本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種化合物及其在DNA端基修飾中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
隨著DNA技術(shù)的發(fā)展，端基修飾的DNA在分子生物學(xué)、分子檢測(cè)以及生物材料的構(gòu)建等領(lǐng)域扮演著越來(lái)越重要的角色。除了已經(jīng)較為成熟的DNA氨基和巰基方法，人們?cè)诓粩嚅_(kāi)發(fā)新的DNA端基化修飾技術(shù)和端基化修飾試劑，來(lái)滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的科研及商業(yè)需求。上世紀(jì)90年代以來(lái)，人們開(kāi)始關(guān)注以呋喃作為DNA的端基/堿基修飾單元，呋喃可與馬來(lái)酰亞胺在室溫下高效地發(fā)生Diels-Alder環(huán)合反應(yīng)，為DNA的端基化修飾和負(fù)載提供了一種新的選擇；此外，呋喃在特定氧化劑的存在下可被氧化為二醛，在研究DNA雙鏈交聯(lián)中有著重要的應(yīng)用。但是目前在DNA端基中引入呋喃的方法多局限于使用含有呋喃的羧酸與DNA端基的氨基反應(yīng)，操作繁瑣而且成本居高不下；在糖環(huán)或堿基上引入呋喃單元?jiǎng)t需要進(jìn)行大量的有機(jī)合成工作，極大提高了使用成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種新型的呋喃基亞膦酰亞胺酯，可直接應(yīng)用于DNA合成儀，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單高效地在DNA5’端引入呋喃單元的目的。本發(fā)明的技術(shù)方案是：本發(fā)明公開(kāi)式(1)化合物獲其藥物上可接受的鹽，式(1)化合物為：式(1)化合物的制備方法以2-呋喃丙酸為起始原料，首先將其通過(guò)氫化鋁鋰還原為2-呋喃丙醇，并進(jìn)一步將其與2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺反應(yīng)得到2-氰乙基-二異丙基-呋喃丙醇亞磷酰胺酯。按照如下反應(yīng)路線和反應(yīng)條件進(jìn)行：其中，a.氫化鋁鋰，四氫呋喃，80℃；b.2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，三乙胺，0℃。具體的步驟如下：步驟a：將2-呋喃丙酸于加入到含有0.004g/mL氫化鋁鋰的無(wú)水四氫呋喃中的溶液，反應(yīng)液在80℃攪拌下回流1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，向冷卻的反應(yīng)液中滴加飽和氯化銨溶液，待氣泡結(jié)束后滴加飽和碳酸鉀溶液至沉淀完全，濾除不溶物，濾餅用四氫呋喃洗滌，有機(jī)相以無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)相，得到呋喃丙醇；步驟b：將同等質(zhì)量的呋喃丙醇和無(wú)水三乙胺溶于無(wú)水四氫呋喃中，冰浴攪拌下，滴加2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，反應(yīng)于室溫下攪拌2小時(shí)，濾除不溶物，濾液以飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥，得到2-氰乙基-N，N-二異丙基-呋喃丙醇亞磷酰胺酯。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開(kāi)式(1)化合物在DNA端基修飾中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于公開(kāi)一種呋喃基DNA端基修飾試劑，其特征在于，所述修飾試劑的有效成為式(1)化合物獲其藥物上可接受的鹽，式(1)化合物為：本發(fā)明的第四個(gè)目的在于公開(kāi)上述呋喃基DNA端基修飾試劑的應(yīng)用的方法，其特征在于，步驟1：將式(1)化合物溶于無(wú)水乙腈中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下轉(zhuǎn)移至DNA合成儀的端基修飾位試劑瓶中，輸入DNA序列，執(zhí)行合成。步驟2：合成完畢后將固相載體取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密閉加熱2小時(shí)，離心去除不溶物，溶液濃縮即得到新合成的DNA序列。本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的化合物(1)可以通過(guò)簡(jiǎn)單的有機(jī)單元反應(yīng)制備得到，合成步驟中沒(méi)有副反應(yīng)出現(xiàn)；并且可以直接用于DNA合成儀上，極大簡(jiǎn)化了修飾步驟；操作簡(jiǎn)便，成本低廉，具有較好的底物適應(yīng)性。2、本發(fā)明所述的DNA端基修飾試劑具有較高的反應(yīng)活性和良好的底物適應(yīng)性，是一類(lèi)很有市場(chǎng)前景的核酸端基修飾試劑。附圖說(shuō)明附圖1為式(1)化合物的核磁共振氫譜；附圖2為式(1)化合物的核磁共振碳譜；附圖3為式(1)化合物的質(zhì)譜圖；附圖4為未修飾的DNA質(zhì)譜圖；附圖5為5’端修飾有呋喃基團(tuán)的DNA質(zhì)譜；附圖6為未修飾DNA的HPLC譜圖；附圖7為5’端修飾有呋喃基團(tuán)的HPLC譜圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明的具體實(shí)施方式如下：1、式(1)化合物合成：a.氫化鋁鋰，四氫呋喃，80℃；b.2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，三乙胺，0℃。步驟a：0.8克氫化鋁鋰溶于200毫升無(wú)水四氫呋喃中，冰浴攪拌下一次性加入2.8克2-呋喃丙酸于20毫升無(wú)水四氫呋喃中的溶液，反應(yīng)液在80℃攪拌下回流1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，向冷卻的反應(yīng)液中滴加4毫升飽和氯化銨溶液，待氣泡結(jié)束后滴加飽和碳酸鉀溶液至沉淀完全，濾除不溶物，濾餅用50毫升四氫呋喃洗滌，有機(jī)相以無(wú)水硫酸鈉干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)相，得到2.4克呋喃丙醇(淡黃色油狀液體)，收率94％；步驟b：1.2克呋喃丙醇和1.2克無(wú)水三乙胺溶于50毫升無(wú)水四氫呋喃中，冰浴攪拌下滴加2.4克2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺。反應(yīng)于室溫下攪拌2小時(shí)，濾除不溶物，濾液以飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥。得到2.0克2-氰乙基-N,N-二異丙基-呋喃丙醇亞磷酰胺酯(式1化合物)(黃色粘稠液體)，收率66％。本發(fā)明的對(duì)得到的化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1-3，核磁共振氫譜，碳譜及質(zhì)譜圖。1H-NMR(CDCl3),400MHz:7.30(s,1H,ArH),6.27(s,1H,ArH),6.00(d,1H,ArH),3.84-3.86(m,2H,CH2OP),3.84-3.86(m,4H,CH2O+CHN),3.64-3.67(t,J＝4.0Hz,2H,CH2O),2.70-2.74(t,J＝8.0Hz,2H,ArCH2),2.60-2.63(t,J＝8.0Hz,2H,CH2CN),1.95-1.97(t,J＝4.0Hz,2H,CH2),1.17-1.26(m,12H,CH3)13C-NMR(CDCl3),100MHz:155.47,140.97,111.62,110.12,105.19,62.63,62.28,58.40,58.21,43.09,42.96,29.63,24.58,20.24.ESI-MS:ChemicalFormula:C16H27N2O3P,calc326.1759,detec326.1920(M+H+),345.20(M+H++NH4+)綜合以上分析，最終將式1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定為2-氰乙基-N,N-二異丙基-呋喃丙醇亞磷酰胺酯，結(jié)構(gòu)如式(1)所示，為一個(gè)新的含有呋喃基團(tuán)亞膦酰亞胺酯。ChemicalFormula:C16H27N2O3PExactMass:326.1759MolecularWeight:326.37092、式(1)化合物在DNA端基修飾中的應(yīng)用步驟1：540毫克式(1)化合物溶于10毫升無(wú)水乙腈中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下轉(zhuǎn)移至ABI3400DNA合成儀的端基修飾位試劑瓶中。輸入DNA序列：5’CCTAGATTCAGTTCAACTTG3’，執(zhí)行1μmol量級(jí)的合成。步驟2：合成完畢后將固相載體取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密閉加熱2小時(shí)，離心去除不溶物，溶液濃縮即得到粗產(chǎn)物。目標(biāo)產(chǎn)物通過(guò)高效液相分離，并通過(guò)ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息表征。表1.式(1)化合物在DNA端基修飾中的應(yīng)用樣品計(jì)算分子量(g/mole)實(shí)測(cè)分子量(g/mole)DNA質(zhì)譜圖DNA60676065附圖4Furan-Modified-DNA62546253附圖5所有有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)和純度均由核磁共振氫譜來(lái)確定，DNA的結(jié)構(gòu)信息由電噴霧解離質(zhì)譜來(lái)確定，反應(yīng)效率由高效液相色譜來(lái)確定。核磁型號(hào)為BrukerAMX400Spectrometer(500MHz)，質(zhì)譜型號(hào)為Agilent6510Q-TOF，高效液相色譜型號(hào)為Waters2695，檢測(cè)柱型號(hào)為XBriageOligonucleotidesBEHC18(2.1mm×50mm；Column2.5um)，淋洗條件如下：如圖6所示，未修飾DNA的HPLC譜圖，出峰時(shí)間為10.317分鐘；如圖7所示，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的式(1)化合物修飾后的DNA的HPLC譜圖，出峰時(shí)間為14.245分鐘。綜上可知，式(1)化合物應(yīng)用于DNA的5’端修飾中，取得了良好的效果。實(shí)驗(yàn)表明該DNA端基修飾試劑具有較高的反應(yīng)活性和良好的底物適應(yīng)性，是一類(lèi)很有市場(chǎng)前景的核酸端基修飾試劑。