本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及疫苗和免疫領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及從牛膝中提取的粗多糖、多糖組分以及均一多糖。本發(fā)明還涉及含有它們的藥物組合物、其制備方法、以及其用于疫苗佐劑、免疫調(diào)節(jié)劑或制備疫苗輔料、疫苗制劑、疫苗組合物或抗體的用途。
背景技術(shù)：
：牛膝(achranthisbidentata和cyathulaofficinalis)是莧科植物牛膝的干燥根，具有活血、通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功用。牛膝含有多種次生代謝產(chǎn)物，如齊墩果酸及其皂苷、蒽醌類化合物等，還含有較高含量的多糖[李金亭,等.牛膝類藥材的生物學(xué)與化學(xué)成分的研究進(jìn)展.中草藥，2006，37(6):952-956]。近年來與本發(fā)明領(lǐng)域相關(guān)的研究和報(bào)道歸納如下：(1)牛膝多糖制備方法及化學(xué)成分的研究許海丹等將牛膝粉末用80％乙醇加熱回流，殘?jiān)铀逯筇崛?合并濾液、濃縮。濃縮液中加入乙醇至含醇量達(dá)到80％。靜置12h后分離沉淀，再水溶解，采用sevage方法去除蛋白。收集清液，再加入4倍乙醇醇析，沉淀部分用乙醚、丙酮反復(fù)洗滌，干燥，制備牛膝粗多糖。(許海丹，等.牛膝多糖的提取與含量測定.科學(xué)技術(shù)與工程，2009，9(1)：107-109.)劉傳敏等首先將纖維素酶和牛膝粉末一起加水在恒溫?fù)u床上保持一段時(shí)間，然后沸水浴煎煮10min，再超聲20min，離心，上清合并、濃縮，然后加乙醇至含醇量為80％。靜置、離心，沉淀加蒸餾水溶解， 三氯乙酸脫蛋白，上清液揮干溶劑，即得牛膝多糖粗品(劉傳敏，等.酶解超聲法提取川牛膝多糖的正交試驗(yàn)研究.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，5：51-53)。魏濤等采用以下工藝制備牛膝粗多糖：懷牛膝→70℃干燥→粉碎過40目篩→石油醚脫脂，體積分?jǐn)?shù)80％乙醇回流→超聲波輔助水浸提→離心取上清液→sevage法除蛋白→濃縮→乙醇沉淀→過濾洗滌→低溫干燥→懷牛膝粗多糖(魏濤，等.懷牛膝多糖的超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性活性.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(2)：191-194)。方積年等將牛膝水煎煮、去除游離蛋白、透析、乙醇醇沉、再水溶解后，依次進(jìn)行cellexd和sephadexg-150柱層析，得到一個(gè)肽多糖abab，abab分子量為2.3×104，有d-葡萄糖酸、d-半乳糖、d-半乳糖酸、l-阿拉伯糖和l-鼠李糖組成，摩爾比為12:2:3:1:1。多糖主鏈結(jié)構(gòu)為(1→4)-d-葡萄糖酸和(1→4)-d-半乳糖酸組成。肽含量為24.7％，主要有甘氨酸、谷氨酸、門冬氨酸和絲氨酸組成(方積年，張志花，劉柏年.牛膝多糖的化學(xué)研究.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1990，25(7)：526-529)。劉穎華等采用水提、醇沉法提取川牛膝粗多糖cpc(無具體操作方法)，cpc再經(jīng)685弱堿陰離子交換柱層析分離和bio-gelp2凝膠柱層析純化，得到川牛膝均一多糖rcp。rcp的分子量(mr)主要分布在1000-2200，單糖組成為d-果糖和d-葡萄糖(劉穎華，何開澤，張軍峰，蒙義文.川牛膝多糖的分離、純化及單糖組成.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2003，9(2)：141-145)。陳曉明等將牛膝粗多糖abps(具體制備方不詳)經(jīng)deae-cellulose和sephadexg-50兩次柱色譜純化得到一小分子量的果聚糖。單糖組成分析表明牛膝多糖由果糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8：1，其數(shù)均分子量為1400u，含有4至21糖。糖鏈中含有1,2-連接和2,6-連接的果糖殘基(陳曉明，等.牛膝多糖的理化性質(zhì)研 究及結(jié)構(gòu)確證.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(1):32-35)。chen等牛膝水煎煮3次，水煎液采用sevage方法(正丁醇：氯仿＝4:1)脫色素和蛋白后、透析、醇沉(乙醇終濃度80％)。沉淀部分水溶解、h2o2脫色、透析、再醇沉(乙醇終濃度75％)。沉淀部分水溶解部分進(jìn)行deae-纖維素和sephadexg-50柱層析，獲得牛膝多糖(abp)。該abp有甘露糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8:1(chen,etal.achyranthesbidentatapolysaccharideenhancesimmuneresponseinweanedpiglets.immunopharmimmunotoxicol,2009,31(2):253-260)。(2)牛膝粗多糖免疫活性的研究倪青松等采用水煎、醇沉法制備川牛膝粗多糖(具體操作不詳)，給7日齡仔雞飼喂400mg/kg的川牛膝多糖，在14、21和28日齡采頸靜脈血，分別檢測血清抗體(igg、iga、igm)和血液生化指標(biāo)(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、鈣、白蛋白)。結(jié)果顯示：川牛膝多糖400mg/kg劑量組與對(duì)照組相比，igg、iga和igm差異均顯著(0.01＜p≤0.05)，而白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、鈣的差異均不顯著(倪青松，等.川牛膝多糖對(duì)雞血清抗體和血液生化指標(biāo)的影響.四川畜牧獸醫(yī)，2011，248：27-28)。王宇學(xué)等研究牛膝根多糖abps(本院中藥研究所，純度99.9％，理化性質(zhì)不詳)在體外對(duì)單核細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)單核細(xì)胞hla-dra表面分子的表達(dá)。結(jié)果顯示abps能誘導(dǎo)單核細(xì)胞胞漿溶酶體和胞漿量增多和吞噬能力增強(qiáng)，同時(shí)上調(diào)單核細(xì)胞hla-dra表面分子的表達(dá)(王宇學(xué)，等.牛膝根多糖上調(diào)單核細(xì)胞免疫功能實(shí)驗(yàn).中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25(10)：940-942)。封海波等采用超聲輔助下水提、醇沉法(具體方法不詳)制備川牛膝粗多糖(rcps)，硫酸苯酚法-測定其糖含量為78.9％。rcps和o型口蹄疫滅活疫苗協(xié)同免疫icr小鼠，研究了其對(duì)免疫小鼠體內(nèi)樹突狀細(xì)胞成熟的影響。小鼠在二次免后2周處死，無菌取脾，制 備脾細(xì)胞懸液，測定共刺激信號(hào)分子(cd40，cd80，cd86)的表達(dá)水平，檢測了mhcⅰ、mhcⅱ類分子，cxc型趨化因子受體4(cxcr4)和cc趨化因子受體7(ccr7)mrna表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，在二次免疫后14d，rcps明顯增強(qiáng)了共刺激信號(hào)分子cd40，cd80，cd86的表達(dá)水平，同時(shí)提高了mhc-i，mhc-ii，cxcr4和ccr7mrna表達(dá)水平(封海波，等.川牛膝多糖對(duì)口蹄疫疫苗受免小鼠樹突狀細(xì)胞成熟的影響.中國獸醫(yī)雜志，2014，50(3)：18-21)。邱妍等采用水煎煮、乙醇沉淀方法提取懷牛膝粗多糖，硫酸-蒽酮法測定其多糖含量為54％(理化性質(zhì)不詳)。14d齡蛋在雞新支二聯(lián)弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻免疫的同時(shí)，分別肌肉注射懷牛膝粗多糖3和6mg/ml二個(gè)劑量(每羽注射0.3ml)，每天注射1次，連續(xù)注射3次。分別于免疫后第7、14、21、28、35和42天靜脈采血，測定新城疫血凝抑制(hi)抗體效價(jià)及免疫功能。結(jié)果表明懷牛膝多糖高劑量組的hi抗體效價(jià)、cd4+/cd8+比值和免疫器官指數(shù)都明顯高于對(duì)照組，并且可以顯著促進(jìn)t淋巴細(xì)胞增殖(邱妍，等.懷牛膝多糖對(duì)雛雞疫苗免疫效果的影響.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(7)：723-727)。牛膝多糖經(jīng)水煎、醇沉方法提取牛膝粗多糖(具體制備方法不詳)，研究對(duì)雛雞進(jìn)行禽流感滅活苗免疫的影響。肉仔雞于2和6周齡分別進(jìn)行禽流感滅活苗的首免和二免。免疫同時(shí)每羽雞肌肉注射0.5ml4mg/ml和8mg/ml牛膝粗多糖。結(jié)果表明二免后聯(lián)用牛膝多糖-禽流感組雛雞血凝抑制抗體的滴度顯著升高，脾、胸腺和法氏囊指數(shù)均顯著提高(劉永華，等.牛膝多糖對(duì)雛雞禽流感免疫效果的影響.飼料研究，2014，9：52-53)。孫麗莎等研究牛膝多糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％，購自山東泰安醫(yī)藥有限公司)與鋅單用及合用體外在負(fù)載人食管癌ec9706制備的凍融抗原條件下對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞(dc)增殖分化和抗原提呈能力的影響。結(jié)果表明小鼠骨髓細(xì)胞體外在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子(gm-csf)和白細(xì) 胞介素-4(il-4)誘導(dǎo)下骨髓細(xì)胞生成dc，同時(shí)培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的牛膝多糖(200、300、400μg/ml)、鋅(0.02μg/ml)。結(jié)果表明牛膝多糖和鋅單用在腫瘤抗原負(fù)載下能夠促進(jìn)小鼠骨髓源性dc的分化、成熟及表面標(biāo)記cd86、cd11a的表達(dá)，增強(qiáng)dc誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞反應(yīng)，能夠使荷瘤小鼠免疫器官脾臟和胸腺的質(zhì)量增加，明顯抑制腫瘤的生長。牛膝多糖和鋅合用并不協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)(孫麗莎，等.牛膝多糖與鋅對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞增殖分化和抗原提呈能力的影響.中草藥，2010，41(8)：1319-1322)。(3)牛膝成分的免疫活性研究chen等牛膝水煎煮3次，水煎液采用sevage方法(正丁醇：氯仿＝4:1)脫色素和蛋白后、透析、醇沉(乙醇終濃度80％)。沉淀部分水溶解、h2o2脫色、透析、再醇沉(乙醇終濃度75％)。沉淀部分水溶解部分進(jìn)行deae-纖維素和sephadexg-50柱層析，獲得牛膝多糖(abp)。該abp有甘露糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8:1。該多糖口服給3-4周齡幼豬，每天按500、1000和1500mg/kg劑量摻入食物中，連續(xù)喂養(yǎng)至14天和28天時(shí)，采血，測定對(duì)免疫功能的影響。結(jié)果顯示abp1000和1500mg/kg劑量能提高外周血淋巴細(xì)胞的增殖及血清igg、iga,、igm、c3、c4、il-2和ifn-γ(chen,etal.achyranthesbidentatapolysaccharideenhancesimmuneresponseinweanedpiglets.immunopharmimmunotoxicol,2009,31(2):253-260)。zhou等研究了從牛膝中分離純化的一種多糖abp，分子量1400da，由果糖和葡萄糖構(gòu)成，摩爾比為8:1。果糖連接方式有：1,2-fru、1,2,6-fru以及末端1-fru和1-glc。該abp能刺激小鼠樹突細(xì)胞成熟(dc)和增殖，增加cd86、cd40和mhc-ii的表達(dá)。功能評(píng)價(jià)試驗(yàn)顯示當(dāng)dc細(xì)胞內(nèi)的acp酶下調(diào)時(shí)，dc的胞吞作用下降，抗原呈遞能力升高，促進(jìn)il-12的分泌(zou,etal.modulationofphenotypicandfunctionalmaturationofmurinedendriticcells(dcs)bypurifiedachyranthesbidentatapolysaccharide(abp).inter immunopharm,2011,11:1103-1108)。zhu等將牛膝多糖abps(分子量1400da，由果糖和葡萄糖構(gòu)成，摩爾比為8:1)按50mg/kg劑量腹腔注射小鼠，連續(xù)10天和15天，然后感染p.y17xl瘧原蟲。感染3天和5天時(shí)，預(yù)先注射abps能提高th1免疫反應(yīng)，增加f4/80+cd36+巨噬細(xì)胞數(shù)量，提高ifn-γ、tnf-α和no的水平，抵抗瘧原蟲的感染。另外abps還能增加骨髓cd11c+cd11b+樹突細(xì)胞和cd11c+cd45r+/b220+類漿細(xì)胞，調(diào)節(jié)cd11c+樹突細(xì)胞表達(dá)mhc-ii、cd86和tlr-9。預(yù)處理abps不影響中性treg的數(shù)量或抗炎因子il-10的生成(4.zhu,etal.polysaccharidesfromthechinesemedicinalherbachyranthesbidentataenhanceanti-malarialimmunityduringplasmodiumyoelii17xlinfectioninmice.malariaj,2012,11:49-55)。陳清華等采用水煎煮、sevage法脫蛋白、h2o2脫色、透析和醇沉制備牛膝粗多糖。粗多糖經(jīng)deae-纖維素和sephadexg-50柱色譜純化后，獲得分子量均一多糖abp。abp由果糖和葡萄糖組成，兩者的摩爾比為8：1。斷奶乳豬在飼喂基礎(chǔ)日糧中添加500、1000、1500mg/kgabp，試驗(yàn)第14和28天外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清中細(xì)胞因子tnf、il-1b、il-2、il-6的含量。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，試驗(yàn)第14天和28天abp三個(gè)劑量組的淋巴細(xì)胞si值分別提高了8.04％(p>0.05)、11.32％(p<0.01)和24.11％(p<0.01)；19.81％(p<0.01)、69.64％(p<0.01)和43.40％(p<0.01)。試驗(yàn)第14天時(shí)，abp中劑量和高劑量組細(xì)胞因子tnf、il-1β、il-2和il-6含量極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，低劑量組的tnf和il-2含量顯著高于對(duì)照組(陳清華，等.牛膝多糖對(duì)仔豬淋巴細(xì)胞增殖作用和細(xì)胞因子分泌量的影響.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，20(6):712-717)。何桂萍等從牛膝根中分離提取得到的一種小分子水溶性的多糖(abps，制備方法不詳)，由果糖和葡萄糖組成，摩爾比為8.7:1.0，平均分子量為1400。牛膝多糖濃度分別為0.1mmol/l、0.05mmol/l、 0.025mmol/處理成熟dc細(xì)胞72h。結(jié)果：牛膝多糖處理組dc的同種mlr能力明顯增強(qiáng)(p<0.05)，il-12p70、il-17、tnf-α的分泌能力有顯著提高(何桂萍，等.牛膝多糖對(duì)人樹突狀細(xì)胞功能影響的體外研究.九江學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，(3)：49-52)。王劍等從川牛膝(cyathulaofficinali)中分離一種多糖cp(具體制備方法不詳)。cp主要由d-β-果糖組成，含有少量的d-α-葡萄糖，平均相對(duì)分子量(mr)為1.6×103－2.7×103。體外研究表明，川牛膝多糖cp在10－300μg/ml濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)b淋巴細(xì)胞增殖(p<0.01)，增強(qiáng)小鼠nk細(xì)胞活性(p<0.05)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅活性(p<0.01)，且隨多糖濃度增高而增強(qiáng)；但對(duì)t淋巴細(xì)胞的增殖無促進(jìn)作用(p>0.05)。王劍等又將該川牛膝多糖cp按25、50和100mg/kg.d的劑量腹腔注射小鼠，連續(xù)注射10d后，能增強(qiáng)正常小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和nk細(xì)胞活性，提高小鼠碳粒廓清速率、抗體生成細(xì)胞數(shù)量和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞百分率，且隨多糖濃度增高而增強(qiáng)。cp還能顯著改善由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的白細(xì)胞數(shù)減少，但其對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無促進(jìn)作用(王劍，等.川牛膝多糖的體外免疫活性研究.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2008，14(4)：481-483；王劍，等.川牛膝多糖的體內(nèi)免疫活性研究.中藥藥理與臨床，2007，23(6)：31-33)。xiang等評(píng)價(jià)牛膝多糖abp(制備方法不詳)，其分子量1.34kda，單糖組成為葡萄糖：甘露糖＝2:1。該多糖體外100-800μg/ml能協(xié)同lps刺激外周血巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞分泌il-1。abp按50和100mg/kg劑量灌胃小鼠5d，也能刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌il-1(xiang,etal.effectsofachyranthesbidentatpolysaccharidesoninterleukin-1andtumornecrosisfactor-alphaproductionfrommouseperitonealmacrophages.中國藥理學(xué)報(bào)，1993,14(4)：332-336)。向道斌等研究懷牛膝多糖abp(制備方法不詳)對(duì)體內(nèi)外t淋巴細(xì)胞和天然殺傷(nk)細(xì)胞功能的影響。abp相對(duì)分子量為1360da， 由d-β-葡萄糖和d-α-甘露糖組成，摩爾比為2:1。結(jié)果表明abp50-800mg/l在體外增強(qiáng)天然殺傷(nk)細(xì)胞活性和促進(jìn)伴刀豆球蛋白a(cona)誘導(dǎo)的tnf-β產(chǎn)生，但不能提高cona誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和il-2的產(chǎn)生。abp按50和100mg/kg劑量腹腔注射小鼠，能明顯提高正常小鼠nk細(xì)胞活性和tnf-β生成，增強(qiáng)二硝基氟苯誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和對(duì)抗環(huán)磷酞胺對(duì)nk活性的抑制作用，但時(shí)cona誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和il-2的產(chǎn)生無明顯影響(向道斌，等.牛膝多糖對(duì)t淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞功能的影響.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1994，8(3)：209-212)。向道斌等又研發(fā)現(xiàn)該abp按50mg/kg劑量腹腔注射小鼠5天能明顯提高血清總igg及特異性抗體溶血素的含量，增加脾臟空斑形成細(xì)胞含量。abp體外0.2－0.8g/l能刺激小鼠脾細(xì)胞增殖，也能增強(qiáng)lps刺激的b淋巴細(xì)胞的增殖(向道斌，等.牛膝多糖對(duì)小鼠體液免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用.上海免疫學(xué)雜志，1994，14(3)：134-136)。呂建新等研究牛膝多糖(中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供，具體制備方法和理化性質(zhì)不詳)對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用。0.312、0.625、1.250、2.500和5.000mg/ml牛膝多糖體外與人胸腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，測定胸腔巨噬細(xì)胞內(nèi)tnf-α與il-6的含量。結(jié)果表明牛膝多糖能上調(diào)胸腔巨噬細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶和酸性磷酸酶活性，顯著誘導(dǎo)胸腔巨噬細(xì)胞表達(dá)tnf-α和il-6(呂建新，等.牛膝多糖對(duì)人胸腔巨噬細(xì)胞的激活作用.中國免疫學(xué)雜志，1999，15：422-424)。王德成等研究牛膝多糖abps(中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供，具體制備方法和理化性質(zhì)不詳)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的活化作用。結(jié)果顯示，濃度為100、200μg/ml的abps對(duì)巨噬細(xì)胞tnf-α分泌均有顯著的促進(jìn)作用，200μg/ml的abps對(duì)巨噬細(xì)胞il-12分泌也有明顯的促進(jìn)作用。abps能明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞tlr-4mrna的表達(dá)(王德成，等.牛膝多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活化作用.微生物學(xué)雜志，2013，33(4)：59-61)。王德成等又研究該牛膝多糖對(duì)巨 噬細(xì)胞細(xì)胞毒作用及機(jī)制。以200mg/l濃度的abps體外刺激小鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明濃度為200mg/l的abps對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒作用和no表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)inosmrna和蛋白表達(dá)均有明顯的促進(jìn)作用(王德成，等.牛膝多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用影響及機(jī)制.微生物學(xué)雜志，2014,34(6)：70-73)。季敬璋等研究牛膝多糖abps(中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供，具體制備方法和理化性質(zhì)不詳)體外在終濃度為0、100、200、400、800μg/ml或在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)人t細(xì)胞培養(yǎng)上清液的ifn-γ及il-4的蛋白表達(dá)影響。結(jié)果表明人t細(xì)胞ifn-γ分泌水平隨abps濃度遞增，在400μg/ml時(shí)，ifn-γ表達(dá)量最高(p<0.05)，而il-4的分泌無明顯影響。人t細(xì)胞在abps刺激不同時(shí)間后，ifn-γ分泌水平逐步增高，在48小時(shí)分泌最高(季敬璋，等.牛膝多糖體外誘導(dǎo)人t細(xì)胞表達(dá)ifn-c和il-4蛋白的機(jī)制探討.中國免疫學(xué)雜志，2003，19：611-613)。綜上所述，上述文獻(xiàn)中牛膝粗多糖主要采用水煎煮、乙醇沉淀方法制備粗多糖，結(jié)合采用sevage方法脫蛋白、h2o2除色素等。從牛膝中主要分離3個(gè)成分：(1)肽多糖，分子量為2.3×104，由d-葡萄糖酸、d-半乳糖、d-半乳糖酸、l-阿拉伯糖和l-鼠李糖組成，摩爾比為12:2:3:1:1。(2)寡糖，由果糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8：1，其數(shù)均分子量為1400u。(3)多糖，由甘露糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8:1，分子量不詳。(4)寡糖，其分子量1.34kda，單糖組成為葡萄糖：甘露糖＝2:1。免疫活性文獻(xiàn)中所提及的牛膝寡糖或均一多糖均無詳細(xì)的制備方法及理化性質(zhì)的描述。有2篇文獻(xiàn)將牛膝粗多糖作為佐劑應(yīng)用于禽流感滅活苗、o型口蹄疫滅活疫苗和雞新支二聯(lián)弱毒苗。粗多糖主要采用水煎煮和乙醇沉淀方法，其具體制備條件和理化性質(zhì)不詳)。另外，目前亦尚未見牛膝寡糖或均一多糖作為疫苗佐劑的相關(guān)研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，從中藥材牛膝中分離得到了2個(gè)牛膝粗多糖abp-50和abp-100。進(jìn)一步地，從abp-50中得到多糖組分abp-50-a和abp-50-b，從abp-100中得到多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c。更進(jìn)一步地，從abp-50-a中得到均一多糖abp-50-a-1，從abp-100-c中得到均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3。本發(fā)明人還分別對(duì)上述牛膝粗多糖、多糖組分和均一多糖的理化性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)其疫苗佐劑和免疫調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，牛膝粗多糖abp-50和abp-100，多糖組分abp-50-a和abp-100-c，以及均一多糖abp-50-a-1、abp-100-c-1和abp-100-c-2均具有良好的免疫佐劑活性和免疫調(diào)節(jié)作用，具有制備疫苗佐劑和免疫調(diào)節(jié)藥物的潛力。由此提供了下述發(fā)明：(一)牛膝粗多糖及其制備方法本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種牛膝粗多糖，其選自如下的牛膝粗多糖1－2：牛膝粗多糖1：主要由果糖組成，分子量為1000－3000da；優(yōu)選地，還含有少量葡萄糖；優(yōu)選地，峰高分子量為1900da；牛膝粗多糖2：主要由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，分子量為1.0×104－2.0×105da；優(yōu)選地，峰高分子量為66000da(寬峰)。分子量可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉的方法測定，例如采用hplc方法測定多糖分子量，依據(jù)多糖分子量與保留時(shí)間相關(guān)性，計(jì)算分子量。本發(fā)明的另一方面涉及一種制備牛膝粗多糖(粗多糖1)的方法，包括下述步驟：(1)將牛膝藥材(例如懷牛膝或川牛膝)用水進(jìn)行浸泡，保持溫度為4℃－80℃，得到水提液；(2)將水提液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液進(jìn)行乙醇沉淀，沉淀部分加入水溶解，得到上清液；(3)取上清液進(jìn)行水透析或膜過濾；(4)取透析液或?yàn)V液進(jìn)行濃縮，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到牛膝粗多糖。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述的制備牛膝粗多糖的方法，其特征在于如下的[1]－[13]項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng):[1]將所述藥材牛膝進(jìn)行粉碎；[2]步驟(1)中所用水為蒸餾水或去離子水；[3]步驟(1)中，所述溫度為20℃－80℃；優(yōu)選為25℃－60℃、40℃－55℃、45℃－55℃、48℃－52℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；[4]將步驟(1)中的操作重復(fù)一次或者多次，合并水提液；[5]步驟(1)中水的用量為1－50倍量(l/kg)，優(yōu)選為5－30倍量，優(yōu)選為50－20倍量或者10－20倍量，例如15倍量；[6]步驟(1)中的浸泡時(shí)間為至少1小時(shí)、至少2小時(shí)、2－24小時(shí)、3－12小時(shí)或者5小時(shí)；[7]步驟(2)中，醇沉后乙醇的終濃度為60％－90％，例如70％－80％；[8]步驟(2)中所用乙醇的量為濃縮液的1－5倍體積，例如3－5倍體積；[9]步驟(2)中醇沉的時(shí)間為至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、24－72小時(shí)或者48小時(shí)；[10]步驟(2)中，乙醇沉淀后離心，得到的沉淀用水進(jìn)行一次或多次溶解，離心，合并上清液；[11]步驟(2)和/或(4)中減壓濃縮的溫度為50℃－55℃；[12]步驟(3)中透析或者膜過濾的截留分子量>1000；[13]步驟(3)中的膜過濾為超濾。本發(fā)明還涉及另外一種制備牛膝粗多糖(粗多糖2)的方法，包括下述步驟：1)將牛膝藥材(例如懷牛膝或川牛膝)或者前面步驟(1)中提取后得到的牛膝藥材殘?jiān)盟M(jìn)行浸泡或者煎煮，保持溫度為81－100℃，得到水提液；2)將水提液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液進(jìn)行乙醇沉淀，沉淀部分加入水溶解，得到上清液；3)取上清液進(jìn)行水透析或膜過濾；4)取透析液或?yàn)V液進(jìn)行濃縮，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥；在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述的制備牛膝粗多糖的方法，其特征在于如下的[1]－[13]項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng):[1]將所述藥材牛膝或者所述牛膝藥材殘?jiān)M(jìn)行粉碎；[2]步驟(1)中所用水為蒸餾水或去離子水；[3]步驟(1)中，所述溫度為82℃－100℃；優(yōu)選為85℃－100℃、90℃－100℃、95℃－100℃、96℃－100℃、97℃－100℃、98℃－100℃、99℃－100℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃；[4]將步驟(1)中的操作重復(fù)一次或者多次，合并水提液；[5]步驟(1)中水的用量為1－50倍量(l/kg)，優(yōu)選為5－30倍量，優(yōu)選為50－20倍量或者10－20倍量，例如15倍量；[6]步驟(1)中的浸泡或煎煮的時(shí)間為至少1小時(shí)、至少2小時(shí)、2－24小時(shí)、3－12小時(shí)或者5小時(shí)；[7]步驟(2)中，醇沉后乙醇的終濃度為60％－90％，例如70％－80％；[8]步驟(2)中所用乙醇的量為濃縮液的1－4倍體積；[9]步驟(2)中醇沉的時(shí)間為至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、24－72小時(shí)或者48小時(shí)；[10]步驟(2)中，乙醇沉淀后離心，得到的沉淀用水進(jìn)行一次或多次溶解，離心，合并上清液；[11]步驟(2)和/或(4)中減壓濃縮的溫度為50℃－55℃；[12]步驟(3)中透析或者膜過濾的截留分子量>1000；[13]步驟(3)中的膜過濾為超濾。本發(fā)明還涉及一種牛膝粗多糖，其由前面本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的制備牛膝粗多糖的方法制得。本發(fā)明的牛膝粗多糖含有下面的本發(fā)明的牛膝多糖組分以及牛膝均一多糖。(二)牛膝多糖組分及其制備方法本發(fā)明的再一方面涉及一種牛膝多糖組分，其選自如下的牛膝多糖組分1－5：牛膝多糖組分1：主要由果糖組成；含有或者為一個(gè)均一多糖(一種果聚糖)，分子量為1900±1000da；優(yōu)選地，還含有少量葡萄糖；優(yōu)選地，多糖的峰高分子量為1860da；牛膝多糖組分2：主要由阿拉伯糖(ara)、木糖(xyl)、葡萄糖(glc)和半乳糖(gal)組成；含有峰高分子量大于200,000da的多糖i、分子量為48,300±25,000da的多糖ii以及寡糖(1000－5000da)等成分；優(yōu)選地，多糖ii的峰高分子量48,300da。牛膝多糖組分3：主要由阿拉伯和葡萄糖組成；含有分子量為3300±2000da的多糖；優(yōu)選地，多糖的峰高分子量為3300da；牛膝多糖組分4：主要由阿拉伯糖、鼠李糖(rha)、半乳糖和半乳糖醛酸(gala)組成；含有二個(gè)多糖，分子量分別為55,000±30,000da、7300±4000da；優(yōu)選地，多糖的峰高分子量分別為55,000da和7300da；牛膝多糖組分5：主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成；為不對(duì)稱糖分布，主要峰的分子量為97,100±40,000da；優(yōu) 選地，主要峰的峰高分子量為97,100da。本發(fā)明還涉及一種制備牛膝多糖組分的方法，包括下述步驟：將本發(fā)明的牛膝粗多糖1用水溶解后，通過選自deae-纖維素柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、瓊脂糖凝膠柱層析和丙烯葡聚糖凝膠柱層析中的至少一種進(jìn)行分離，采用水或鹽洗脫。例如采用deae-纖維素柱層析，依次用水和nahco3溶液洗脫，檢測糖峰并收集含糖流份，分別得到水洗脫的多糖組分1和nahco3溶液洗脫的多糖組分2。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述deae-纖維素柱為deae-纖維素(hco3-)柱。優(yōu)選地，nahco3溶液的濃度為0.1-0.4mol/l，0.2-0.3mol/l，進(jìn)一步優(yōu)選為0.25mol/l。優(yōu)選地，用苯酚-硫酸法或蒽酮法檢測糖峰。本發(fā)明還涉及另外一種制備牛膝多糖組分的方法，包括下述步驟：將本發(fā)明的牛膝粗多糖2用水溶解后進(jìn)行deae-纖維素柱層析，依次用水、0.2-0.3mol/lnahco3溶液和0.4-0.6mol/lnahco3溶液洗脫，檢測糖峰并收集含糖流份，分別得到水洗脫的多糖組分3、0.2-0.3mol/lnahco3溶液洗脫的多糖組分4(優(yōu)選使用0.25mol/lnahco3溶液洗脫)0.4-0.6mol/lnahco3溶液洗脫的5(優(yōu)選使用0.5mol/lnahco3溶液洗脫)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述deae-纖維素柱為deae-纖維素(hco3-)柱。優(yōu)選地，用苯酚-硫酸法檢測糖峰。本發(fā)明還涉及一種牛膝多糖組分，其由前面本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的制備牛膝多糖組分的方法制得。本發(fā)明的牛膝多糖組分含有下面的本發(fā)明的牛膝均一多糖。(三)牛膝均一多糖及其制備方法本發(fā)明的再一方面涉及一種牛膝均一多糖，其選自如下的牛膝多糖1－4：牛膝均一多糖1：分子量2.0×103±1.0×103da，是一種果聚糖，主要含有果糖，即為一種果聚糖，還含有少量葡萄糖；優(yōu)選地，峰高分子量為1860da。牛膝均一多糖2：分子量1.05×106±0.50×106da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80－1.20)：(4.00－6.50)：(4.00－5.50)：(6.00－9.00)；優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90－1.10)：(5.10－5.50)：(4.50－4.90)：(8.00－8.50)；更優(yōu)選地鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.00：5.26：4.86：8.27；優(yōu)選地，峰高分子量為1.05×106da；在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的牛膝均一多糖2，其中，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80-1.20)：(5.00-5.50)：(4.50-5.00)：(8.00-8.50)；優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90-1.10)：(5.10-5.30)：(4.70-4.90)：(8.10-8.40)。牛膝均一多糖3：分子量5.35×105±2.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80－1.20)：(1.50－3.00)：(2.00－3.50)：(40.00－70.00)；優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90－1.10)：(1.80－2.20)：(2.30－2.60)：(50.00－60.00)；更優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.00：2.06：2.42：56.02；優(yōu)選地，峰高分子量為5.35×105da；在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的牛膝均一多糖3，其中，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80-1.20)：(1.8-2.30)：(2.20-2.70)：(52.00-60.00)；優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90-1.10)：(1.9-2.20)：(2.30-2.60)：(54.00-58.00)。牛膝均一多糖4：分子量2.78×105±1.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80－1.20)：(0.50 －1.50)：(0.20－0.80)：(0.50－2.00)：(12.00－20.00)；優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90－1.10)：(0.80－1.00)：(0.30－0.50)：(0.80－1.50)：(13.00－18.00)；更優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.00：0.93：0.34：0.91：16.67；優(yōu)選地，峰高分子量為2.78×105da；在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的牛膝均一多糖4，其中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80-1.20)：(0.70-1.20)：(0.25-0.55)：(0.70-1.20)：(12.00-20.00)；優(yōu)選地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90-1.10)：(0.80-1.00)：(0.30-0.40)：(0.80-1.00)：(15.00-18.00)。本發(fā)明還涉及一種制備牛膝均一多糖的方法，包括下述步驟：將本發(fā)明的多糖組分1用水溶解后進(jìn)行sephadexg-25或sephadexg-50凝膠柱層析，采用水洗脫，檢測糖峰并收集含糖流份分，得到均一多糖1。優(yōu)選地，用蒽酮-硫酸或苯酚-硫酸法檢測糖峰。本發(fā)明還涉及另外一種制備牛膝均一多糖的方法，包括下述步驟：將本發(fā)明的多糖組分5用水溶解后進(jìn)行sephadexg-75或sephadexg-100凝膠柱層析，采用h2o或0.05－0.25mol/lnacl洗脫，檢測糖峰并收集含糖流份，得到均一多糖2、均一多糖3和均一多糖4。優(yōu)選地，用苯酚-硫酸法檢測糖峰。優(yōu)選地，用0.1mol/lnacl洗脫。本發(fā)明還涉及一種牛膝均一多糖，其由前面本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的制備牛膝均一多糖的方法制得。本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含選自本發(fā)明的一種或幾種牛膝粗多糖、一種或幾種牛膝多糖組分和/或一種或幾種牛膝均一多糖，以及任選的藥學(xué)上可接受的輔料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為疫苗制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為疫苗佐劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組 合物為免疫調(diào)節(jié)劑(用于上調(diào)或者下調(diào)免疫活性)或者提高免疫力的藥物。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明牛膝粗多糖、牛膝多糖組分或者牛膝均一多糖在制備疫苗、疫苗佐劑、抗體、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性的藥物或者提高動(dòng)物免疫力的藥物中的用途；所述調(diào)節(jié)例如為上調(diào)或者下調(diào)；優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性選自如下：促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖，促進(jìn)脾臟b細(xì)胞、ctl細(xì)胞、t細(xì)胞和/或th細(xì)胞的分化，以及提高cd3+、cd4+細(xì)胞、cd19+和/或cd8+細(xì)胞的比例。所述抗體例如為單克隆抗體或多克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，例如鼠(例如小鼠或者大鼠)、豬、牛、羊、兔、狗、猴或人，優(yōu)選為人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為家禽，例如雞、鴨或鵝。本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性或者提高動(dòng)物免疫力的方法，包括使用有效量的本發(fā)明的牛膝粗多糖、牛膝多糖組分或者牛膝均一多糖的步驟；所述調(diào)節(jié)例如為上調(diào)或者下調(diào)；優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性選自如下：促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖，促進(jìn)脾臟b細(xì)胞、ctl細(xì)胞、t細(xì)胞和/或th細(xì)胞的分化，以及提高cd3+、cd4+細(xì)胞、cd19+和/或cd8+細(xì)胞的比例。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，例如鼠(例如小鼠或者大鼠)、豬、牛、羊、兔、狗、猴或人，優(yōu)選為人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為家禽，例如雞、鴨或鵝。本發(fā)明還涉及一種制備抗體的方法，其包括使用有效量的本發(fā)明 的一種或幾種牛膝粗多糖、一種或幾種牛膝多糖組分和/或一種或幾種牛膝均一多糖的步驟。本發(fā)明中，術(shù)語“粗多糖”(crudepolysaccharides)是指將藥材或者植物水提和醇沉后得到的產(chǎn)物，本領(lǐng)域中有時(shí)也稱為“總多糖”。本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉，如果藥材中含有多糖，藥材經(jīng)過水提取、乙醇沉淀獲得的沉淀部分中一定含有多糖，但可能還含有其他非糖成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，總多糖并非是指藥材或者植物的全部多糖，因?yàn)闊o論怎樣提取也很難獲得植物的全部多糖。術(shù)語“均一多糖”(homogeneouspolysaccharide)具有本領(lǐng)域公知的含義，是指分子量和電荷均一的多糖?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知悉的方法來測定分子量均一和電荷均一。例如，分子量均一可以通過hpgpc圖譜對(duì)稱峰型來確定；電荷均一可以經(jīng)過離子交換柱層析測定，一般電泳圖譜為單一對(duì)稱峰。術(shù)語“多糖組分”(polysaccharidecomponent，有時(shí)在具體實(shí)驗(yàn)中也稱為fraction)是指含有一種以上均一多糖的混合物。在特殊的情況下，多糖組分只含有一種均一多糖甚至即為一種均一多糖。本發(fā)明中的粗多糖、均一多糖、多糖組分亦分別稱為牛膝粗多糖、牛膝均一多糖、牛膝多糖組分。這樣命名的考慮是其可以從藥材牛膝中提取得到，但是并不排除以其它方式或者來源獲得。所述牛膝包括但不限于懷牛膝(achyranthesbidentata)、川牛膝(cyathulaofficinalis)等。本發(fā)明中，對(duì)于涉及粗多糖、均一多糖、多糖組分的結(jié)構(gòu)、組成、成分或者含量等的描述中，術(shù)語“主要”是指含量≥50％，例如≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或者≥99％。術(shù)語“少量”是指含量≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤ 30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％或者≤1％。上述百分比是指質(zhì)量百分比。在本發(fā)明中，所述疫苗為減毒疫苗、滅活疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、嵌合載體疫苗、dna疫苗、rna疫苗、多肽疫苗或小分子-蛋白偶合物疫苗。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗為h1n1流感疫苗；在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗為乙肝疫苗。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗為小分子-蛋白偶合物疫苗。在本發(fā)明中，疫苗佐劑是指能夠用于疫苗的佐劑，其它疫苗佐劑例如氫氧化鋁或磷酸鋁或白油等佐劑。在本發(fā)明中，疫苗與疫苗制劑含義相同，是指所有用減毒或殺死的病原生物(細(xì)菌、病毒、立克次體等)或其它抗原性物質(zhì)所制成，可使機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫，用于預(yù)防接種或治療的生物制劑。本發(fā)明中，所述乙醇的濃度，如果沒有特別說明，均指重量百分比濃度(w/w％)。本發(fā)明中，術(shù)語“寬峰”一般指多糖在色譜柱中保留時(shí)間間隔長，而且峰型對(duì)稱性不好的色譜峰。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的牛膝粗多糖、多糖組分、以及均一多糖均具有良好的免疫佐劑活性和免疫調(diào)節(jié)作用，為疫苗佐劑和免疫調(diào)節(jié)功能提供了新的選擇。附圖說明下面的附圖5、6、7、9、11、13、15、17、19、21中縱坐標(biāo)mv均是指電信號(hào)毫伏。圖1：牛膝粗多糖abp-50在deae-纖維素柱層析洗脫曲線。圖2：牛膝粗多糖abp-100在deae-纖維素柱層析洗脫曲線。圖3：多糖組分abp-50-a在sephadexg50柱層析洗脫曲線。圖4：多糖組分abp-100-c在sephadexg100的洗脫曲線。圖5：牛膝粗多糖abp-50的gpc圖譜。圖6：牛膝粗多糖abp-100的gpc圖譜。圖7：多糖組分abp-50-a的gpc圖譜。圖8：多糖組分abp-50-a的ce圖譜。圖9：多糖組分abp-50-b的gpc圖譜。圖10：多糖組分abp-50-b的ce圖譜。圖11：多糖組分abp-100-a的gpc圖譜。圖12：多糖組分abp-100-a的ce圖譜。圖13：多糖組分abp-100-b的gpc圖譜。圖14：多糖組分abp-100-b的ce圖譜。圖15：多糖組分abp-100-c的gpc圖譜。圖16：多糖組分abp-100-c的ce圖譜。圖17：均一多糖abp-100-c-1的gpc圖譜。圖18：均一多糖abp-100-c-1的ce圖譜。圖19：均一多糖abp-100-c-2的gpc圖譜。圖20：均一多糖abp-100-c-2的ce圖譜。圖21：均一多糖abp-100-c-3的gpc圖譜。圖22：均一多糖abp-100-c-3的ce圖譜。圖23：圖23a，牛膝粗多糖abp-50對(duì)乙肝抗原免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖23b，牛膝粗多糖abp-50對(duì)乙肝抗原免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。圖24：圖24a，牛膝粗多糖abp-100對(duì)乙肝抗原免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖24b，牛膝粗多糖abp-100對(duì)乙肝抗原免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。圖25：圖25a，牛膝多糖組分abp-50-a對(duì)h1n1流感疫苗免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖25b，牛膝多糖組分abp-50-a對(duì) h1n1流感疫苗免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。圖26：圖26a，多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c對(duì)乙肝抗原免疫小鼠初次免疫的抗體滴度影響。圖26b，多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c對(duì)乙肝抗原免疫小鼠二次免疫的抗體滴度影響。圖27：圖27a，均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)乙肝抗原免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖27b，均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)乙肝抗原免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：牛膝粗多糖abp-50和abp-100的制備1.牛膝粗多糖abp-50的制備取中藥材懷牛膝(購于北京同仁堂藥店)1kg，粉碎，向其中加入蒸餾水15l，50℃條件下浸泡5小時(shí)，期間不時(shí)攪拌；然后二層紗布過濾，濾液離心(3000r/min×20min)，浸提后的殘?jiān)谕瑯訔l件下進(jìn)行第二次提取，得到牛膝藥材殘?jiān)?殘?jiān)糜诤竺鎍bp-100的制備)和水提液。合并兩次提取的水提液，50－55℃減壓濃縮獲得水提濃縮液。然后加入濃縮液的4倍體積95％乙醇進(jìn)行醇沉48小時(shí)(上清液乙醇濃度80％)。離心，分離沉淀部分，向沉淀部分中加入水?dāng)嚢枞芙?，離心，再將沉淀同樣操作3次；合并溶解的上清液，裝入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；將得到的袋內(nèi)透析液減壓濃縮后，進(jìn) 行冷凍干燥，獲得牛膝粗多糖abp-50。2.牛膝粗多糖abp-100的制備向前面得到的牛膝藥材殘?jiān)屑尤胝麴s水15l，100℃條件下煎煮1.5小時(shí)，期間不時(shí)攪拌；然后放涼，二層紗布過濾，濾液離心(3000r/min×20min)，上清液50℃－55℃減壓濃縮，獲得水提濃縮液。然后加入濃縮液的3倍體積95％乙醇進(jìn)行醇沉48小時(shí)(上清液乙醇濃度70％)。離心，分離沉淀部分，向沉淀部分中加入水?dāng)嚢枞芙?，離心，再將沉淀同樣操作3次；合并溶解的上清液，裝入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；將得到的袋內(nèi)透析液減壓濃縮后，進(jìn)行冷凍干燥，獲得牛膝粗多糖abp-100。實(shí)施例2：牛膝多糖組分abp-50-a、abp-50-b，以及abp-100-a、abp-100-b、abp-100-c的制備1.牛膝多糖組分abp-50-a、abp-50-b的制備稱取實(shí)施例1得到的牛膝粗多糖abp-501g，加入20ml水溶解后上樣于deae-纖維素層析柱(φ7.0cm×50cm)，依次用h2o和0.25mol/lnahco3洗脫，洗脫速度1ml/min，每只試管收集10ml，蒽酮-硫酸法檢測流出的糖吸收峰(od620nm)。分別獲得abp-50-a(h2o洗脫)和abp-50-b(0.25mol/lnahco3洗脫)二個(gè)多糖組分，洗脫曲線見圖1。abp-50-b流份蒸餾水透析除鹽。2.牛膝多糖組分abp-100-a、abp-100-b、abp-100-c的制備稱取實(shí)施例1得到的牛膝粗多糖abp-1001g，加入20ml水溶解后上樣于deae-纖維素層析柱(φ7.0cm×50cm)，依次用h2o、0.25和0.5mol/lnahco3洗脫，洗脫速度1ml/min，每只試管收集10ml，苯酚-硫酸法檢測流出的糖吸收峰(od620nm)。分別獲得abp-100-a(h2o洗脫)、abp-100-b(0.25mol/lnahco3洗脫)和abp-100-c(0.5mol/lnahco3洗脫)三個(gè) 多糖組分，洗脫曲線見圖2。分別收集三個(gè)含糖流份，用蒸餾水透析除鹽，在減壓濃縮和冷凍干燥制得。實(shí)施例3：牛膝均一多糖abp-50-a-1，以及abp-100-c-1、abp-100-c-2、abp-100-c-3的制備1.牛膝均一多糖abp-50-a-1的制備稱取多糖組分abp-50-a200mg，加入2ml水溶解，上樣sephadexg50凝膠層析柱(ф2.0cm×120cm)，蒸餾水洗脫(洗脫曲線見圖3)，硫酸-蒽酮法檢測流出的糖吸收峰(od620nm)，減壓濃縮和冷凍干燥，獲得均一多糖abp-50-a-1。2.牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2、abp-100-c-3的制備稱取多糖組分abp-100-c200mg，加入3ml水溶解，上樣sephadexg100凝膠層析柱(ф2.0cm×120cm)，0.1mol/lnacl洗脫(洗脫曲線見圖4)，硫酸-苯酚法檢測流出的三個(gè)含糖吸收峰(od490nm)，分別收集、蒸餾水、減壓濃縮和冷凍干燥，獲得三個(gè)均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3。實(shí)施例4：牛膝粗多糖abp-50和abp-100的理化性質(zhì)研究1.實(shí)驗(yàn)用品實(shí)施例1方法制備得到牛膝粗多糖abp-50和abp-100。2.實(shí)驗(yàn)方法采用硫酸－苯酚法測定糖含量(以葡萄糖計(jì)算)；采用hpgpc方法測定多糖組分分子量分布(儀器：hplc，waters公司；色譜柱：tsksw3000；流動(dòng)相：0.1mna2so4；流速：0.6ml/min；檢測器：示差)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果牛膝粗多糖abp-50的糖含量為94.29％，abp-100的糖含量為 29.03％。abp-50主要含有峰高分子量為2000da的寡糖，分子量2000±1000da；abp-100主要含有一個(gè)峰高分子量為6.60×104da的寬色譜峰，分子量6.60×104±3.50×104da。abp-50和abp-100的分子量分布見圖5和圖6。實(shí)施例5：多糖組分abp-50-a、abp-50-b以及abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c的理化性質(zhì)研究1.實(shí)驗(yàn)樣品實(shí)施例2方法制備得到牛膝粗多糖abp-50的兩個(gè)多糖組分(abp-50-a、abp-50-b)及abp100的三個(gè)多糖組分(abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c)。2.實(shí)驗(yàn)方法采用hpgpc方法測定多糖組分分子量分布(儀器：hplc，waters公司；色譜柱：tsksw3000；流動(dòng)相：0.1mna2so4；流速：0.6ml/min；檢測器：示差)。多糖完全酸水解和pmp衍生化，采用毛細(xì)管電泳方法測定單糖的摩爾比(儀器：美國貝克曼公司，緩沖鹽溶液：50mmol/l硼砂溶液(ph＝10.57)；毛細(xì)管柱：φ50μm×60cm；分離電壓：15kv；檢測波長：245nm；進(jìn)樣壓力：0.5psi；進(jìn)樣時(shí)間：10s；柱溫：25℃)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)abp-50-a：是一個(gè)分子量均一的均一多糖，峰高分子量為1,860da，主要含有果糖，即為一種果聚糖，還含有少量葡萄糖，結(jié)果見圖7和圖8。(2)abp-50-b：分子量分布較寬，其中含有峰高大于200,000da的多糖、峰高48,300da及高含量寡糖成分。該組分由阿拉伯糖(ara)、木糖(xyl)、葡萄糖(glc)和半乳糖(gal)組成，結(jié)果見圖9和圖10。(3)abp-100-a：主要含有一個(gè)峰高分子量為3,300da的多糖， 主要由阿拉伯和葡萄糖組成，單糖摩爾比為：ara：glc＝1.00：0.90，結(jié)果見圖11和圖12。(4)abp-100-b：含有二個(gè)多糖峰，峰高分子量分別為55,000da和7,300da，主要由阿拉伯糖、鼠李糖(rha)、半乳糖和半乳糖醛酸(gala)組成，單糖摩爾比為：ara：rha：gal：gala＝1.00：0.24：0.54：1.71，結(jié)果見圖13和圖14。(5)abp-100-c：為不對(duì)稱糖分布，主要峰的峰高分子量為97,100da，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：gal：gala＝1.00：2.85：3.37：8.90，結(jié)果見圖15和圖16。實(shí)施例6：牛膝均一多糖abp-50-a-1、abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3的理化性質(zhì)研究1.實(shí)驗(yàn)樣品實(shí)施例3方法制備得到牛膝均一多糖abp-50-a-1、abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3。2.實(shí)驗(yàn)方法采用hpgpc方法測定多糖組分分子量分布(儀器：hplc，waters公司；色譜柱：tsksw3000；流動(dòng)相：0.1mna2so4；流速：0.6ml/min；檢測器：示差)。多糖完全酸水解和pmp衍生化后，采用毛細(xì)管電泳方法測定單糖的摩爾比(儀器：美國貝克曼公司，緩沖鹽溶液：50mmol/l硼砂溶液(ph＝10.57)；毛細(xì)管柱：φ50μm×60cm；分離電壓：15kv；檢測波長：245nm；進(jìn)樣壓力：0.5psi；進(jìn)樣時(shí)間：10s；柱溫：25℃)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)均一多糖abp-50-a-1：與abp-50-a相同。(2)均一多糖abp-100-c-1：峰高分子量為1.05×106da，分子量1.05×106±0.50×106da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖 醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：gal：gala＝1.00：5.26：4.86：8.27，結(jié)果見圖17和圖18。(3)均一多糖abp-100-c-2：峰高分子量為5.35×105da，分子量5.35×105±2.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：gal：gala＝1.00：2.06：2.42：56.02，結(jié)果見圖19和圖20。(4)均一多糖abp-100-c-3：峰高分子量為2.78×105da，分子量2.78×105±1.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：glc：gal：gala＝1.00：0.93：0.34：0.91：16.67，結(jié)果見圖21和圖22。實(shí)施例7：牛膝粗多糖abp-50和abp-100對(duì)乙肝抗原佐劑活性評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的牛膝粗多糖abp-50和abp-100作為佐劑，以乙肝蛋白亞單位(hbsag)為抗原(大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn))，abp-50和abp-100按照0.2mg/鼠劑量分別與乙肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組、單獨(dú)hbsag抗原組、hbsag+abp-50組(0.2mg/鼠)、hbsag+abp-100組(0.2mg/鼠)和hbsag+鋁佐劑組(0.2mg/鼠)。配伍肌肉注射免疫小鼠。小鼠初次免疫后14天，elisa方法測定乙肝抗原特異性抗體滴度。初次免疫后28天進(jìn)行二次免疫，劑量同初次。二次免疫后14天測定乙肝抗原特異性抗體滴度。采用elisa測定血清中抗體滴度，具體操作如下：elisa法所用試劑配制：(1)抗原包被液：50mmol/l碳酸鹽緩沖液ph9.6。稱取無水na2co31.696g，nahco32.856g加水溶解到1000ml，調(diào)節(jié)ph至9.6。(2)洗滌液(10×pbst，ph7.4)：稱取nacl80g，kcl2g，na2hpo429g，kh2po42g，tween-2010ml，雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph7.4，10倍稀釋使用。(3)封閉液：1％bsa，用50mmol/lpbsph7.4溶解。(4)底物液(tmb-h2o2)：使用時(shí)將底物液a和b等體積混合，加入30％h2o2，終濃度0.5％。底物液a(tmb)：稱取tmb200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。底物液b(0.1mol/l檸檬酸-0.2mol/lna2hpo4緩沖液)：na2hpo424.8g，檸檬酸19.33g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph5.0－5.4。(5)2nh2so4。(6)hbsag溶解于抗原包被液，濃度為4μg/ml，包被96孔板(costa)100μl/孔，4℃過夜。pbst洗3遍，1％bsa-pbs37℃封閉1小時(shí)。pbst洗3遍后加入以pbst稀釋的小鼠血清樣品，100μl/孔，37℃孵溫1小時(shí)。pbst洗3遍，加入hrp-羊抗小鼠igg(1:1000，pbst)37℃孵溫1小時(shí)，pbst洗6遍，加入100μl底物液顯色后，加入50μl2nh2so4終止反應(yīng)測定a450。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：初次免疫后14天，各免疫組小鼠的抗體滴度均較低，各組之間無明顯差異(圖23a和24a)。二次免疫后14天，與生理鹽水組相比，單獨(dú)抗原免疫組小鼠抗體滴度明顯升高(p<0.01)，聯(lián)用牛膝粗多糖abp-50或abp-100組小鼠血清抗體滴度顯著高于單獨(dú)抗原組(p<0.01)，但二者之間佐劑效果相似(圖23b和圖24b)。結(jié)果顯示，abp-50和abp-100對(duì)乙肝抗原有明顯的佐劑活性，但活性低于鋁佐劑。實(shí)施例8：牛膝多糖組分abp-50-a對(duì)h1n1流感疫苗的佐劑活性評(píng)價(jià)按實(shí)施例2制備牛膝多糖組分abp-50-a，研究對(duì)h1n1流感滅活疫苗(病毒裂解液，北京科興生物制品有限公司生產(chǎn))的佐劑活性。h1n1流感疫苗劑量3μg/鼠，以上四個(gè)多糖佐劑的劑量均為0.2mg/鼠，采用肌肉注射免疫小鼠。實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組、單獨(dú)h1n1抗原組、h1n1+abp-50-a組和h1n1+鋁佐劑組。小鼠初次免疫后14天，elisa方法測定h1n1流感抗原特異性抗體滴度。初次免疫后28天進(jìn)行二次免疫，劑量同初次免疫。二次免疫后14天測定h1n1流感抗原特異性抗體滴度。具體測定方法參考實(shí)施例7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：初次免疫后14天，單獨(dú)抗原組及聯(lián)用所有多糖組分組小鼠的特異性抗體滴度均較低，各組之間無明顯差異(圖25a)。二次免疫后14天，與生理鹽水組相比，單獨(dú)h1n1抗原組小鼠血清抗體滴度明顯升高(p<0.01)(圖25b)。結(jié)果顯示，抗原聯(lián)用abp-50-a能更顯著升高抗體滴度(p<0.01)，表明abp-50-a對(duì)h1n1流感疫苗具有顯著佐劑活性。實(shí)施例9：牛膝粗多糖abp-100的三個(gè)多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c對(duì)乙肝抗原佐劑活性評(píng)價(jià)實(shí)施例2制備的牛膝粗多糖abp-100的三個(gè)多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c分別與乙肝蛋白亞單位(hbsag)為抗原聯(lián)用(大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn))免疫小鼠。多糖佐劑按照0.2mg/鼠劑量與乙肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組、單獨(dú)hbsag抗原組、hbsag+abp-100-a組、hbsag+abp-100-b組、hbsag+abp-100-c組和hbsag+鋁佐劑組(0.2mg/鼠)。小鼠初次免疫后14天，elisa方法測定乙肝抗原特異性抗體滴 度。初次免疫后28天進(jìn)行二次免疫，劑量同初次。第二次免疫后14天測定乙肝抗原特異性抗體滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：abp-100的三個(gè)多糖組分分別與乙肝抗原聯(lián)用免疫小鼠初次免疫后14天，各組血清特異性抗體滴度均較低。(圖26a)。經(jīng)過二次免疫后，三個(gè)多糖組分均能提高免疫小鼠血清特異性抗體滴度水平(p<0.05)，但佐劑活性弱于鋁佐劑(圖26b)。實(shí)施例10：均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)乙肝抗原免疫小鼠體液免疫的評(píng)價(jià)實(shí)施例3制備的三個(gè)牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3作為佐劑，以乙肝重組蛋白(hbsag)為抗原(2μg/鼠，大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn))，abp-50和abp-100按照0.2mg/鼠劑量分別與乙肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組、單獨(dú)hbsag抗原組、hbsag+abp-100-c-1組(0.2mg/鼠)、hbsag+abp-100-c-2組(0.2mg/鼠)、hbsag+abp-100-c-3組(0.2mg/鼠)和hbsag+鋁佐劑組(0.2mg/鼠)。配伍肌肉注射免疫小鼠。小鼠初次免疫后14天，elisa方法測定乙肝抗原特異性抗體滴度。初次免疫后28天進(jìn)行二次免疫，劑量同初次。二次免疫后14天測定乙肝抗原特異性抗體滴度。采用elisa測定血清中抗體滴度，具體操作同實(shí)施例7。結(jié)果如圖27a和27b所示。結(jié)果表明：abp-100-c的三個(gè)多糖組分中的abp-100-c-1和abp-100-c-2成分與乙肝抗原聯(lián)用，均能顯著提高乙肝抗原特異性抗體滴度，佐劑活性優(yōu)于鋁佐劑，abp-100-c-3佐劑效果與鋁佐劑相近。實(shí)施例11：牛膝粗多糖abp-50和abp-100對(duì)免疫小鼠細(xì)胞免疫功能的評(píng)價(jià)按實(shí)施例7方法分別將實(shí)施例1制備的牛膝粗多糖abp-50和abp-100與乙肝疫苗抗原聯(lián)用免疫小鼠二次。二次免疫后14天處死小鼠，無菌去脾臟，制備脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×109個(gè)/l。將計(jì)數(shù)后的脾細(xì)胞懸液按每孔100μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，然后各孔再分別加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于含5％co2培養(yǎng)箱中，37℃孵育48h。加入20μlmtt(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4h。棄上清液后，每孔中加入150μldmso酶標(biāo)儀檢測a570nm，測定脾細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1：牛膝多糖abp-50和abp-100對(duì)乙肝免疫小鼠脾細(xì)胞增殖的影響組別od570nmsaline(生理鹽水)0.482±0.058hbsag0.417±0.087＊hbsag+abp-500.484±0.037#hbsag+abp-1000.589±0.045###hbsag+al(oh)30.465±0.021#注：與抗原對(duì)照組比較，#p<0.05，###p<0.01，n＝6.結(jié)果表明：與生理鹽水組相比，單獨(dú)hbsag抗原組小鼠脾臟細(xì)胞增殖能力降低(p<0.05)；與抗原組相比，abp-100能顯著促進(jìn)小鼠脾臟細(xì)胞的增殖(p<0.001)，abp-50也能提高增殖能力，達(dá)到生理鹽水組增殖水平。實(shí)施例12：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)免疫小鼠細(xì)胞免疫功能的評(píng)價(jià)按實(shí)施例10方法將乙肝抗原分別與實(shí)施例3制備的牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2或abp-100-c-3聯(lián)用，免疫小鼠二次后14d，頸椎脫臼處死。無菌條件下取出脾，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞 密度為5×109個(gè)/l。將計(jì)數(shù)后的脾細(xì)胞懸液按每孔100μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，然后各孔再分別加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于含5％co2培養(yǎng)箱中，37℃孵育48h。加入20μlmtt(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4h。棄上清液后，每孔中加入150μldmso酶標(biāo)儀檢測a570nm，測定脾細(xì)胞增殖能力。另取脾細(xì)胞懸液100μl(2×107/ml)，加入100μl混合抗體(含percp-倉鼠抗小鼠cd3e抗體0.25μg，apc-大鼠抗小鼠cd19抗體0.5μg，pe-大鼠抗小鼠cd4抗體0.125μg，fitc-大鼠抗小鼠cd8a抗體0.5μg)，每組設(shè)3個(gè)平行管。另外設(shè)4個(gè)相應(yīng)的單標(biāo)抗體對(duì)照。室溫下避光孵育25min，然后各管加入洗液1.5ml，混勻。4℃離心10min(600×g)，棄上清，再離心和洗滌3次，重懸細(xì)胞，然后加入pbs500μl，搖勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，測定cd3+、cd19+、cd4+和cd8+細(xì)胞的百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、表3以及表4所示。表2：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)乙肝免疫小鼠脾細(xì)胞增殖的影響注：與抗原對(duì)照組比較，##p<0.01，n＝6.表3：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)免疫小鼠脾臟cd3+和cd19+細(xì)胞的影響注：與正常對(duì)照組相比，＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.001；與模型組相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。表4：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對(duì)免疫小鼠脾臟cd4+和cd8+細(xì)胞的影響注：與正常對(duì)照組相比，＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.001；與模型組相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。結(jié)果表明：abp-100-c-2與乙肝抗原聯(lián)用免疫小鼠，能顯著提高脾臟細(xì)胞的增殖活性(見表2)。進(jìn)一步流式細(xì)胞儀分析表明abp-100-c-1能提高受免小鼠脾臟cd3+和cd4+細(xì)胞比例，升高及cd3+/cd19+和cd4+/cd8+的比值，提示abp-100-c-1能促進(jìn)脾臟t細(xì)胞及th細(xì)胞分化；abp-100-c-2減少能提高受免小鼠脾臟cd19+和cd8+細(xì)胞比例，降低cd3+/cd19+和cd4+/cd8+的比值，提示abp-100-c-2能促進(jìn)脾臟b細(xì)胞及ctl細(xì)胞分化(見表3和表4)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的牛膝均一多糖特別是abp-100-c-1和abp-100-c-2能提高免疫小鼠細(xì)胞免疫的能力。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁12