一種孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于孤獨(dú)癥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
孤獨(dú)癥，也稱為孤獨(dú)癥譜系障礙(AutismSpectrumDisorders，ASD)，是一種以社會(huì)功能缺失、言語(yǔ)和非言語(yǔ)溝通異常，以及行為和興趣刻板局限為主要特征的廣泛神經(jīng)發(fā)育障礙，患病率約1％。一般發(fā)病于3歲前的幼兒期，并持續(xù)終生，男孩發(fā)病率是女孩的4～6倍。研究表明，ASD的早期診斷和篩查有助于增加孤獨(dú)癥兒童從早期干預(yù)中獲益的機(jī)會(huì)。然而由于缺乏生物標(biāo)志物，目前對(duì)ASD的篩查診斷主要以兒童的行為特征及發(fā)育史為基礎(chǔ)，因此存在爭(zhēng)議，亟需篩選可量化生物學(xué)診斷指標(biāo)。ASD發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。該病的診斷最初起源于對(duì)一組病人臨床癥狀的觀察，從有孤獨(dú)癥診斷至今，由于缺乏可量化的指標(biāo)，診斷標(biāo)準(zhǔn)修改過(guò)多次。孤獨(dú)癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容均為癥狀描述，并且其癥狀存在多樣性，學(xué)界對(duì)其以癥狀表述為主的診斷標(biāo)準(zhǔn)存在爭(zhēng)議。因此，篩查ASD可量化的生物學(xué)指標(biāo)、生物標(biāo)志物的鑒定、不僅有利于其早期篩查及診斷，對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的探討、診斷標(biāo)準(zhǔn)的制定及治療藥物的研制亦具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A及其應(yīng)用，該血清多肽標(biāo)志物分子為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個(gè)片段，是孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A為絲氨酸蛋白酶抑制劑A5SERPINA5的一個(gè)片段，分子量為3886道爾頓。所述孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A，其血清中的檢測(cè)參數(shù)為2.81～5.11ng/mL。本發(fā)明還公開(kāi)了孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A作為孤獨(dú)癥血清診斷藥物的靶點(diǎn)的應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A在制備孤獨(dú)癥血清診斷藥物中的應(yīng)用。所述孤獨(dú)癥血清診斷藥物為ELISA檢測(cè)孤獨(dú)癥血清多肽分子的藥物。與上述孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物SERPINA5-A相結(jié)合的分子在制備孤獨(dú)癥血清診斷藥物中的應(yīng)用。SERPINA5蛋白作為孤獨(dú)癥血清診斷藥物的靶點(diǎn)的應(yīng)用。與SERPINA5蛋白相結(jié)合的分子在制備孤獨(dú)癥血清診斷藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：本發(fā)明公開(kāi)了一種孤獨(dú)癥患兒的血清標(biāo)志物及其檢測(cè)方法。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該分子稱為SERPINA5-A,為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個(gè)片段。其精確分子量為3886道爾頓，在孤獨(dú)癥患兒血清中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)：而在正常對(duì)照人群中血清中表達(dá)范圍為：2.08～3.28ng/mL；在孤獨(dú)癥患兒血清中表達(dá)范圍為：2.81～5.11ng/mL，且組間具有極顯著差異(p<0.001)。鑒于SERPINA5-A在孤獨(dú)癥血清中顯著高表達(dá)，那么SERPINA5-A就可以作為孤獨(dú)癥血清診斷標(biāo)志物；且其母本蛋白SERPINA5在孤獨(dú)癥患兒血清中呈現(xiàn)特異性的高表達(dá)，因此，SERPINA5可應(yīng)用于孤獨(dú)癥患兒血清診斷：用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)SERPINA5-A或ELISA方法測(cè)檢測(cè)SERPINA5的表達(dá)水平，可作為孤獨(dú)癥患兒檢測(cè)的方法。而針對(duì)ELISA檢測(cè)孤獨(dú)癥血清診斷，SERPINA5就可以作為ELISA檢測(cè)藥物的新的靶點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為同一孤獨(dú)癥患兒血清樣本的三次重復(fù)的蛋白多肽圖譜(1KDa～10KDa)；圖2為蛋白多肽峰m/z:3886在孤獨(dú)癥患兒和正常對(duì)照組中的蛋白多肽表達(dá)差異；圖3為SERPINA5-A的MS/MS質(zhì)譜鑒定圖譜；圖4為孤獨(dú)癥兒童及正常對(duì)照兒童血清中SERPINA5蛋白的表達(dá)水平。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供的孤獨(dú)癥血清多肽分子，是一種新篩選的孤獨(dú)癥血清診斷標(biāo)志物，其表達(dá)具有特異性，可應(yīng)用于孤獨(dú)癥診斷。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。具體的該孤獨(dú)癥血清診斷標(biāo)志物的篩選為：首先應(yīng)用液體蛋白芯片技術(shù)分離提取孤獨(dú)癥患兒和正常對(duì)照兒童血清蛋白多肽，應(yīng)用MALDI-TOF-MS捕獲孤獨(dú)癥患兒和正常對(duì)照人群蛋白多肽圖譜，并且采用ClinProTools2.1軟件對(duì)比分析孤獨(dú)癥患兒和正常人群血清蛋白多肽譜圖差異，找出組間顯著差異表達(dá)的蛋白多肽分值，在孤獨(dú)癥患兒血清中顯著高表達(dá)的蛋白多肽峰值中篩出孤獨(dú)癥血清腫瘤標(biāo)志物。對(duì)于所篩選的孤獨(dú)癥血清診斷標(biāo)志物的驗(yàn)證為：應(yīng)用HPLC將孤獨(dú)癥患兒血清分離的蛋白多肽混合物分為20～30個(gè)組分，在對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的鑒定，并且對(duì)鑒定出的蛋白多肽采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行血清回歸分析，結(jié)果血清回歸驗(yàn)證證明其在孤獨(dú)癥患兒血清中顯著高表達(dá)，具有特異性，可以作為孤獨(dú)癥患兒血清篩查的生物標(biāo)志物。1、樣本的采集與處理：采集自西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(2013年1月至2015年12月)的150例(男性130例；女性20例；平均年齡3.5歲)臨床確診的孤獨(dú)癥患兒和150例正常健康對(duì)照兒童(男性130例；女性20例；平均年齡3.5歲)。樣本考慮年齡、性別、采集時(shí)間、儲(chǔ)存條件是否一致、有無(wú)基礎(chǔ)疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黃帽、有隔離膠)采集全血5mL，室溫靜置30min；室溫離心5min(3000g)，將上層血清分裝成100μL/管，立即保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。1.2試劑與儀器血清蛋白的提取采用德國(guó)布魯克公司的磁珠試劑盒“弱陽(yáng)離子型”(MB-WCX)，以及光譜純(HPLC級(jí))乙腈、三氟乙酸(德國(guó)Merck公司)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(美國(guó)Sigma公司)。磁珠分離器、600/384AnchorChip靶板和AutoFlexIII基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS(德國(guó)BrukerDaltonics公司)。2、血清蛋白樣本的制備運(yùn)用弱陽(yáng)離子(MB-WCX)磁珠捕獲血清蛋白多肽，具體操作步驟如下：①用混勻器完全混勻磁珠懸浮液1min；②加10μLMB-WCX結(jié)合液以及10μLMB-WCX磁珠至PCR管，混勻后加5μL血清，混勻至少5次，靜置5min；③將PCR管放入磁柱分離器，使磁珠貼壁1min，液體清澈后棄上清液；④加100μLMB-WCX沖洗液，在磁柱分離器上前后移動(dòng)10次PCR管，磁珠貼壁后棄上清液，重復(fù)步驟③、④兩次；⑤加5μLMB-WCX洗脫液洗滌貼壁的磁珠，并反復(fù)吹打10次，磁珠貼壁2min，將上清液移入干凈的離心管；⑥加5μLMB-WCX穩(wěn)定液至離心管并混勻，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS檢測(cè)或者凍存于-20℃冰箱24h之內(nèi)質(zhì)譜分析。2.2質(zhì)譜分析將分離收集得到的蛋白樣本1μL與10μL的基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸混勻，取1μL點(diǎn)在Anchorchip靶板上(德國(guó)Bruker公司)，每個(gè)樣本分別點(diǎn)三個(gè)靶點(diǎn)以作三次重復(fù)。待室溫干燥后將靶板放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，采用FlexControl2.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品校正后開(kāi)始樣本檢測(cè)，每個(gè)樣本要經(jīng)過(guò)總共300次激光打靶(5次點(diǎn)靶，每次打靶2×30次)之后生成質(zhì)譜圖，獲得由不同質(zhì)核比(m/z)組成的蛋白多肽譜圖。采用ClinProTools2.1軟件結(jié)合遺傳算法等生物統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)方法分析兩組血清樣本的蛋白多肽圖譜。進(jìn)行歸一化平滑處理總離子流圖，消除化學(xué)及電物理噪聲；分析組間差異蛋白并計(jì)算差異大小，按差異大小由大到小排列，找出組間表達(dá)具有顯著差異的蛋白多肽峰值(P<0.001)。將孤獨(dú)癥患兒組和正常對(duì)照組血清樣本采用磁珠分離系統(tǒng)處理后，經(jīng)過(guò)MALDI-TOF-MS分析后，對(duì)孤獨(dú)癥患兒組和正常對(duì)照組的每個(gè)樣本進(jìn)行蛋白多肽圖譜繪制，在分子量范圍1000Da～10000Da共檢測(cè)到81個(gè)蛋白多肽峰圖，且每個(gè)樣本的三次重復(fù)穩(wěn)定性較高，如圖1所示。采用ClinProTools2.1軟件對(duì)質(zhì)譜捕獲的孤獨(dú)癥患兒和正常對(duì)照組的血清蛋白多肽圖譜進(jìn)行分析，將孤獨(dú)癥患兒血清多肽譜圖與正常人群進(jìn)行比較分析，檢測(cè)到分子量為3886道爾頓的蛋白多肽峰在孤獨(dú)癥患兒血清中顯著高表達(dá)(孤獨(dú)癥兒童vs健康對(duì)照兒童：4.44±1.07vs2.53±0.59，p<0.001)。結(jié)果如圖2所示，對(duì)M/Z:3886在孤獨(dú)癥患兒(紅色，峰值在上的曲線)和正常對(duì)照(綠色，峰值在下的曲線)中的表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)M/Z:3886的蛋白多肽峰圖在孤獨(dú)癥患兒血清中均顯著高表達(dá)，因此對(duì)其進(jìn)行序列鑒定并作為標(biāo)志物的首選進(jìn)一步鑒定。3、孤獨(dú)癥血清潛在標(biāo)志物的序列鑒定具體采用液相色譜分離與質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)對(duì)孤獨(dú)癥血清多肽標(biāo)志物M/Z:3886進(jìn)行鑒定，采用Waters公司NanoAcquityUPLC對(duì)經(jīng)磁珠分離收集的質(zhì)譜上樣剩余的血清蛋白多肽進(jìn)行二維凝膠色譜分離，收集15～30份肽段餾份：在收集液中檢測(cè)到目的蛋白；再聯(lián)用ThermoFisher公司LTQOrbitrapXL質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)孤獨(dú)癥患兒血清中表達(dá)上調(diào)的蛋白多肽M/Z:3886進(jìn)行序列鑒定。具體的操作步驟為：3.1樣本前處理合并提取后的蛋白樣，1300轉(zhuǎn)，10分鐘，取上清液，冷凍干燥儀干燥，使終體積在50ul，得到液體A，用安捷倫ziptip萃取柱，濃縮處理液體A。處理方法：①ziptip柱子用100％乙腈吹打5次，活化柱子；②活化好的ziptip在液體1中，反復(fù)吹吸10次，盡量避免氣泡產(chǎn)生；③50％ACN0.1％TFA水溶液，洗滌3次ziptip柱子；④、ziptip柱子在0.1％TFA中反復(fù)吹吸，使樣本洗脫，得到洗脫液2；⑤重復(fù)以上1-4步，30次；⑥合并30次的洗脫液2，冷凍干燥至10ul，用于質(zhì)譜鑒定。3.2色譜分離：原始樣品加10ul流動(dòng)相A，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，共20ul。一維超高效液相系統(tǒng)：Waters公司NanoAquityUPLC(WatersCorporation,Milford,USA)。色譜柱：捕集柱：C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquityTMColumn分析柱：C18,3.5μm,75μm×150mm,nanoAcquityTMColumn流動(dòng)相A：5％乙腈，0.1％甲酸的水溶液流動(dòng)相B:95％乙腈，0.1％甲酸的水溶液；所有溶液均為HPLC級(jí)。捕集流速15μl/min，捕集時(shí)間3min，分析流速400nl/min；分析時(shí)間60min，色譜柱溫度35℃；PartialLoop模式進(jìn)樣，進(jìn)樣體積18μl。梯度洗脫程序：時(shí)間流速流動(dòng)相A％流動(dòng)相B％40.00.40095.05.041.00.40055.045.045.00.40020.080.045.500.40095.05.060.000.40095.05.0凝膠色譜分離結(jié)果如圖3所示。色譜圖中橫坐標(biāo)表示樣本流出時(shí)間，縱坐標(biāo)代表多肽相對(duì)豐度，色譜設(shè)定時(shí)間為60min，從10min開(kāi)始收集收集餾分，多肽成分主要在15min后被分離并采用梯度洗脫方式，使洗脫效率提高，設(shè)定捕集時(shí)間收集餾分：收集15～30份肽段餾份。3.3LTQ-OrbitrapXL質(zhì)譜分析：使用ThermoFisher公司LTQObitrapXL質(zhì)譜分析系統(tǒng)。Nano離子源(MichromBioresources,Auburn,USA)，噴霧電壓1.8kV；質(zhì)譜掃描時(shí)間60min；實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綖閿?shù)據(jù)依賴(DataDependent)及動(dòng)態(tài)排除(DynamicExclusion),在10秒內(nèi)對(duì)母離子進(jìn)行2次串級(jí)之后加入到排除列表內(nèi)90秒；掃描范圍400-2000m/z；一級(jí)掃描(MS)使用Obitrap，分辨率設(shè)定為100000；CID及二級(jí)掃描使用LTQ；在MS譜圖中選取強(qiáng)度最強(qiáng)的10個(gè)離子的單一同位素作為母離子進(jìn)行MS/MS(單電荷排除，不作為母離子)。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。數(shù)據(jù)分析：使用數(shù)據(jù)分析軟件BioworksBrowser3.3.1SP1進(jìn)行SequestTM檢索。母離子誤差設(shè)定為100ppm，碎片離子誤差設(shè)為1Da，酶切方式為非酶切,可變修飾為M(Methionine)甲硫氨酸氧化。檢索結(jié)果參數(shù)設(shè)定為deltacn>＝0.10。檢索結(jié)果為：m/z:3886.84；IPI:IPI00007221.1；GeneSymbol＝SERPINA5Plasmaserineproteaseinhibitorprecursor；序列為SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP。所分離的M/Z:3886稱為SERPINA5-A，為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個(gè)片段,其精確分子量為3886道爾頓，其氨基酸序列SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP(如SEQ.ID.NO.1所示)。因此，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)SERPINA5-A或ELISA方法測(cè)檢測(cè)SERPINA5的表達(dá)水平，可作為孤獨(dú)癥患兒檢測(cè)的方法。SERPINA5-A作為SERPINA5的一個(gè)片段，提示SERPINA5是與孤獨(dú)癥特異性相關(guān)的蛋白，進(jìn)一步通過(guò)ELISA檢測(cè)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。4、孤獨(dú)癥血清SERPINA5表達(dá)的ELISA血清驗(yàn)證分析：1)血清樣本：收集孤獨(dú)癥患兒血清48例(男性40例，女性8例；平均年齡3.5歲)、正常對(duì)照兒童血清40例(男性35例；女性5例；平均年齡3.5歲)進(jìn)行ELISA的血清驗(yàn)證分析。所有血清樣本均來(lái)自西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，采集時(shí)間2014年1月～2015年12月。2)檢測(cè)方法：采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)孤獨(dú)癥患兒以及正常對(duì)照組的血清SERPINA5的表達(dá)水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：往預(yù)先包被抗人的SERPINA5蛋白(SERPINA5)抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的SERPINA5蛋白呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)界定。3)統(tǒng)計(jì)方法：采用GraphPad.Prism.v5.01軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)以及獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)。4)結(jié)果分析：酶聯(lián)免疫法分析結(jié)果表明SERPINA5在孤獨(dú)癥及正常對(duì)照檢測(cè)組中的表達(dá)水平為孤獨(dú)癥vs正常對(duì)照組:3.83±0.47(2.81～5.11)vs2.42±0.26(2.08～3.28),p<0.001，組間具有顯著性差異，具體結(jié)果如圖4所示。對(duì)正常對(duì)照人群以及孤獨(dú)癥患兒血清中的SERPINA5進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明孤獨(dú)癥患兒血清中SERPINA5顯著高表達(dá)(孤獨(dú)癥vs正常對(duì)照組:3.83±0.47vs2.42±0.26)：在正常對(duì)照兒童血清中表達(dá)范圍為：2.08～3.28ng/mL；在孤獨(dú)癥患兒血清中表達(dá)范圍為：2.81～5.11ng/mL，且組間具有極顯著差異(p<0.001)。這表明：SERPINA5是與孤獨(dú)癥發(fā)生密切相關(guān)的蛋白，可作為初步的孤獨(dú)癥檢測(cè)指標(biāo)。因此可以通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)待檢血清樣本的SERPINA5表達(dá)初步判定其是否還有孤獨(dú)癥：孤獨(dú)癥患兒(2.81～5.11ng/mL)；正常人群(2.08～3.28ng/mL)。綜上所述，本發(fā)明公開(kāi)了一種新的孤獨(dú)癥血清多肽分子及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該分子稱為SERPINA5-A，是絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個(gè)片段，其精確分子量為3886道爾頓SERPINA5-A在孤獨(dú)癥患兒血清檢測(cè)中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)SERPINA5-A或ELISA方法測(cè)檢測(cè)SERPINA5的表達(dá)水平，可作為孤獨(dú)癥血清的檢測(cè)方法。