人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，以改良的肽庫(kù)消減篩選法篩選對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7 細(xì)胞)特異性結(jié)合的多肽(序列），對(duì)人乳腺癌細(xì)胞具有良好的結(jié)合特異性和敏感性。 技術(shù)背景
[0002] 乳腺癌（breast cancer)是女性排名第一的惡性腫瘤，占女性新發(fā)惡性腫瘤的 30%，嚴(yán)重危害著婦女健康。據(jù)國(guó)際癌癥研究中心統(tǒng)計(jì)，全球每年約有46萬(wàn)女性因乳腺癌死 亡，約占所有女性惡性腫瘤死亡的13.7%。近年來(lái)在我國(guó)特別是在一些大城市及沿海經(jīng)濟(jì) 發(fā)展較快的地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。
[0003] 目前，針對(duì)乳腺癌的主要治療方法是影像檢查、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)以及穿刺活檢等， 但是這些方法也可能會(huì)引起癌細(xì)胞擴(kuò)散，產(chǎn)生創(chuàng)傷等問(wèn)題。目前已有的一些腫瘤標(biāo)志物大 部分是乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物，但是這些標(biāo)志物大都特異性和靈敏度較低，治療效果不明 顯。所以，盡快尋找一些新的乳腺腫瘤標(biāo)志物也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，而其中的關(guān)鍵元件是對(duì) 癌細(xì)胞、癌組織具有特異靶向結(jié)合活性的分子片段的獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供以改良的肽庫(kù)消減篩選由噬菌體12肽庫(kù)篩選得到對(duì)乳腺 癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽序列，并提供鑒定該多肽與乳腺癌細(xì)胞特異性親和力的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，證明該多肽在乳腺癌的早期分子影像學(xué)診斷、靶向化療、與其它材料偶聯(lián)而進(jìn)行的乳腺 癌靶向治療等方面具有的巨大應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：
[0006] 乳腺癌MCF-7細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列為:HPLGPTWRiroT。該多肽能 夠特異性結(jié)合MCF-7細(xì)胞，而不識(shí)別人胚腎HEK293細(xì)胞（即正常細(xì)胞），并對(duì)其他腫瘤細(xì)胞表 現(xiàn)出極低的親和力或者無(wú)親和力。
[0007] 上述乳腺癌MCF-7細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的篩選方法為以體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞 系為靶細(xì)胞，以人胚腎HEK293細(xì)胞系為非特異性吸附細(xì)胞，對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行4輪消 減篩選，隨機(jī)挑取60個(gè)噬菌體克隆，利用ELISA鑒定陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，分 析其多肽的氨基酸序列組成及基本特征，最后獲得擁有共有序列(Consensus sequence)的 強(qiáng)陽(yáng)性克隆組3個(gè)，對(duì)它們以細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)一步鑒定其特異性和敏感性，確定最佳序 列。
[0008] 各種噬菌體克隆水平、最佳序列合成肽探針?biāo)降膶?shí)驗(yàn)結(jié)果均提示序列 HPLGPTWRIPDT特異性、敏感性最佳，這為該多肽未來(lái)用于乳腺癌的早期分子影像學(xué)診斷、靶 向化療、與其它材料偶聯(lián)而進(jìn)行的乳腺癌靶向治療等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0009] 本發(fā)明以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體12肽庫(kù)以我們改良的消減篩選法 進(jìn)行了 4輪消減篩選，最后獲得3條共同多肽序列，分別為HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、 ANIDSSHHGNQP。通過(guò)一系列鑒定分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中的HPLGPTWRIPDT對(duì)于乳腺癌的靶向性最 強(qiáng)，提示了其用于乳腺癌診斷、靶向治療方面的價(jià)值。
[0010]在乳腺癌檢測(cè)方面，利用同位素或者熒光標(biāo)記的多肽可以特異性結(jié)合乳腺癌細(xì) 胞/組織，適用于腫瘤成像和分子影像診斷，對(duì)于乳腺癌早期檢測(cè)、癌病灶定位和療效評(píng)價(jià) 都具有重要意義;在乳腺癌靶向治療方面，有望利用其特異性高、分子量小、穿透力強(qiáng)、親和 力高的特性來(lái)與傳統(tǒng)化療藥物(如順鉑、阿霉素等)偶聯(lián)，達(dá)到靶向遞送給藥的目的，可大大 減小化療藥物的非特異性和毒副作用。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明多肽的制備路線(xiàn)圖；
[0012] 圖2為隨機(jī)十二肽pill融合蛋白的N末端序列；
[0013] 圖3為專(zhuān)用密碼子表；
[0014] 圖4為60個(gè)噬菌體克隆與MCF-7細(xì)胞親和力兩次ELISA鑒定結(jié)果；
[0015]圖5為三條共有序列的代表性陽(yáng)性噬菌體克隆與細(xì)胞親和力的免疫熒光鑒定，其 中:A、C、E分別為:噬菌體克隆Q35、Q3、Q41與細(xì)胞MCF-7的親和力;B、D、F分別為:噬菌體克隆 Q35、Q3、Q41與細(xì)胞HEK293的親和力;G、H分別為:PBS、URPs與細(xì)胞MCF-7的親和力；
[0016] 圖6為克隆Q35(HPLGPTWRIPDT)與其它腫瘤細(xì)胞親和力鑒定，其中：A:MCF-7;B: SiHa(宮頸癌細(xì)胞）；C:Caco2(結(jié)直腸癌細(xì)胞）；D:SGC-7901(胃癌細(xì)胞）；E:SMMC-7721(肝癌 細(xì)胞）；F:Eca-109(食道癌細(xì)胞）；
[0017]圖7為多肽(HPLGPTWRIPDT)與細(xì)胞特異性結(jié)合的劑量效應(yīng)，其中：A、B、C、D、E為多 肽與乳腺癌細(xì)胞MCF-7結(jié)合;？、6、11、1、1為多肽與人胚腎細(xì)胞冊(cè)1(293結(jié)合，兩組濃度分別為 1 OuM、15虛、2 OuM、2 5虛、3 OuM;
[0018] 圖8為多肽(HPLGPTWRIPDT)與細(xì)胞特異性結(jié)合的時(shí)間效應(yīng)，其中：A、B、C、D、E為多 肽與乳腺癌細(xì)胞MCF-7結(jié)合;？、6、11、1、1為多肽與人胚腎細(xì)胞冊(cè)1(293結(jié)合，兩組孵育時(shí)間分 另lj 為 10min、20min、40min、60min、80min;
[0019]圖9為多肽(HPLGPTWRIPDT)與乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合部位，其中：A、C:FITC-陽(yáng)性多肽 與 MCF-7、HEK293細(xì)胞;B、D: FI TC-陰性多肽與 MCF-7、HEK293細(xì)胞；
[0020]圖10為多肽(HPLGPTWRiroT)與其它腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特異性，其中：A:SiHa(宮頸癌 細(xì)胞）；B: SKV3 (卵巢癌細(xì)胞）；C: Cac〇2 (結(jié)直腸癌細(xì)胞）；D: SGC-7901 (胃癌細(xì)胞）；E: SMMC-7721(肝癌細(xì)胞）；F:Eca-109(食道癌細(xì)胞）；
[0021]圖11為流式細(xì)胞儀檢測(cè)多肽(HPLGPTWRIH)T)的結(jié)合特異性，其中:A:乳腺癌MCF-7 細(xì)胞;B:HEK293細(xì)胞。綠色：FITC-Brca Probe;紅色：FITC-Ctrl Probe;黑色：PBS;
[0022] 圖12為多肽(HPLGPTWRiroT)競(jìng)爭(zhēng)抑制：多肽（HPLGPTWRiroT)孵育靶細(xì)胞后，再以 噬菌體克隆Q35孵育靶細(xì)胞，洗滌后根據(jù)噬菌體發(fā)出熒光的強(qiáng)弱分析多肽的特異性結(jié)合力。 該競(jìng)爭(zhēng)抑制力與多肽濃度正相關(guān)，說(shuō)明多肽特異性良好。
[0023]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 菌體展示技術(shù)是1985年由美國(guó)Missouri大學(xué)的G.P. Smith等創(chuàng)立的一項(xiàng)能夠特 異性篩選多肽或蛋白的技術(shù)。該技術(shù)將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌 體表面，與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，被展示的多肽或蛋白能夠保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié) 構(gòu)和生物活性。目前，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、腫瘤藥物的靶 向運(yùn)輸和多肽藥物開(kāi)發(fā)等方面的研究。
[0025] 本發(fā)明就是利用上述肽庫(kù)以改良的肽庫(kù)消減篩選法篩選可以特異敏感的結(jié)合于 人乳腺癌細(xì)胞的一條多肽序列，并以相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了該序列對(duì)人乳腺癌細(xì)胞結(jié)合的高度特 異性和敏感性。該多肽具有親和力高、分子量小、組織穿透性強(qiáng)、免疫原性低、易合成等特 點(diǎn)，將其連接其它效應(yīng)分子，可以用于乳腺癌的早期分子影像學(xué)診斷，形成腫瘤三維成像， 大大提高乳腺癌的早期診斷率，并可對(duì)治療療效評(píng)價(jià);作為乳腺癌化療藥物的導(dǎo)向元件而 用于乳腺癌的靶向化療，可大大降低藥物毒性而提高療效，使化療成為對(duì)病人確實(shí)有益的 治療方法之一;將多肽與納米脂質(zhì)體或納米藥物偶聯(lián)，可達(dá)到更好的靶向治療效果；用于尋 找腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)配體的研究，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)。
[0026] 本發(fā)明以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體肽庫(kù)以改良的肽庫(kù)消減篩選法 進(jìn)行4輪消減篩選，尋找與乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有特異性結(jié)合力的噬菌體肽序，為進(jìn)一步研 發(fā)乳腺癌早期靶向診斷試劑和高效低毒靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)，具體技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示。 [0027] 一、材料與方法
[0028] 1.1主要實(shí)驗(yàn)材料
[0029] 1.1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,購(gòu)于美國(guó)ATCC(Rockville，USA)，人胚腎細(xì)胞 株HEK293，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0030] 1.1.2噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)貯存:與甘油1:1保存在TBS溶液中，1.5 X 1013pfu/ml。 復(fù)雜度:~2.7X109個(gè)轉(zhuǎn)化子。載體M13KE的外殼基因-96gIII測(cè)序引物:5'- HQCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,。
[0031] 1.1.3宿主菌￡.(：〇11￡1?2738，與甘油1:1保存在-80°(：超低溫冰箱中。
[0032] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0033] 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0034] 用DMEM完全培養(yǎng)基、37 °C、飽和濕度、5 % C02孵箱。
[0035] 1.2.2宿主菌￡.(：〇11￡1?2738的準(zhǔn)備
[0036] E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌體肽庫(kù)的專(zhuān)用菌株。用LB-Tet培養(yǎng)基、 37 °C恒溫?fù)u床、300rpm振蕩過(guò)夜。
[0037] 1.2.3噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)體外快速消減篩選
[0038]以人胚腎細(xì)胞HEK293作為陰性吸附細(xì)胞預(yù)吸附以排除非正常細(xì)胞靶向克隆，再以 人乳腺癌細(xì)胞M C F - 7和作為靶細(xì)胞，對(duì)靶向乳腺癌克隆以改良后的消減篩選法 (Subtraction Biopanning)進(jìn)行淘篩，重復(fù)4輪。相對(duì)于菌體肽庫(kù)試劑盒生產(chǎn)商--美國(guó) 新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司（New England BioLabs Inc.，NEB)提供的傳統(tǒng)經(jīng)典Biopanning 方法（見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)），在此基礎(chǔ)上，改良的消減篩選法每一輪Biopanning的特色如下： (1)每輪第一步增加了以正常細(xì)胞對(duì)投入噬菌體肽庫(kù)的預(yù)吸附，以盡可能除去非癌細(xì)胞靶 向的噬菌體克隆；（2)將傳統(tǒng)步驟要求的"擴(kuò)增"步驟的25ml菌液體積改為3ml。這一改變大 大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)難度和提高了篩選效率；（3)由于第（2)項(xiàng)改變，最后一輪（一般做4輪 Biopanning)可以隨機(jī)挑選至少60個(gè)或更多的菌體克隆。
[0039]最后一輪隨機(jī)選擇60個(gè)克隆擴(kuò)增以后以ELISA法鑒定與靶細(xì)胞MCF-7的親和力。
[0040] 1.2.4陽(yáng)性噬菌體克隆多肽序列的測(cè)定
[0041] 對(duì)噬菌體陽(yáng)性克隆、無(wú)關(guān)克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)遺傳密碼子表格(參見(jiàn)圖2、圖3)，將 多肽序列翻譯成氨基酸序列并獲得Consensus序列。
[0042] 1 ? 2 ? 5Consensus序列的結(jié)合特異性鑒定
[0043] 以Consensus序列的代表性克隆通過(guò)常規(guī)細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行結(jié)合特異性和敏感 性的鑒定。
[0044] 1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0045] 利用SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用f 土 SD表示，P〈0.01表 示差異極顯著，P〈〇. 05表示差異顯著，P>0.05說(shuō)明差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間多重比 較采用Duncan檢驗(yàn)處理。
[0046] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0047] 2.1陽(yáng)性克隆的ELISA鑒定和測(cè)序
[0048]獲得陽(yáng)性噬菌體克隆36個(gè)，其中克隆Q35與MCF-7細(xì)胞結(jié)合特異性最高，結(jié)果如圖4 所示。陽(yáng)性噬菌體克隆有3個(gè)共有序列:HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、ANIDSSHHGNQP。
[0049] 2.2陽(yáng)性噬菌體克隆的結(jié)合特異性
[0050] 結(jié)果如圖5和圖6所示，陽(yáng)性噬菌體克隆均結(jié)合MCF-7細(xì)胞而不與HEK293細(xì)胞結(jié)合， 以克隆Q35(HPLGPTWRIH)T)最佳，說(shuō)明陽(yáng)性多肽有很好的靶向性。
[0051 ] 2.3多肽HPLGPTWRIPDT的特異性和敏感性鑒定
[0052] 結(jié)果如圖7-圖12所示。多肽HPLGPTWRIPDT特異結(jié)合MCF-7細(xì)胞而不與HEK293及其 他細(xì)胞結(jié)合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列為： HPLGPTWRIPDT。2. 權(quán)利要求1所述多肽特異結(jié)合人乳腺癌細(xì)胞的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述多肽用于制備治療人乳腺癌藥物的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用，所涉及多肽的氨基酸序列為：HPLGPTWRIPDT。所涉及的應(yīng)用為本發(fā)明的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7特異性結(jié)合的多肽特異結(jié)合人乳腺癌的應(yīng)用。本發(fā)明篩選和初步鑒定獲得的乳腺癌靶向多肽具有明顯的乳腺癌細(xì)胞結(jié)合特異性，可用于研發(fā)乳腺癌早期靶向診斷試劑、高效低毒靶向治療藥物。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, A61K47/42, C07K7/08
【公開(kāi)號(hào)】CN105713070
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610085381
【發(fā)明人】侯穎春, 肖麗, 高曉杰, 何慧敏, 薛琴琴, 韓娟娟, 達(dá)苗苗, 馬樂(lè)樂(lè), 馬妮, 程思楠
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)