mir-9結(jié)合序列a正向:

gatcccagctagataaccaaagactttggttatctagctga

mir-9結(jié)合序列a反向:

agcttcagctagataaccaaagtctttggttatctagctgg

mir-9結(jié)合序列b正向:

gatcccagctagataaccaaagagaatggttatctagctga

mir-9結(jié)合序列b反向:

agcttcagctagataaccattctctttggttatctagctgg

mir-9結(jié)合序列c正向:

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mir-9結(jié)合序列c反向:

agcttcagctagataaggtttctctttggttatctagctgg

mir-9結(jié)合序列d正向:

gatcccagctagataaccaaagaa

mir-9結(jié)合序列d反向:

agctttctttggttatctagctgg

mir-9結(jié)合序列e正向:

gatccgctagataccaccaaagactttggtggtatctagca

mir-9結(jié)合序列e反向:

agcttgctagataccaccaaagtctttggtggtatctagcg

mir-9結(jié)合序列f正向:

gatccgctagataccaccaaagagaatggtggtatctagca

mir-9結(jié)合序列f反向:

agcttgctagataccaccattctctttggtggtatctagcg

mir-9結(jié)合序列g(shù)正向:

gatccgctagataccaccaaagagaaacctggtatctagca

mir-9結(jié)合序列g(shù)反向:

agcttgctagataccaggtttctctttggtggtatctagcg

mir-9結(jié)合序列h正向:

gatccgctagataccaccaaagaa

mir-9結(jié)合序列h反向:

agctttctttggtggtatctagcg

這些dna序列兩兩成對在1×tebuffer中按如下程序退火：

95℃2min

touchdownat0.1℃every8s

4℃30min

退火后的dna序列連接入psilencer4.1cmv質(zhì)粒的bamhi和hindiii之間，使用的試劑盒是takaraligationkit(d6022)。重組質(zhì)粒通過測序確認(rèn)序列正確。

4.制備microrna報告載體。

在psi-check2質(zhì)粒的xhoi和noti之間插入microrna的結(jié)合位點以獲得microrna報告載體。圖3顯示了mir-7reporter和mir-9reporter的示意圖。

5.熒光素酶報告實驗.

向mcf-7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了mir-7結(jié)合序列和mir-7reporter,然后按照說明做了雙熒光素酶報告實驗(promegae1910)。圖4顯示了過表達(dá)mirancers后的mir-7reporter或mir-9reporter的熒光素酶活性。*,p<0.05,**,p<0.01bystudent'st-test.

選擇f型作為優(yōu)選的可以增強microrna活性的microrna結(jié)合序列。將所有的可以增強microrna活性的序列稱為microrna增強子，簡稱 mirancers.

6.優(yōu)化mirancer結(jié)構(gòu)

以f型為原型，繼續(xù)摸索合適的mirancer結(jié)構(gòu)，通過縮短或延長mirancer的stem區(qū)結(jié)構(gòu)，得到了含有15bp(mir-7結(jié)合序列f1)或13bp(mir-7結(jié)合序列f2)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，二者均仍然可以起作用。圖5顯示不同莖長的mir-7結(jié)合序列示意圖。圖6顯示過表達(dá)不同莖長的mirancers后mir-7reporter的熒光素酶活性**，p<0.01bystudent'st-test。

7.化學(xué)合成mirancers.

進(jìn)而根據(jù)f型用化學(xué)方法合成了mirancer(上海吉瑪)。針對果蠅中的bantammirna設(shè)計的mirancer作為對照。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的mirancers也可以特異地影響microrna的活性和水平。圖7顯示過表達(dá)mirancer后mir-7reporter或mir-9reporter的熒光素酶活性。**,p<0.01bystudent'st-test.圖8顯示過表達(dá)mirancer后mir-7或mir-9的表達(dá)水平。***，p<0.001bystudent'sttest。

8.mirancermotif增強基因表達(dá).

在luciferase的上游分別插入mirancer-7,mir-7sponge,mirancer-9,mir-9sponge，然后分別與mir-7mimics,mir-9mimics(上海吉瑪)共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)含有mirancer的luciferase可以被相應(yīng)的mirna穩(wěn)定，而含有sponge的luciferase則被相應(yīng)的mirna抑制。這說明mirancer可以用來增強基因的表達(dá)。圖9顯示含有mirancer或sponge序列的熒光素酶報告載體示意圖。圖10顯示過表達(dá)mir-7或mir-9對不同熒光素酶活性的影響。*，p<0.05,**,p<0.01,***,p>0.001bystudent’sttest。