本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及生物活性物質(zhì)，更具體地，本發(fā)明涉及干細(xì)胞生物活性組合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞(Stem Cell)是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞，它是機(jī)體的起源細(xì)胞，是形成人體各種組織器官的“萬(wàn)能細(xì)胞”。根據(jù)其發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞。其中成體干細(xì)胞(Adult stem cell，ASC)分布廣、增殖能力強(qiáng)、具有多向分化潛能且無(wú)倫理或宗教問(wèn)題，可來(lái)源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉、角膜等各類(lèi)組織，包括間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC)、造血干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、胃腸干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞等。

近年來(lái)，隨著對(duì)干細(xì)胞研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其在增殖分化過(guò)程中產(chǎn)生或分泌了大量的生物活性物質(zhì)，這是一種包含了生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、活性多肽、微量元素等多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、活化與再生的物質(zhì)，如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、白介素－6(IL-6)、白介素－7(IL-7)、天然免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD等。

然而，目前制備干細(xì)胞生物活性物質(zhì)的技術(shù)以及制備獲得的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前實(shí)際中應(yīng)用的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)大多存在以下不足：1.直接從胎盤(pán)等組織中提取，致使所得到的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)純度低；2.采用含有動(dòng)物源成分(如胎牛血清)的培養(yǎng)液進(jìn)行干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，提取的物質(zhì)中不可避免的含有動(dòng)物來(lái)源的成分甚至含有存在于動(dòng)物體內(nèi)的病毒等，安全性低；3.干細(xì)胞內(nèi)含有豐富的生物活性物質(zhì)，對(duì)干細(xì)胞的增殖分化等非常重要，但這些物質(zhì)并不分泌到細(xì)胞外，故常在提取過(guò)程中被遺漏；4.多采用單一的胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而收集上清，未考慮到體內(nèi)細(xì)胞復(fù)雜的生長(zhǎng)環(huán)境與不同種類(lèi)細(xì)胞之間的相互作用，導(dǎo)致提取的生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量不高。本發(fā)明旨在至少 在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出一種具有高純度、高產(chǎn)量、高生物活性的干細(xì)胞生物活性組合物，所述干細(xì)胞生物活性組合物含有1.69-22.24pg/mL EGF、2443.17-4459.43pg/mL bFGF、1.44-134.36pg/mL beta-NGF、1.55-355.14pg/mL VEGF、11.87-159.70pg/mL PDGF-DD、135.79-688.13pg/mL KGF、1176.99-3825.79pg/mL TGF-β1，上述干細(xì)胞生物活性組合物具有較高的生物活性，并且所述干細(xì)胞生物活性組合物中各個(gè)生物活性因子具有較高含量。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述干細(xì)胞生物活性組合物含有18.47pg/mL EGF、4447.00pg/mL bFGF、32.66pg/mL beta-NGF、27.77pg/mL VEGF、77.04pg/mL PDGF-DD、688.13pg/mL KGF、3312.99pg/mL TGF-β1。所述干細(xì)胞生物活性組合物具有較高的生物活性，并且所述干細(xì)胞生物活性組合物中各個(gè)生物活性因子具有較高含量。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述干細(xì)胞生物活性組合物是通過(guò)將間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)獲得的。相關(guān)研究表明，干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)在不同程度上需要依賴(lài)另外一些細(xì)胞對(duì)它們的滋養(yǎng)、支持作用?；|(zhì)細(xì)胞是一類(lèi)能夠?qū)Ω杉?xì)胞起滋養(yǎng)作用的滋養(yǎng)細(xì)胞，多種基質(zhì)細(xì)胞系已經(jīng)被用來(lái)支持干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。它們的存在可以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，而且它們可以分泌多種已知的、未知的生長(zhǎng)因子來(lái)支持干細(xì)胞的生長(zhǎng)。脂肪組織提供了多能基質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織位于可以較易獲得的結(jié)締組織中，其中存在著抽脂術(shù)細(xì)胞，其克隆細(xì)胞株被稱(chēng)為脂肪基質(zhì)細(xì)胞(Adipose tissue-derived stromal cell，ADSC)，這些細(xì)胞體內(nèi)分布廣、取材創(chuàng)傷小、細(xì)胞獲得量大(每克脂肪組織存在高達(dá)8.6×10⁴個(gè)基質(zhì)細(xì)胞)，可補(bǔ)充、增殖穩(wěn)定、具有美容效果等，是合適的基質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)然，具有與脂肪基質(zhì)細(xì)胞相似特點(diǎn)的細(xì)胞還可來(lái)自于其它組織，這些組織包括但不限于骨、骨髓、軟骨、結(jié)締組織、韌帶組織或腱、骨骼肌、平滑肌、皮膚、外周血、臍帶血、胎盤(pán)。雖然這些基質(zhì)細(xì)胞并不相同，但它們所擁有的共性使它們可在體外行使相似的功能，尤其是可作為飼養(yǎng)層支持胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的增殖并維持在未分化狀態(tài)。進(jìn)一步地，非接觸式共培養(yǎng)在同一體系中實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，避免了直接接觸式共培養(yǎng)中所存在的干細(xì)胞分離純化困難、免疫安全性差、容易引起病毒傳播等問(wèn)題，解決了不同細(xì)胞的分離問(wèn)題，便于培養(yǎng)結(jié)束后獲得高純度的干細(xì)胞；此外當(dāng)培養(yǎng)模型中細(xì)胞間相互作用需要通過(guò)建立細(xì)胞間緊密連接和/或需要采用旁分泌的作用方式時(shí)，非接觸式共培養(yǎng)不會(huì)引起干細(xì)胞的變化。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明提出一種制備所述干細(xì)胞活性組合物的方法，包括以下步驟：(1)利用培養(yǎng)基，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)；(2)收集含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液；以及(3)將所述含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中的間充質(zhì) 干細(xì)胞進(jìn)行裂解后進(jìn)行離心，并收集上清液，所述上清液構(gòu)成所述干細(xì)胞活性組合物。利用該方法制備獲得具有高純度、高產(chǎn)量、高生物活性的干細(xì)胞生物活性組合物。需要說(shuō)明的是，所述含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中包含有間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述非接觸式共培養(yǎng)采用非接觸培養(yǎng)裝置，所述非接觸培養(yǎng)裝置包括：培養(yǎng)皿，所述培養(yǎng)皿中限定出下室，所述脂肪基質(zhì)細(xì)胞接種于所述下室；Transwell，所述Transwell中限定出上室，所述Transwell具有PET膜，所述PET膜使所述上室和所述下室呈流體連通，所述間充質(zhì)干細(xì)胞接種于所述上室。本發(fā)明所述方法采用Transwell培養(yǎng)板建立非接觸式的干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)結(jié)束后便于干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的分離，以便獲得高純度的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述方法步驟(3)中進(jìn)一步包括：(3-1)將所述含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液放入-20℃冷凍后，放入5℃中進(jìn)行解凍，以便獲得凍融后的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液；(3-2)在振幅50％的情況下，對(duì)所述凍融后的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行超聲0-90min，收集并混合超聲后的液體，以便獲得超聲后的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液；(3-3)將所述超聲后的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液在10000rpm下離心30min后，于0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并收集上清液，所述上清液構(gòu)成所述干細(xì)胞活性組合物。本發(fā)明所述方法采用超聲破碎、低溫凍融與高速離心等方法提取、分離、純化細(xì)胞培養(yǎng)上清及干細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，從而獲得高純度、高產(chǎn)量和高活性的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述方法步驟(3-2)在振幅50％的情況下，對(duì)所述凍融后的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行超聲50min，收集并混合超聲后的液體，以便獲得超聲后的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液。由此，利用本發(fā)明所述方法，可以獲得高純度、高產(chǎn)量和高活性的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)。

由此可知，本發(fā)明中由所述方法制備獲得的細(xì)胞生物活性組合物具有以下優(yōu)勢(shì)：1.克服了現(xiàn)有技術(shù)直接從臍帶或胎盤(pán)等組織中提取的生物活性物質(zhì)純度、產(chǎn)量與活性不高的缺點(diǎn)。本發(fā)明采用Transwell培養(yǎng)板建立干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外非接觸共培養(yǎng)體系，采用超聲破碎、低溫凍融與高速離心等方法提取、分離、純化細(xì)胞培養(yǎng)上清及干細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，從而獲得高純度、高產(chǎn)量和高活性的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)；2.克服了現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用含動(dòng)物源成分培養(yǎng)基的不足，本發(fā)明中的共培養(yǎng)體系均采用無(wú)血清培養(yǎng)基，未使用任何含動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基，避免了動(dòng)物源成分造成的安全隱患；3.克服了現(xiàn)有技術(shù)中未提取干細(xì)胞自身產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的缺陷，本發(fā)明通過(guò)超聲破碎等方法，在提取干細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)的同時(shí)，也提取了干細(xì)胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)；4.克服了現(xiàn)有技術(shù)中多采用單一的胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)從而提取的生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量不高的缺陷，本發(fā)明采用干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)作用促進(jìn)干細(xì)胞 的生長(zhǎng)及未分化狀態(tài)的維持，且進(jìn)一步模擬了體內(nèi)組織細(xì)胞和干細(xì)胞之間的相互作用，所得生物活性物質(zhì)產(chǎn)量較高；5.克服了現(xiàn)有共培養(yǎng)技術(shù)中干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)的不足，本發(fā)明采用Transwell培養(yǎng)板建立非接觸式的干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)結(jié)束后便于干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的分離，以便獲得高純度的干細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)。

本發(fā)明中的干細(xì)胞生物活性組合物可有效調(diào)控機(jī)體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、活化人體干細(xì)胞，進(jìn)而修復(fù)或替代機(jī)體損傷、病變及衰老的細(xì)胞。因此，本發(fā)明中的干細(xì)胞生物活性組合物在美容產(chǎn)品、保健品、組織工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種化妝品，包含上述干細(xì)胞生物活性組合物或利用上述方法制備獲得的干細(xì)胞生物活性組合物，所述化妝品具有抗衰老，增強(qiáng)皮膚彈性的功能，對(duì)損傷的皮膚能自動(dòng)地進(jìn)行護(hù)理、調(diào)養(yǎng)與修復(fù)，使皮膚變得更柔嫩、更富有彈性。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種保健品，包含上述干細(xì)胞生物活性組合物或利用上述方法制備獲得的干細(xì)胞生物活性組合物，所述保健品具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)損傷或衰老組織再生以及改善組織器官功能的作用。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出一種促進(jìn)干細(xì)胞/祖細(xì)胞增殖和/或分化功能的方法，在存在上述干細(xì)胞生物活性組合物或上述方法制備獲得的干細(xì)胞生物活性組合物的條件下，培養(yǎng)所述干細(xì)胞/祖細(xì)胞，利用該方法能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化的功能。

附圖說(shuō)明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)裝置的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1、脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離純化

患者知情并同意后，經(jīng)吸脂術(shù)獲取脂肪組織?；颊吣挲g在37-54歲之間，身體質(zhì)量指數(shù)(kg/m²)在28-35之間，除肥胖外，身體健康狀況良好，無(wú)糖尿病或其它并發(fā)癥。吸脂后，將脂肪組織置于生理鹽水中于術(shù)后2h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，2倍體積的Krebs-Ringer Bicarbonate 緩沖液洗滌3-4次去除血污，再用1倍體積的Ⅰ型膠原酶(1g/L of KRB，1％BSA)在間歇攪拌下37℃消化60min。消化完成后，300g離心5min以去除漂浮的脂肪細(xì)胞。將得到的基質(zhì)細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞的初始密度為3.5×10³個(gè)/cm²，培養(yǎng)4-5天后細(xì)胞約長(zhǎng)到80％。用0.5mM EDTA/0.05％胰蛋白酶消化細(xì)胞，1200rpm離心5min，再將細(xì)胞用Dulbecco’s modified Eagle’s–Ham’s F-10medium(V/V＝1:1)(含10％胎牛血清，15mM HEPES(pH 7.4)，100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素，0.25mg/mL兩性霉素B)重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)/cm²，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待長(zhǎng)到80％時(shí)按上述方法傳代，得到第2代脂肪基質(zhì)細(xì)胞。

實(shí)施例2、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化

取足月順產(chǎn)或剖腹產(chǎn)的胎盤(pán)組織，剝除母體側(cè)蛻膜，剪取小塊胎兒蛻膜側(cè)胎盤(pán)組織，PBS沖洗，去除血跡。將胎盤(pán)組織剪成碎片，加入0.1％Ⅳ型膠原酶，37℃消化30min，過(guò)100目篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，加入配好的培養(yǎng)基(含DMEM，10％FBS，5ng/mL bFGF，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，25mmol/L谷氨酰胺)，調(diào)整培養(yǎng)細(xì)胞密度為1×10⁵個(gè)/mL，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3-4d進(jìn)行換液，胎兒蛻膜側(cè)胎盤(pán)組織消化后獲得細(xì)胞中僅有少量的貼壁細(xì)胞，經(jīng)2周后逐漸形成扁平單層細(xì)胞，細(xì)胞按常規(guī)方法傳代、凍存、復(fù)蘇。最多傳代至第5代，收集5代以?xún)?nèi)的細(xì)胞。此時(shí)收集的干細(xì)胞生物學(xué)性狀穩(wěn)定，增殖能力強(qiáng)。

實(shí)施例3、脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

采用具有PET膜的Transwell懸掛式培養(yǎng)小室結(jié)合6孔板進(jìn)行脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的非接觸式共培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.05％/0.25％胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度后接種，培養(yǎng)基采用MSC無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組將脂肪基質(zhì)細(xì)胞接種于Transwell培養(yǎng)小室的下室，然后將Transwell懸掛式培養(yǎng)小室的上室置于孔中，在Transwell懸掛式培養(yǎng)小室內(nèi)接種MSC，讓上下室的培養(yǎng)液相互通融，從而建立起脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的共培養(yǎng)體系；對(duì)照組則將MSC單獨(dú)接種于Transwell小室內(nèi)，下層為基礎(chǔ)培養(yǎng)液。將共培養(yǎng)體系在37℃，5％CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)施例4、脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系生物活性物質(zhì)的提取

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)48h后的按實(shí)施例3處理的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的細(xì)胞培養(yǎng)體系。1200rpm離心5min，取細(xì)胞培養(yǎng)上清與MSC，混合均勻，放入－20℃冰箱中過(guò)夜，第二天拿出放入5℃冰箱中至完全溶解，如此反復(fù)凍融3次。凍融結(jié)束后用超聲破碎儀在振幅 50％的情況下分別超聲0、10、20、30、40、50、60、90min，再分別將超聲后的液體在10000rpm下離心30min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，獲得不同超聲時(shí)間的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)混合液。

實(shí)施例5、脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系生物活性因子的含量測(cè)定

取實(shí)施例4獲得的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)混合液，分別用R&D的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒(ELISA)測(cè)定干細(xì)胞生物活性物質(zhì)混合液中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(beta-NGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子-DD(PDGF-DD)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的含量。方法參照試劑盒說(shuō)明。如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)含量的測(cè)定：取已包被抗人bFGF的96孔酶標(biāo)板，往每孔中加入100μL測(cè)試稀釋液，再分別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或空白對(duì)照，充分混勻，室溫孵育2h，常規(guī)洗板，每孔加入200μL人bFGF特異性的已連接酶的單克隆抗體，室溫孵育2h，洗板后加入200μL酶底物室溫反應(yīng)30min，加入50μL終止液終止反應(yīng)，在450nm處測(cè)吸光度，并用540nm處的吸光度扣背景。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子含量。結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系中EGF含量為1.69-22.24pg/mL、bFGF含量為2443.17-4459.43pg/mL、beta-NGF含量為1.44-134.36pg/mL、VEGF含量為1.55-355.14pg/mL、PDGF-DD含量為11.87-159.70pg/mL、KGF含量為135.79-688.13pg/mL、TGF-β1含量為1176.99-3825.79pg/mL；對(duì)照組中EGF含量為1.50-17.98pg/mL、bFGF含量為1334.43-3079.65pg/mL、beta-NGF含量為1.14-95.41pg/mL、VEGF含量為1.45-235.43pg/mL、PDGF-DD含量為10.99-100.47pg/mL、KGF含量為120.12-503.23pg/mL、TGF-β1含量為787.69-2585.47pg/mL。由結(jié)果可知，脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的分泌量均在一定程度上高于間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞因子分泌量，說(shuō)明通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)作用可促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)與生物活性因子的分泌。

實(shí)施例6、脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系生物活性物質(zhì)的提取

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)48h后的按實(shí)施例3處理的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的細(xì)胞培養(yǎng)體系。1200rpm離心5min，取細(xì)胞培養(yǎng)上清與MSC，混合均勻，放入－20℃冰箱中過(guò)夜，第二天拿出放入5℃冰箱中至完全溶解，如此反復(fù)凍融3次。凍融結(jié)束后用超聲破碎儀在振幅50％的情況下超聲50min，再將超聲后的液體在10000rpm下離心30min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，得干細(xì)胞生物活性物質(zhì)混合液。

實(shí)施例7、脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系生物活性因子的含量測(cè)定

取實(shí)施例6獲得的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的干細(xì)胞生物活性物質(zhì)混合液，分別用R&D的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒(ELISA)測(cè)定干細(xì)胞生物活性物質(zhì)混合液中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(beta-NGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子-DD(PDGF-DD)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的含量。方法參照試劑盒說(shuō)明。如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)含量的測(cè)定：取已包被抗人bFGF的96孔酶標(biāo)板，往每孔中加入100μL測(cè)試稀釋液，再分別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或空白對(duì)照，充分混勻，室溫孵育2h，常規(guī)洗板，每孔加入200μL人bFGF特異性的已連接酶的單克隆抗體，室溫孵育2h，洗板后加入200μL酶底物室溫反應(yīng)30min，加入50μL終止液終止反應(yīng)，在450nm處測(cè)吸光度，并用540nm處的吸光度扣背景。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子含量。結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系中EGF含量為18.47pg/mL、bFGF含量為4447.00pg/mL、beta-NGF含量為32.66pg/mL、VEGF含量為27.77pg/mL、PDGF-DD含量為77.04pg/mL、KGF含量為688.13pg/mL、TGF-β1含量為3312.99pg/mL；

對(duì)照組中EGF含量為12.13pg/mL、bFGF含量為2870.75pg/mL、beta-NGF含量為20.33pg/mL、VEGF含量為26.89pg/mL、PDGF-DD含量為58.90pg/mL、KGF含量為495.78pg/mL、TGF-β1含量為1997.53pg/mL。由結(jié)果可知，脂肪基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的分泌量均在一定程度上高于間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞因子分泌量，說(shuō)明通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)作用可促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)與生物活性因子的分泌。

實(shí)施例8、干細(xì)胞生物活性物質(zhì)生物活性測(cè)定

將人干細(xì)胞生物活性物質(zhì)按120μg/孔/天加入小鼠骨髓細(xì)胞中37℃培養(yǎng)，第2天計(jì)細(xì)胞數(shù)，并鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，與對(duì)照組相比給干細(xì)胞生物活性物質(zhì)組能夠促進(jìn)細(xì)胞的貼壁并刺激小鼠骨髓細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例9、干細(xì)胞生物活性物質(zhì)在美容產(chǎn)品中的應(yīng)用

將干細(xì)胞生物活性物質(zhì)以10-100μg/ml的比例加入到化妝品的配方中，均質(zhì)處理后制成化妝品。含有干細(xì)胞生物活性物質(zhì)的化妝品具有抗衰老，增強(qiáng)皮膚彈性的功能，對(duì)損傷的皮膚能自動(dòng)地進(jìn)行護(hù)理、調(diào)養(yǎng)與修復(fù)，使皮膚變得更柔嫩、更富有彈性。

如將細(xì)胞因子加入含有聚乙烯醇、甘油、咪唑烷基脲、乙醇、月桂醇聚氧乙烯醚、水等成分的面膜液中，混勻，制備成面膜，長(zhǎng)期面部應(yīng)用可以起到皮膚美白、修復(fù)、抗衰老的作用。

實(shí)施例10、干細(xì)胞生物活性物質(zhì)在保健品中的應(yīng)用

將干細(xì)胞生物活性物質(zhì)按1:1000-1:8000比例加入特定食品中制成保健品。含有二者的保健品具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)損傷或衰老組織再生以及改善組織器官功能的作用。

實(shí)施例11、干細(xì)胞生物活性物質(zhì)在組織工程中的應(yīng)用

將干細(xì)胞生物活性物質(zhì)以10-200μg/ml的比例加入體外干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化的功能。

取培養(yǎng)至5代的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)，以5×10³個(gè)/孔種入96孔板，分為兩組，一組加入100μLα-MEM培養(yǎng)基，另一組加入100μL含有10μg干細(xì)胞生物活性物質(zhì)的α-MEM培養(yǎng)基，CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。每孔加入10μL CCK-8試劑，CO₂培養(yǎng)箱中37℃孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處的吸光度(OD)值。結(jié)果表明加入干細(xì)胞生物活性物質(zhì)組的細(xì)胞增殖率是未加干細(xì)胞生物活性物質(zhì)組的123.07％±2.13％。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書(shū)中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。