一種通過(guò)表面展示實(shí)現(xiàn)人源精氨酸酶-1固定化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及的是人源精氨酸酶-UHuman Arginasel)的固定化技術(shù)，特別是通過(guò) 優(yōu)化的冰核形成蛋白展示來(lái)實(shí)現(xiàn)固定化的方法，是人源精氨酸酶I固定化的一種新思想、新 途徑、新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人源精氨酸酶-IW=聚體的形式存在于人肝臟細(xì)胞之中，參與尿素代謝循環(huán)，催 化水解kArg化-精氨酸)生成k^na-烏氨酸）和尿素。精氨酸酶I缺陷，會(huì)導(dǎo)致發(fā)育遲緩， 智力缺陷，癒痛和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等一系列相關(guān)疾病，人源精氨酸酶-1還可W用于做為藥物治療 癌癥。
[0003] 由于大部分精氨酸酶難W實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效可溶性表達(dá)，從肝臟中提取 精氨酸酶作為精氨酸酶主要的來(lái)源，但存在著可能攜帶各種病毒的風(fēng)險(xiǎn)。人源精氨酸酶-1 在己斯德畢赤酵母能夠?qū)崿F(xiàn)有效的分泌表達(dá)，純化的人源精氨酸酶-1，經(jīng)過(guò)幾下質(zhì)包埋固 定W后，實(shí)現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)化kArg合成，然而，此固定化方法，制備時(shí)間較長(zhǎng)，制備過(guò)程復(fù) 雜，在操作過(guò)程中，存在損失部分酶活等缺點(diǎn)。
[0004] 大腸桿菌表面展示技術(shù)，作為一種全新的固定技術(shù)，有廣泛的應(yīng)用前景，諸如，將 谷氨酸脫簇酶展示在大腸桿菌表面，重組大腸桿菌細(xì)胞可作為"固定化細(xì)胞工廠"來(lái)轉(zhuǎn)化谷 氨酸生產(chǎn)藥物中間體丫 -氨基下酸;將臘水解酶展示在大腸桿菌細(xì)胞表面，重組大腸桿菌細(xì) 胞可作為"固定化細(xì)胞分子篩"拆分手性化合物鄰-6-扁桃酸;將有機(jī)憐水解酶展示大腸桿 菌表面，重組大腸桿菌細(xì)胞作為"固定化生物吸附劑"降解環(huán)境存在的有害有機(jī)憐試劑；
[0005] 簡(jiǎn)述現(xiàn)有技術(shù)冰核形成蛋白展示系統(tǒng)。冰核形成蛋白來(lái)源于假單胞菌，作為錯(cuò)定 蛋白，可W通過(guò)憐脂酷基醇(GPI)錯(cuò)定在大腸桿菌細(xì)胞外膜，利用運(yùn)一特征，人們已開(kāi)發(fā)為 一類(lèi)在大腸桿菌表面展示異源蛋白的展示系統(tǒng)。冰核形成蛋白由=部分組成，氨基端功能 域，高度重復(fù)區(qū)域和簇基端功能域。據(jù)報(bào)道，全長(zhǎng)的冰核形成蛋白，氨基酸端剪切突變體，簇 基端剪切突變體和去掉重復(fù)序列的剪切突變體都可W介導(dǎo)異源蛋白在大腸桿菌表面展示。 然而，現(xiàn)在的冰核形成蛋白展示系統(tǒng)，不能有效的實(shí)現(xiàn)多聚體蛋白的表面展示及其固定化。 通過(guò)不斷地努力和改進(jìn)，人們期待研究出高效的，廣泛實(shí)用的冰核形成蛋白展示系統(tǒng)，來(lái)滿 足各種科研和生產(chǎn)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提出了一種通過(guò)表面展示實(shí)現(xiàn)人源精氨酸酶-1固定化的方法，提供了一種 全新的，有效的人源精氨酸酶-1固定化的方法。
[0007] 設(shè)計(jì)在冰核形成蛋白剪切變體（InaK-N)的氨基端分別融合信號(hào)膚（Sec信號(hào)膚和 Tat信號(hào)膚)和帶電荷多膚(6 XLys，6 XGlu和6 XAsp)，在簇基端融合人源精氨酸酶-1，并在 其簇基端設(shè)計(jì)HA標(biāo)簽，便于檢測(cè)展示效率；
[000引 1)首先，設(shè)計(jì)PCR引物分別攜帶編碼信號(hào)膚Sec、化t，帶電荷多膚6XLys、6XGlu、6 XAsp和標(biāo)簽蛋白HA的序列（信號(hào)膚和帶電荷多膚及其氨基酸序列見(jiàn)表1和附圖1、附圖2)， 通過(guò)PC時(shí)尋其分別融合在冰核形成蛋白剪切變體（InaK-N)的氨基端，和人源精氨酸酶-1的 簇基端，然后將兩類(lèi)基因片段通過(guò)PCR融合在一起，構(gòu)建出含有各種含有冰核形成蛋白和精 氨酸酶重組表達(dá)質(zhì)粒；
[0009] 所述引物名稱(chēng)及引物序列見(jiàn)表2
[0010] 表1信號(hào)膚和帶電荷多膚及其氨基酸序列
[0011]

[
[
[0014]

[001引 a引物方向?yàn)?'-3'
[0016] 2)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta Blue感受態(tài)細(xì)胞，37°C靜 置培養(yǎng)過(guò)夜，獲得基因工程菌株；
[0017] 3)將基因工程菌株，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/mL，37 °C震蕩培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為lmM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后， 12000RPM，4°C，10分鐘離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷憐酸緩沖液清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基， 重懸于IOmL的預(yù)冷憐酸緩沖液中備用；
[001引4)分別取200iiL重懸的菌液，細(xì)胞經(jīng)巧光抗體標(biāo)記后，用流氏細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM)分析不同的信號(hào)膚和帶電荷多膚展示人源精氨酸酶-1的效率；
[0019] 5)用化inard反應(yīng)檢測(cè)含量，進(jìn)而分析不同的信號(hào)膚和帶電荷多膚展示人源 精氨酸酶-1的基因工程菌催化轉(zhuǎn)AkArg合成酶活。整個(gè)反應(yīng)體系為ImL,組成如下： 100化底物kArg，濃度為0.2M，800化碳酸氨鹽緩沖液(50mM，pH= 10)和100化步驟3)中重懸 備用的菌液。操作步驟如下:首先，將反應(yīng)緩沖液在40°C預(yù)熱5分鐘，然后;在40°C水浴，震蕩 反應(yīng)10分鐘，120003?1，41：，10111111離屯、收集反應(yīng)后的上清，將上清在100°(：加熱5分鐘終止 反應(yīng)。最后，上清中的kOrn用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活；
[0020] 6)經(jīng)過(guò)測(cè)量后，選出轉(zhuǎn)化kArg合成的酶活最高的基因工程菌株，大規(guī)模培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)化kA巧生成具體操作如下:首先，將步驟5)中酶活最高的工程菌株，重新接種 新鮮于IL LB培養(yǎng)基，氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/mL，37°C震蕩培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之 間，加入IPTG，終濃度為ImM, 37 °C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后，12000RPM，4°C，IOmin離屯、收集菌 體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，重懸于50mL的預(yù)冷碳酸氨鹽緩沖液，加入 底物kA巧終濃度為200g/L，40°C水浴中震蕩反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物之一用LC-MS質(zhì)譜 鑒定，確認(rèn)為心化11反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)計(jì)算其中kOrn含量達(dá)到130g/L，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到95 %。
[0021] 本發(fā)明展示人源精氨酸酶-1，包括原始的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1展示系 統(tǒng)，信號(hào)膚和帶電荷多膚優(yōu)化的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1展示系統(tǒng)。
[0022] 本發(fā)明具有的優(yōu)勢(shì)。
[0023] 本發(fā)明通過(guò)冰核形成蛋白剪切變體融合人源精氨酸酶-1在大腸桿菌細(xì)胞表面有 效展示，從而實(shí)現(xiàn)了人源精氨酸酶-1固定化。與原始的冰核形成蛋白展示系統(tǒng)相比，明顯提 高人源精氨酸酶-1展示效率和酶活，與現(xiàn)有幾下質(zhì)固定化法相比，降低合成成本，縮短工藝 流程，簡(jiǎn)化純化步驟。
[0024] 比原始的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1的展示效率提高近3倍，人源精氨酸酶-1 的酶活提高近3倍。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1、圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。如圖所示，InaK-N為冰核形成蛋白氨基酸端剪切 突變體的英文縮寫(xiě);ARGl為人源精氨酸酶-1的英文縮寫(xiě);HA為標(biāo)簽蛋白的英文縮寫(xiě)；SSMa化 為Sec途徑其中一種信號(hào)膚英文縮寫(xiě)；SSTorA為化t途徑其中一種信號(hào)膚英文縮寫(xiě);D6為六 個(gè)天冬氨酸的英文縮寫(xiě);E6為六個(gè)谷氨酸的英文縮寫(xiě);K6為六個(gè)賴(lài)氨酸的英文縮寫(xiě)。設(shè)計(jì)方 案如下，分別在冰核形成蛋白氨基端剪切變體的氨基端加上信號(hào)膚，分別是Sec途徑的信號(hào) 膚和化t途徑的信號(hào)膚;帶電荷氨基酸，六個(gè)天冬氨酸，六個(gè)谷氨酸和六個(gè)賴(lài)氨酸。在簇基端 分別加上人源精氨酸酶-1和標(biāo)簽蛋白HA。
[0026] 圖3為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率。如圖所示，其中圖A為陰 性對(duì)照結(jié)果；圖B為InaK-N/ARGl為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的結(jié) 果；圖C為ssMa化-InaK-N/ARGl為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-I的展示效率的結(jié)果； 圖D為ssTorA-InaK-N/ARGl為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的結(jié)果；圖E 為D6-InaK-N/ARGl為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的結(jié)果；圖F為E6-InaK-N/ARGl為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的結(jié)果；圖G為k6-InaK-N/ ARGl為流氏細(xì)胞術(shù)分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的結(jié)果。
[0027]圖4為化inarD反應(yīng)監(jiān)測(cè)展示人源精氨酸酶-1的酶活。如圖所示，pET23a為空載陰 性對(duì)照結(jié)果；InaK-N/ARGl，ssMa化-InaK-N/ARGl，ssTorA-InaK-N/ARGl，D6-InaK-N/ARGl， E6-InaK-N/ARGl和K6-InaK-N/ARGl分別為展示人源精氨酸酶-I的酶活監(jiān)測(cè)結(jié)果。
[00巧]圖5為L(zhǎng)C-MS監(jiān)測(cè)展示人源精氨酸酶-1轉(zhuǎn)化レArg合成圖標(biāo)準(zhǔn)品 LC-MS監(jiān)測(cè)結(jié)果；圖B為L(zhǎng)-Orn標(biāo)準(zhǔn)品LC-MS監(jiān)測(cè)結(jié)果；圖C為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)C-MS監(jiān)測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面W實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明：
[0030] 實(shí)施例1:
[0031] 利用本發(fā)明方法在大腸桿菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，將構(gòu)建好的含有InaK-N/ARG1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑 取單菌落，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，抗生素氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/mL，37°C震蕩培養(yǎng)， OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為lmM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后，12000RPM，4°C離 屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，最終重懸于IOmL預(yù)冷PBS緩沖液 備用。然后用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活。（圖3,圖4)
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 利用本發(fā)明方法在大腸桿菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，將構(gòu)建好的含有 SSMa化-InaK-N/ARGl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37°C靜置培養(yǎng) 過(guò)夜。然后，挑取單菌落，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，抗生素氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/mL， 37 °C震蕩培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為ImM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后， 12000RPM，4°C離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，最終重懸于IOmL 預(yù)冷PBS緩沖液備用。然后用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活。 (圖3,圖4)
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 利用本發(fā)明方法在大腸桿菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，將構(gòu)建好的含有 ssTorA-InaK-N/ARGl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37°C靜置培養(yǎng) 過(guò)夜。然后，挑取單菌落，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，抗生素氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/mL， 37 °C震蕩培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為ImM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后， 12000RPM，4°C離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，最終重懸于IOmL 預(yù)冷PBS緩沖液備用。然后用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活。 (圖3,圖4)
[0036] 實(shí)施例4
[0037] 利用本發(fā)明方法在大腸桿菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，將構(gòu)建好的含有Ds-InaK-N/ARGl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。然 后，挑取單菌落，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，抗生素氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/血，37 °C震蕩 培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為ImM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后，12000RPM， 4°C離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，最終重懸于IOmL預(yù)冷PBS緩 沖液備用。然后用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活。（圖3,圖4) [00 3引實(shí)施例5
[0039] 利用本發(fā)明方法在大腸桿菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，將構(gòu)建好的含有Es-InaK-N/ARGl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。然 后，挑取單菌落，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，抗生素氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/血，37 °C震蕩 培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為ImM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后，12000RPM， 4°C離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，最終重懸于IOmL預(yù)冷PBS緩 沖液備用。然后用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活。（圖3,圖4)
[0040] 實(shí)施例6
[0041] 利用本發(fā)明方法在大腸桿菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，將構(gòu)建好的含有Ks-InaK-N/ARGl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。然 后，挑取單菌落，接種于IOOmL LB培養(yǎng)基，抗生素氨節(jié)青霉素的終濃度為50iig/血，37 °C震蕩 培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為ImM，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后，12000RPM， 4°C離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，最終重懸于IOmL預(yù)冷PBS緩 沖液備用。然后用化inard反應(yīng)測(cè)量，并轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的人源精氨酸酶-1酶活。（圖3,圖4)
[0042] 實(shí)施例7
[0043] 利用優(yōu)化的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1展示系統(tǒng)轉(zhuǎn)化kArg合成首先， 將構(gòu)建好的含有Ks-InaK-N/ARGl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta Blue菌株，37 °C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。然后，重新接種新鮮菌種于IL LB培養(yǎng)基，氨節(jié)青霉素的終濃度為50yg/ mL，37 °C震蕩培養(yǎng)，OD值為0.5~0.6之間，加入IPTG，終濃度為ImM，37 °C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然 后，12000RPM，4°C，IOmin離屯、收集菌體，菌體用預(yù)冷PBS清洗2次，去掉殘留的培養(yǎng)基，重懸 于50mL的預(yù)冷碳酸氨鹽緩沖液，加入底物L(fēng)-Arg終濃度為200g/L，40°C水浴中震蕩反應(yīng)16小 時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用LC-MS質(zhì)譜鑒定。（圖5)
[0044] 各種實(shí)例結(jié)果分析
[0045] 經(jīng)過(guò)流氏細(xì)胞術(shù)分析，TorA信號(hào)膚，6XG1U和6XLys可W提高冰核形成蛋白展示 人源精氨酸酶-1的展示效率，分別是原始的冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶-1的1~2倍左 右，其中6 XLys取得了最高的展示效率。Ma化信號(hào)膚和6 XAsp降低了冰核形成蛋白展示人 源精氨酸酶-1的展示效率。用化inard反應(yīng)分析酶活，可W得到相同的結(jié)果，TorA信號(hào)膚，6 XGlu和6XLys可W提高冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶-1的酶活，分別是原始的冰核形 成蛋白展示人源精氨酸酶-1的酶活的1~2倍左右，其中6 XLys酶活最高為1 1U/OD6〇〇dLC-MS 質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，本研究提出的固定化方法，可W有效的轉(zhuǎn)化底物心4巧合成反應(yīng) 16小時(shí)，可W將200g/L的底物L(fēng)-A巧完全轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-Orn。
[0046] 本發(fā)明大腸桿菌菌株Rosetta Blue購(gòu)于美國(guó)Novagen公司，不同的重組質(zhì)粒均為 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，分析用各種試劑為分析純，LC-MS用的標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過(guò)表面展示實(shí)現(xiàn)人源精氨酸酶-1固定化的方法，其特征在于： 1) 首先，設(shè)計(jì)?01?引物分別攜帶編碼信號(hào)肽36〇3&1，帶電荷多肽6/1^8、6/6111、6乂 Asp和標(biāo)簽蛋白HA的序列，通過(guò)PCR將其分別融合在冰核形成蛋白剪切變體(InaK-N)的氨基 端，和人源精氨酸酶-1的羧基端，然后將兩類(lèi)基因片段通過(guò)PCR融合在一起，構(gòu)建出含有各 種含有冰核形成蛋白和精氨酸酶重組表達(dá)質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta Blue感受態(tài)細(xì)胞，37°C靜置培 養(yǎng)過(guò)夜，獲得基因工程菌株； 3) 將基因工程菌株，接種于LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，此菌株經(jīng)熒光抗體標(biāo)記后，用流氏細(xì) 胞術(shù)分析不同的信號(hào)肽和帶電荷多肽對(duì)冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶-1的效率的影響； 用Chinard反應(yīng)檢測(cè)L-〇rnithine含量，進(jìn)而分析不同的信號(hào)肽和帶電荷多肽對(duì)冰核形 成蛋白展示人源精氨酸酶-1催化轉(zhuǎn)化L-Arg合成L-〇rn酶活的影響； 4) 經(jīng)過(guò)測(cè)量后，選出轉(zhuǎn)化L-Arg合成L-〇rn的酶活最高的基因工程菌株，大規(guī)模培養(yǎng)，菌 體經(jīng)收集，洗滌去掉殘存的培養(yǎng)基成分，重懸于碳酸氫鹽緩沖液，以L-Arg作為底物，轉(zhuǎn)化合 成L_0rn〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出了一種通過(guò)表面展示實(shí)現(xiàn)人源精氨酸酶?1固定化的方法。步驟為：設(shè)計(jì)在冰核形成蛋白剪切變體(InaK?N)的氨基端加入信號(hào)肽和帶電荷多肽，在羧基端融合人源精氨酸酶?1，在羧基端設(shè)計(jì)HA標(biāo)簽；構(gòu)建各種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得不同基因工程菌株；將不同菌株搖瓶培養(yǎng)；檢測(cè)人源精氨酸酶?1展示效率和酶活；挑取酶活最高的菌株大量培養(yǎng)，高效轉(zhuǎn)化L?精氨酸，合成L?鳥(niǎo)氨酸。本發(fā)明通過(guò)冰核形成蛋白剪切變體融合人源精氨酸酶?1在大腸桿菌細(xì)胞表面有效展示，從而實(shí)現(xiàn)了人源精氨酸酶?1固定化。與原始的冰核形成蛋白展示系統(tǒng)相比，明顯提高人源精氨酸酶?1展示效率和酶活，與幾丁質(zhì)固定化法相比，降低成本，縮短流程，簡(jiǎn)化純化步驟。
【IPC分類(lèi)】C12N15/70, C12N9/78
【公開(kāi)號(hào)】CN105713888
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610097606
【發(fā)明人】張貞, 易犁, 馬立新
【申請(qǐng)人】湖北大學(xué)