本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種pml/rarα融合基因檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，apl)是急性髓細(xì)胞白血病的一種特殊類型，被fab協(xié)作組定為急性髓細(xì)胞白血病m3型，其特點(diǎn)是骨髓及其他造血組織中有大量白血病細(xì)胞無限制地增生，并進(jìn)入外周血液，而正常血細(xì)胞的制造被明顯抑制，該病居年輕人惡性疾病中的首位，病因至今仍不完全清楚。95％的apl患者具有t(15；17)染色體異常，形成的pml-rarα融合基因是其分子標(biāo)志。位于15q22的pml基因與位于17q21的rarα基因相互易位，形成pml-rarα融合基因。由于pml基因的斷裂點(diǎn)不同，而rarα斷裂點(diǎn)恒定(2號(hào)內(nèi)含子)，導(dǎo)致可以產(chǎn)生相應(yīng)的3種不同pml-rarα融合基因的異構(gòu)體：位于第6內(nèi)含子的斷裂點(diǎn)，形成長(zhǎng)型(l型)融合基因，約占病人的55％；位于第3內(nèi)含子的斷裂點(diǎn)，形成短型(s型)融合基因，約占病人的40％；位于第6外顯子的斷裂點(diǎn)，形成變異型(v型)融合基因，約占病人的5％；其中以長(zhǎng)型和短型融合基因?yàn)橹?。pml-rarα融合基因表達(dá)的融合蛋白干擾了正常rarα在核內(nèi)的分布和對(duì)細(xì)胞分化的調(diào)控，使大量細(xì)胞阻滯在早幼細(xì)胞階段，在apl發(fā)病機(jī)制中起重要作用。有研究報(bào)道，在復(fù)發(fā)前的3～6個(gè)月pml/rarα融合基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)顯著增強(qiáng)；緩解1年，查pml/rarα融合基因仍可陽性。由此可見，pml/rarα融合基因的預(yù)報(bào)復(fù)發(fā)，即使經(jīng)治者只含少量殘留細(xì)胞同樣可檢測(cè)到。不同的基因異構(gòu)體分型的預(yù)后有明顯不同，s型患者緩解前的死亡率及緩解后的復(fù)發(fā)率均高于l型。因此，對(duì)pml/rarα融合基因進(jìn)行檢測(cè)和分型，能更好地指導(dǎo)患者分子靶向治療及預(yù)后判斷。目前，pml-rarα融合基因的檢測(cè)方法主要包括以下3種：細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)、基于pcr方法的檢測(cè)和fish檢測(cè)。細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)需培養(yǎng)細(xì)胞，耗時(shí)較長(zhǎng)，只能檢測(cè)中期的細(xì)胞，且成功率和靈敏度低；基于pcr的檢測(cè)如rt-pcr、q-pcr等易污染，假陽性率高，只能檢測(cè)已知的斷裂點(diǎn)，對(duì)未知或含少量轉(zhuǎn)錄本的pml-rarα融合基因無法檢出。fish檢測(cè)對(duì)病人外周血或骨髓的pml-rarα融合基因具有極高的靈敏度和檢測(cè)隱匿型易位的能力，其假陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于pcr檢測(cè)，能提供相對(duì)于核型分析更為可靠的分子遺傳學(xué)證據(jù)，可用于預(yù)后判斷、用藥療效、微小病灶殘留及移植術(shù)后效果的監(jiān)測(cè)。雖然。目前fish檢測(cè)方法得到了廣泛的應(yīng)用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)以bac為模板制備的探針中存在較多的重復(fù)序列，影響雜交的特異性，同時(shí)造成較高的背景熒光；(2)檢測(cè)步驟繁雜，探針序列過長(zhǎng)，探針與樣本雜交往往需要12-16h才能保證充分雜交，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；(3)一些優(yōu)化的探針序列過短，導(dǎo)致檢測(cè)特異性降低且信號(hào)微弱難以被檢測(cè)；(4)由于斷裂點(diǎn)之間距離較近，現(xiàn)有的fish產(chǎn)品不能對(duì)pml-rarα融合基因進(jìn)行分型。因此，急需一種fish檢測(cè)方法，其探針不含重復(fù)序列、長(zhǎng)度適宜，既能保證雜交反應(yīng)的特異性和最佳的熒光檢測(cè)強(qiáng)度，又能最大限度縮短fish檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，提高檢測(cè)特異性和檢測(cè)效率，同時(shí)可區(qū)分pml-rarα融合基因類型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)效率高的pml-rarα融合基因檢測(cè)試劑盒。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種pml-rarα融合基因檢測(cè)試劑盒，包括有針對(duì)pml基因l型斷裂熱點(diǎn)上游基因序列的第一組探針和針對(duì)rarα全基因序列的第二組探針；兩組探針標(biāo)記有染料，同一組探針的染料顏色相同，不同組探針的染料顏色不同；所述兩組探針為分別以人基因組dna為模板，通過擴(kuò)增引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；針對(duì)所述第一組探針的擴(kuò)增引物為：選自seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12、seqidno.13和seqidno.14、seqidno.15和seqidno.16、seqidno.17和seqidno.18、seqidno.19和seqidno.20、seqidno.21和seqidno.22、seqidno.23和seqidno.24、seqidno.25和seqidno.26、seqidno.27和seqidno.28、seqidno.29和seqidno.30中的至少一對(duì)；針對(duì)所述第二組探針的擴(kuò)增引物為：選自seqidno.31和seqidno.32、seqidno.33和seqidno.34、seqidno.35和seqidno.36、seqidno.37和seqidno.38、seqidno.39和seqidno.40、seqidno.41和seqidno.42、seqidno.43和seqidno.44、seqidno.45和seqidno.46、seqidno.47和seqidno.48、seqidno.49和seqidno.50、seqidno.51和seqidno.52、seqidno.53和seqidno.54、seqidno.55和seqidno.56、seqidno.57和seqidno.58、seqidno.59和seqidno.60中的至少一對(duì)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為100-500bp。在其中一個(gè)實(shí)施例中，針對(duì)所述第一組探針的擴(kuò)增引物選自上述引物對(duì)中的至少三對(duì)，針對(duì)所述第二組探針的擴(kuò)增引物選自上述引物對(duì)中的至少三對(duì)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，針對(duì)所述第一組探針的擴(kuò)增引物選自上述引物對(duì)中的至少六對(duì)，針對(duì)所述第二組探針的擴(kuò)增引物選自上述引物對(duì)中的至少六對(duì)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光染料選自：fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texasred、lcred640、cy5、lcred705、alexafluor488和alexafluor750，且針對(duì)不同探針組的熒光染料互不相同。本發(fā)明的另一目的，在于提供一種pml-rarα融合基因檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種pml-rarα融合基因檢測(cè)方法，包括以下步驟：(1)待測(cè)樣本預(yù)處理和制片；(2)使用上述pml-rarα融合基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行雜交檢測(cè)；(3)在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，對(duì)不同熒光信號(hào)進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，使用上述pml-rarα融合基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行雜交檢測(cè)，包括以下步驟：(2.1)探針平衡至室溫；準(zhǔn)備好具有雜交區(qū)域的切片樣本；(2.2)預(yù)變性：將切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脫水；烘干；(2.3)雜交：在切片樣本的雜交區(qū)域加入探針溶液，進(jìn)行雜交反應(yīng)；(2.4)洗滌；(2.5)dapi復(fù)染。在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2.3)中雜交反應(yīng)條件為，42±1℃雜交4±0.5h。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明fish探針的長(zhǎng)度是發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和統(tǒng)計(jì)分析后得出的最優(yōu)長(zhǎng)度，能達(dá)到檢測(cè)特異性和雜交時(shí)長(zhǎng)之間的最優(yōu)平衡，既能保證結(jié)果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時(shí)間，使得檢測(cè)能在7-8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，提高了檢測(cè)效率。(2)常規(guī)的fish探針標(biāo)記方法不能實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大，因此需要較長(zhǎng)的探針才能保證檢測(cè)的靈敏度，從而導(dǎo)致雜交時(shí)間過長(zhǎng)。本發(fā)明采用新的探針標(biāo)記方法，能將探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行放大，大大提高檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明通過信號(hào)放大的探針標(biāo)記方法與探針長(zhǎng)度的優(yōu)化，極大縮短了探針與目的基因充分雜交所需時(shí)長(zhǎng)，提高了檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率。(3)由于pml基因s和l型斷裂點(diǎn)之間距離較近，常規(guī)的fish探針不能有效區(qū)分兩種斷裂類型。本發(fā)明通過fish探針的設(shè)計(jì)和新型探針標(biāo)記方法，具有很強(qiáng)的特異性，背景噪音低，大大提高了fish探針的分辨率，實(shí)現(xiàn)了s和l型pml-rarα融合基因的分型檢測(cè)。附圖說明圖1是本發(fā)明信號(hào)計(jì)數(shù)指南-典型陽性細(xì)胞信號(hào)模式；圖2是本發(fā)明信號(hào)計(jì)數(shù)指南-典型陰性細(xì)胞信號(hào)模式。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。實(shí)施例1試劑盒組成本實(shí)施例所述的pml-rarα融合基因檢測(cè)試劑盒，主要包括有：一、熒光染料標(biāo)記的探針?biāo)鎏结槹ㄓ嗅槍?duì)pml基因l型斷裂熱點(diǎn)上游基因序列的第一組探針和針對(duì)rarα全基因序列的第二組探針。所述探針以人外周血細(xì)胞dna為模板，利用30對(duì)特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)而得到，其制備方法如下：1、擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)位于15q22的pml基因與位于17q21的rarα基因相互易位，形成pml-rarα融合基因。由于pml基因的斷裂點(diǎn)不同，而rarα斷裂點(diǎn)恒定(2號(hào)內(nèi)含子)，導(dǎo)致可以產(chǎn)生不同的pml-rarα融合基因異構(gòu)體l型融合基因、s型融合基因和v型融合基因，其中以l型和s型融合基因?yàn)橹?。為了檢測(cè)pml-rarα融合基因，同時(shí)區(qū)分兩種主要的融合類型，分別設(shè)計(jì)了2組擴(kuò)增引物：針對(duì)pml基因l型斷裂熱點(diǎn)上游基因序列的第一組擴(kuò)增引物和針對(duì)rarα全基因序列的第二組擴(kuò)增引物。所述擴(kuò)增引物組的擴(kuò)增區(qū)域分別為pml和rarα基因目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域中非重復(fù)且高度保守的片段，片段長(zhǎng)度大于1000bp，擴(kuò)增引物相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100-500bp之間，分別構(gòu)成了第一組和第二組探針庫。擴(kuò)增引物序列信息及其相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物見表1(注：1f/1r為一對(duì)引物，分別表示正向引物和反向引物；其他以此類推)。表1擴(kuò)增引物及擴(kuò)增產(chǎn)物引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，合成后的每條序列分別用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的貯存液，并做好標(biāo)記。2、探針庫構(gòu)建利用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)，以人類基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別構(gòu)成了第一組和第二組探針庫。(1)人基因組dna提?。焊鶕?jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-第三版》(科學(xué)出版社)或按照市售人基因組dna提取試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。(2)配置pcr引物工作液：針對(duì)第一組探針庫，將相應(yīng)的擴(kuò)增引物(1f/1r-15f/15r)分為3個(gè)擴(kuò)增引物組，對(duì)pml基因l型斷裂熱點(diǎn)上游基因的3個(gè)非重復(fù)且高度保守區(qū)域進(jìn)展擴(kuò)增：分別取相應(yīng)的擴(kuò)增引物(1f/1r-5f/5r、6f/6r-10f/10r、11f/11r-15f/15r)儲(chǔ)存液50ul置于3支1.5ml離心管中，使用10mmol/ltrisbuffer配制成終濃度各為10pmol/ml的3支擴(kuò)增引物工作液，相應(yīng)做好標(biāo)記；針對(duì)第二組探針庫，將相應(yīng)的擴(kuò)增引物(16f/16r-30f/30r)分為3個(gè)擴(kuò)增引物組，對(duì)rarα全基因的3個(gè)非重復(fù)且高度保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增：分別取相應(yīng)的擴(kuò)增引物(16f/16r-20f/20r、21f/21r-25f/25r、26f/26r-30f/30r)儲(chǔ)存液50ul置于3支1.5ml離心管中，使用10mmol/ltrisbuffer配制成終濃度各為10pmol/ml的3支擴(kuò)增引物工作液，相應(yīng)做好標(biāo)記。(3)配置pcr擴(kuò)增體系：分別進(jìn)行上述6個(gè)體系的擴(kuò)增，擴(kuò)增體系試劑組成如下：試劑每反應(yīng)(μl)10×緩沖液(含mg2+)510×dntpmix(含biotin-dutp)5taqdna聚合酶2pcr引物工作液10dna(10ng/μl)1滅菌雙蒸水27總體積50(4)pcr擴(kuò)增：配置好體系后輕輕混合均勻，瞬時(shí)離心5-10s，按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，從第二步開始30個(gè)循環(huán)，72℃5min，4℃保持。(5)產(chǎn)物鑒定和純化：將針對(duì)pml基因l型斷裂熱點(diǎn)上游之間基因的3個(gè)非重復(fù)且高度保守區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物混合均勻，得到第一組探針庫；將針對(duì)rarα全基因3個(gè)非重復(fù)且高度保守區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物混合均勻，得到第二組探針庫。通過2％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)兩組探針庫進(jìn)行鑒定，切割大小在100-500bp之間的產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，即得到第一組和第二組探針庫，相應(yīng)做好標(biāo)記。3、染料標(biāo)記探針本實(shí)施例優(yōu)選cy3(紅色熒光)標(biāo)記第一組探針，優(yōu)選alexafluor488(綠色熒光)標(biāo)記第二組探針。人工合成cy3標(biāo)記和alexafluor488標(biāo)記的polya序列，所述polya序列包含1-30個(gè)堿基，優(yōu)選的是包含10-20個(gè)堿基，更優(yōu)選的是包含2-8個(gè)堿基，polya序列末端修飾有鏈霉親和素。將cy3標(biāo)記和alexafluor488標(biāo)記的polya序列分別與修飾有生物素的第一組和第二組探針庫混合(每100ug探針庫加入20ul熒光標(biāo)記的polya序列)，于37℃緩慢搖動(dòng)孵育30min，得到相應(yīng)熒光標(biāo)記的探針。探針經(jīng)純化和沉淀，溶解在te緩沖液中，即獲得紅色標(biāo)記的第一組探針和綠色標(biāo)記的第二組探針，將探針于-20℃避光保存。二、試劑盒其他組分1、ssc緩沖貯存液(20×ssc，ph5.3)：氯化鈉88g、檸檬酸鈉44g、超純水400ml，充分溶解混勻，室溫下將溶液ph值調(diào)至5.3，用超純水將溶液定容至500ml，0.45μm濾器過濾。2、乙醇溶液(70％和85％)：無水乙醇700ml/850ml、超純水300ml/150ml，充分混勻。3、洗滌緩沖液ⅰ：20×ssc(ph5.3)35ml、乙基苯基聚乙二醇(np-40)3ml、超純水912ml，充分混勻，室溫下將溶液ph值調(diào)至7.0，用超純水將溶液定容至1000ml，0.45μm濾器過濾。4、洗滌緩沖液ⅱ：20×ssc(ph5.3)100ml、乙基苯基聚乙二醇(np-40)1ml、超純水849ml，充分混勻，室溫下將溶液ph值調(diào)至7.0，用超純水將溶液定容至1000ml，0.45μm濾器過濾。實(shí)施例2利用實(shí)施例1試劑盒對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)一、樣本預(yù)處理1、用肝素鈉抗凝管采集患者外周血1-1.5ml，2000rpm離心5min；2、棄上清，加入5-10ml0.075m的kcl溶液，吹打均勻，37℃低滲處理30min；3、加入1ml新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均勻，靜置5min；4、2000rpm離心5min，棄上清；5、加入10ml新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均勻，靜置10min；6、2000rpm離心5min，棄上清；7、加入10ml新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均勻，2000rpm離心5min，棄上清；8、重復(fù)步驟7兩次，最后加10ul新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)重懸細(xì)胞；9、將制備好的細(xì)胞懸液滴加到玻片上。二、fish檢測(cè)fish檢測(cè)主要包括預(yù)變性、變性、雜交和復(fù)染四個(gè)步驟，從雜交開始的操作步驟均需要在避光條件下進(jìn)行：1、準(zhǔn)備工作：探針平衡至室溫，渦旋混勻后置于微量離心機(jī)中離心2-3s；開啟并預(yù)熱雜交儀，將濕條浸入蒸餾水中備用(至少浸泡2h)，雜交時(shí)放入雜交儀；使用玻璃刀在切片反面圈出樣本雜交區(qū)域。2、預(yù)變性：將玻片在室溫2×ssc液中浸泡2min，隨后將玻片依次置于70％、85％、100％乙醇中脫水各2min。置于烤片機(jī)上2-5min烘干。3、雜交(避光操作)：在玻片樣本雜交區(qū)域加入10ul探針溶液(探針濃度15ng/ul，每一標(biāo)準(zhǔn)人份探針量，對(duì)應(yīng)檢測(cè)的樣本面積約為20mm×20mm，樣本區(qū)域較大的樣本可根據(jù)實(shí)際情況增加用量)，蓋上蓋玻片，確保蓋玻片下無氣泡、探針均勻分布。使用封片膠覆蓋蓋玻片四周位置，形成閉合的密封圈。將切片放入已安裝好濕條的雜交儀中，設(shè)置雜交反應(yīng)程序：85℃變性8min，42℃雜交4h。4、雜交后洗滌(避光操作)：開啟水浴鍋(76±1℃)，將洗滌緩沖液ⅱ置于水浴鍋預(yù)熱。將雜交后的切片從雜交儀中取出，去除封片膠，置于室溫的洗滌緩沖液ⅰ中5min，洗掉蓋玻片，再置于76±1℃的洗滌緩沖液ⅱ中5min，期間可輕輕晃動(dòng)切片1-3s；重復(fù)上述洗滌步驟1次，最后用洗滌沖液ⅰ再重復(fù)洗滌一次，每種洗滌緩沖液重復(fù)洗滌時(shí)的時(shí)間與第一次用該緩沖液洗滌時(shí)時(shí)間相同。洗滌后將切片直立風(fēng)干。5、dapi復(fù)染(避光操作)：在樣本雜交區(qū)域加入10μl復(fù)染液，蓋上蓋玻片，室溫避光5-10min后即可顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。dapi復(fù)染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存時(shí)間不超過72h)，需要檢測(cè)時(shí)將玻片放至室溫后進(jìn)行觀察。三、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)本發(fā)明試劑盒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：1、每例樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，若陽性細(xì)胞數(shù)小于3個(gè)(3/100或＜3％)，該樣本判定為陰性。2、每例樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，若陽性細(xì)胞數(shù)大于5個(gè)(5/100或＞5％)，該樣本判定為陽性。3、每例樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，若陽性細(xì)胞數(shù)介于3-5個(gè)(3-5％)，需另一閱片人另外計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。匯總兩位閱片人計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)與陽性細(xì)胞數(shù)，即總計(jì)200個(gè)細(xì)胞中，若陽性細(xì)胞總數(shù)小于8個(gè)(＜4％)，該樣本判定為陰性，若陽性細(xì)胞總數(shù)大于等于8個(gè)(≥4％)，該樣本判定為陽性。細(xì)胞的陽性與陰性判定：上下移動(dòng)顯微鏡視野，查找所有存在于細(xì)胞核內(nèi)的信號(hào)。1、以下信號(hào)模式可判定為pml-rarα融合基因陽性細(xì)胞(詳見圖1)：(1)s型融合細(xì)胞：間期核中出現(xiàn)的是1個(gè)紅色、1綠色和2個(gè)紅綠雜交信號(hào)(1r1g2f)；(2)l型融合細(xì)胞：間期核中出現(xiàn)的是1個(gè)紅色、2個(gè)綠色和1個(gè)紅綠雜交信號(hào)(1r2g1f)。2、以下信號(hào)模式可判定為pml-rarα融合基因陰性細(xì)胞(詳見圖2)：間期核中出現(xiàn)的是2個(gè)紅色和2個(gè)綠色隨機(jī)分散的4個(gè)雜交信號(hào)(2r2g)。注：附圖中黑色代表紅色的，白色代表綠色點(diǎn)。四、檢測(cè)結(jié)果分析利用實(shí)施例1試劑盒對(duì)15例急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血樣本(編號(hào)1-15)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)選用nb4細(xì)胞株作為陽性對(duì)照、k562細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購(gòu)買得到。分別各取約2000個(gè)nb4和k562細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本各均分為5份，編號(hào)16-20和21-25。具體檢測(cè)結(jié)果如表3：表3樣本檢測(cè)結(jié)果由上述檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒對(duì)pml-rarα融合基因的檢測(cè)具有很好的靈敏度和特異性，能實(shí)現(xiàn)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血樣本的檢測(cè)和斷裂位點(diǎn)分型，同時(shí)所有的nb4細(xì)胞均為pml-rarα融合基因陽性，而所有的k562細(xì)胞均為pml-rarα融合基因陰性。說明本試劑盒設(shè)計(jì)的探針能特異性地與目標(biāo)基因序列發(fā)生雜交反應(yīng)，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)并且穩(wěn)定，保證了檢測(cè)結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。實(shí)施例3雜交時(shí)長(zhǎng)對(duì)試劑盒檢測(cè)效果的影響一、雜交時(shí)長(zhǎng)本發(fā)明試劑盒探針長(zhǎng)度和染料標(biāo)記方法的設(shè)計(jì)是發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和統(tǒng)計(jì)分析后得出的最優(yōu)方案，能達(dá)到檢測(cè)特異性和雜交時(shí)長(zhǎng)之間的最優(yōu)平衡，既能保證結(jié)果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時(shí)間，提高檢測(cè)效率。為驗(yàn)證雜交時(shí)長(zhǎng)對(duì)本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的影響，本實(shí)施例設(shè)置了不同雜交時(shí)長(zhǎng)的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，具體見表4，所用檢測(cè)探針和試劑與實(shí)施例1試劑盒一致。表4雜交時(shí)長(zhǎng)分組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3實(shí)驗(yàn)組4雜交時(shí)間2h4h8h16h二、樣本檢測(cè)采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過程和方法對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血樣本26-40進(jìn)行檢測(cè)，其中各實(shí)驗(yàn)組雜交時(shí)間與表4雜交時(shí)間一致，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：表5雜交時(shí)長(zhǎng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響對(duì)比4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒設(shè)計(jì)的探針在4h內(nèi)即可與樣本目標(biāo)基因充分雜交，實(shí)現(xiàn)樣本的檢測(cè)并保證結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。2h的雜交時(shí)長(zhǎng)由于探針不能與樣本充分雜交，而導(dǎo)致一些陽性細(xì)胞漏檢，造成假陰性結(jié)果，且檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定；而8h和16h的雜交時(shí)長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果與4h完全一致，且熒光信號(hào)強(qiáng)度基本一致。說明本發(fā)明探針長(zhǎng)度和染料標(biāo)記方式能顯著減短探針與目標(biāo)基因的雜交時(shí)間，提高檢測(cè)效果，同時(shí)保證檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。實(shí)施例4探針長(zhǎng)度對(duì)試劑盒檢測(cè)效果的影響一、探針長(zhǎng)度本發(fā)明試劑盒探針長(zhǎng)度和染料標(biāo)記方法的設(shè)計(jì)是發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和統(tǒng)計(jì)分析后得出的最優(yōu)方案，能達(dá)到檢測(cè)特異性和雜交時(shí)長(zhǎng)之間的最優(yōu)平衡，既能保證結(jié)果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時(shí)間，提高檢測(cè)效率。為驗(yàn)證探針長(zhǎng)度對(duì)本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的影響，本實(shí)施例設(shè)置了不同探針長(zhǎng)度的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，具體見表6，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增區(qū)域位置相同。所用檢測(cè)探針制備方法和試劑與實(shí)施例1試劑盒一致。表6探針長(zhǎng)度分組實(shí)驗(yàn)組5實(shí)驗(yàn)組6實(shí)驗(yàn)組7實(shí)驗(yàn)組8探針長(zhǎng)度20-100bp100-500bp500-1000bp＞1000bp二、樣本檢測(cè)采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過程和方法對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血樣本41-55進(jìn)行檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：表7探針長(zhǎng)度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響對(duì)比4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組6使用100-500bp的探針，在4h內(nèi)即可與樣本目標(biāo)基因充分雜交，實(shí)現(xiàn)樣本的檢測(cè)并保證結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。探針長(zhǎng)度過短(實(shí)驗(yàn)組5)，會(huì)降低檢測(cè)特異性，造成較高的背景噪音，同時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)很弱，造成結(jié)果的誤判；探針長(zhǎng)度過長(zhǎng)(實(shí)驗(yàn)組7和8)會(huì)降低細(xì)胞對(duì)探針的攝取能力，同時(shí)延長(zhǎng)雜交所需要的時(shí)間，導(dǎo)致在4h探針不能與目標(biāo)基因充分雜交，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。實(shí)施例5構(gòu)建探針庫引物對(duì)種類和數(shù)量對(duì)試劑盒檢測(cè)效果的影響一、引物對(duì)的選擇本發(fā)明試劑盒針對(duì)pml-rarα融合基因的檢測(cè)和分型設(shè)計(jì)了二組探針庫，每組探針庫分別由15對(duì)引物擴(kuò)增得到，擴(kuò)增區(qū)域分別為pml和rarα基因目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域中非重復(fù)且高度保守的片段，本發(fā)明針對(duì)pml和rarα基因分別優(yōu)選了基因中非重復(fù)且高度保守的3個(gè)擴(kuò)增區(qū)域，針對(duì)每個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性基因。為檢測(cè)構(gòu)建探針庫所使用的引物對(duì)種類和數(shù)量對(duì)本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的影響，本實(shí)施例以第一組探針的構(gòu)建為例，設(shè)置了3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，具體見表8，所用檢測(cè)探針制備方法和試劑與實(shí)施例1試劑盒一致，第二組探針使用全部的擴(kuò)增引物進(jìn)行建庫。表8引物對(duì)的選擇二、樣本檢測(cè)采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過程和方法對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血樣本56-70進(jìn)行檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：表9構(gòu)建探針庫引物對(duì)種類和數(shù)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響比較上述3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)結(jié)果可知，當(dāng)目標(biāo)基因每個(gè)擴(kuò)增區(qū)域選用1對(duì)、2對(duì)和5對(duì)擴(kuò)增引物，即第一組探針庫使用3對(duì)、6對(duì)和15對(duì)引物進(jìn)行探針庫構(gòu)建時(shí)，均可完成檢測(cè)。當(dāng)使用6對(duì)或以上引物對(duì)進(jìn)行建庫時(shí)，其特異性和穩(wěn)定性都很好。其中，當(dāng)使用全部15條的建庫引物對(duì)時(shí)，信號(hào)更強(qiáng)更穩(wěn)定，檢測(cè)效果最佳。其他針對(duì)第一組和第二組探針庫建庫引物對(duì)種類和數(shù)量的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果上述一致，具體數(shù)據(jù)省略。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12