一個受溫度調(diào)控水稻葉色基因及其檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和植物生物技術(shù)等領(lǐng)域，尤其是在分子水平進行水稻遺傳育種以及生理、基因功能等基礎(chǔ)研究。
技術(shù)背景
[0002]葉片是植物進行光合作用的主要器官，類型豐富且易于鑒別，所以葉色是辨別植物突變最直觀的標(biāo)準之一。在實際應(yīng)用中，葉色不僅可用于觀賞植物新特品種的選育，還可以作為很多農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米等的最理想的形態(tài)學(xué)標(biāo)記，還可用于植物的遺傳、生理及其相關(guān)基因的克隆和功能研究。目前，研究工作者們利用物理、化學(xué)、生物等技術(shù)已創(chuàng)制大量水稻葉色突變體，根據(jù)它們是否受溫度調(diào)控，又分為高溫表達型、低溫表達型和溫度鈍感型等的葉色突變體。本研究利用6t3Co γ射線誘變處理創(chuàng)制的受低溫度調(diào)控水稻葉色的突變株，并通過圖位克隆技術(shù)定位到一個受溫度調(diào)控水稻葉色新基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一個受溫度調(diào)控水稻葉色的基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)及這種基因的檢測方法和應(yīng)用。
[0004]受溫度調(diào)控葉色變化的水稻來源于經(jīng)6t3Coγ射線處理的粳稻嘉花I號的誘變產(chǎn)生的群體后代，經(jīng)多次自交繁殖和選擇，該水稻性狀和各種農(nóng)藝性狀均已穩(wěn)定。以該水稻材料與秈稻9311雜交的F2代分離群體作為定位群體，利用DNA分子標(biāo)記將受溫度調(diào)控水稻葉色的基因定位在水稻第I號染色體上。
[0005]攜帶該受溫度調(diào)控葉色的基因水稻植株在27.5°C以下生長的條件下表現(xiàn)出苗色黃化。該基因，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。所述的基因編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
[0006]—對用于檢測上述基因的特異性dCAPs引物，序列為:
上游:5 ’ -CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3 ’
下游:5 ’ -CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3，
即SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.4
檢測該受溫度調(diào)控水稻葉色基因的方法為，采用上述特異性(SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4)對水稻提取DNA進行擴增，得到208bp核苷酸序列。SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6的序列分為野生型水稻(嘉花I號)和攜帶受溫度調(diào)控葉色基因水稻的所示。由攜帶受溫度調(diào)控葉色基因的水稻DNA擴增得到的208bp片段不含Ec0RII酶的內(nèi)切位點，不被Ec0RII切斷，而由野生型水稻擴增所得到的208bp片段能切成30bp和178bp的兩個特異性片段。
[0007]在本發(fā)明中，發(fā)明人設(shè)計了在受溫度調(diào)控葉色該基因片段與野生型嘉花I號相差一個堿基的特異性dCAPs引物，引入的錯配堿基可以引入的限制性酶切位點，從而可以在此208bp核苷酸序列中Ec0RII酶切野生型(嘉花I號)水稻，但不切斷攜帶受溫度調(diào)控葉色基因的水稻，根據(jù)酶切帶型能快速檢測到含有此基因的水稻品種，其檢測精確度高，操作方便， 成本低廉。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明野生型水稻(左)與具有受溫度調(diào)控葉色的基因水稻(右)在27.5°C苗期表型；
圖2為本發(fā)明對PCR的dCAPs引物擴增產(chǎn)物進行EcoRII酶切檢查結(jié)果。
【具體實施方式】
[0009]實施例1水稻DNA提取
1.取新鮮的苗期水稻葉片，將葉片剪成0.5cm長的小段，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮將其研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入2ml離心管中加入lml60°C預(yù)熱的2乂0^8(破壞細胞膜)，輕輕震蕩后60 0C水浴45min，期間多次震蕩。
[0010]2.取出離心管，冷卻至室溫，12000r/min 20°C條件下離心5min，吸取600μ1上清液，并加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)混合液，充分混勻。
[0011]3.將含有溶液的離心管進行平衡，12000r/min 20°C離心5min，吸取600μ1上清液，加入其2/3體積(400μ1)異丙醇，輕輕混勻使核酸析出。
[0012]4.12000r/min 20°C離心3min,使核酸沉淀，棄上清。
[0013]5.加入70%乙醇洗滌，12000r/min20°C離心5min，棄上清。
[0014]6.重復(fù)步驟5。
[0015]7.室溫干燥后溶于10μ1的無菌水中。
[0016]8.取2μ1用于后續(xù)的PCR擴增反應(yīng)。
[0017]實施例2
(一)獲得受溫度調(diào)控水稻葉色的基因及其氨基酸序列
1.25μ1 PCR反應(yīng)體系如下:10MmTris-HCl pH9.0; 10mM KCl; 20mM MgSO4;80mM(NH4)SO4; 2.5Mm Dntp; ΙΟμΜ引物，5U/yl Taq酶，Ιμ?模板DNA。
[0018]引物序列為:
上游:5 ’ -CACCGCCTGCCCACCGACGACGATG-3 ’
下游:5 ’ -GAAGATGCCATTTCAGTCAC-3 ’
PCR擴增反應(yīng)反應(yīng)條件:
PCR擴增產(chǎn)物長度為3446bp,用B1xm軟件與http: //rice.plantb1logy.msu.edu/網(wǎng)頁下載得到的基因序列與測序結(jié)果比對，舍去其它片段結(jié)果如SEQ ID N0.1。
[0019]參照KOME網(wǎng)站上獲得的ORF序列，設(shè)計特異性RT-PCI^I物，上游端和下游端分別為:
5，-ATGGAGCTTCGACATAAAACGGGGA-3，
5’- AGTTCAATTCTCCAACATCACTTCC-3’
對所提取的正常植株總cDNA進行擴增，其目的片段長度為1146bp，并進行測序。將測序得到的DNA序列即0RF，利用B1xm軟件翻譯成381個氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0020](二)檢測受溫度調(diào)控水稻葉色的基因1.25μ1 PCR 反應(yīng)體系如下:10MmTris-HCl pH9.0; 10mM KCl; 20mM MgSO4 ;80mM(NH4)SO4; 2.5Mm Dntp; ΙΟμΜ引物，5U/yl Taq酶，Ιμ?模板DNA。
[0021]特異性PCR引物序列如下:
上游:5 ’ -CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3 ’
下游:5 ’ -CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3，
2.PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件:
得到的擴增產(chǎn)物，經(jīng)溴酚藍染色，上樣于經(jīng)溴化乙錠染色的2%的瓊脂糖凝膠上并電泳，在UVP凝膠成像儀上成像，結(jié)果如圖2所示，出現(xiàn)208bp條帶，序列如SEQ ID N0.3所示，是SEQID N0.1中的一段。
[0022]3.酶切反應(yīng)體系
34μ1 無菌水，5μ1 10XEcoRIIBuffer，1μ1 lOU/μΙ EcoRII^PlOyl PCR擴增產(chǎn)物。
[0023]4.酶切處理
將酶切反應(yīng)體系混勻后，放入37 V恒溫水浴中，溫水浴2小時，每管加入Iy I 1XLoading buffer終止酶切反應(yīng)，將擴增產(chǎn)物，經(jīng)溴酸藍染色，上樣于經(jīng)溴化乙錠染色的5%瓊脂糖凝膠上并電泳，在UVP凝膠成像儀上成像。結(jié)果如圖2所示。其酶切帶型為出現(xiàn)兩個特異性片段，長度為30bp和178bp，由于30bp帶較小，已經(jīng)跑出凝膠。
[0024]實施例4功能基因驗證
受溫度調(diào)控葉色的水稻來源于經(jīng)6t3Co γ射線處理的粳稻嘉花I號的誘變產(chǎn)生的群體后代，經(jīng)多次自交繁殖和選擇，該突變性狀和各種農(nóng)藝性狀均已穩(wěn)定。該突變株低于27.5°C突變體葉片呈黃色，當(dāng)溫度高于27.5°C時，突變體表現(xiàn)為正常綠色，具有明顯的溫度調(diào)控。
[0025]經(jīng)過6t3Coy射線處理后，測序結(jié)果表明該基因發(fā)生了堿基的替換如SEQID N0.1的堿基序列所示(第2157個堿基)。
[0026]將含有水稻自身啟動子SEQID N0.7的核苷酸序列農(nóng)桿菌表達載體PCambial301S上，并經(jīng)過酶切、測序驗證為該目的基因序列。
[0027]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)，將上述重組載體轉(zhuǎn)化受體，受體是含有溫度調(diào)控葉色基因水稻的愈傷組織，通過鑒定獲得陽性第一代轉(zhuǎn)基因株，其葉色在27.5°C以下呈綠色。
[0028]將第一代轉(zhuǎn)基因植株的種子在低溫下播種，其苗期葉色出現(xiàn)分離，具有綠色和黃化的表現(xiàn)，并符合孟德爾遺傳分離定律即3:1。
[0029]攜帶溫度調(diào)控葉色基因水稻在高于27.5°C葉色表現(xiàn)為綠色，而低于27.5°C時，植株苗期葉色呈黃化表型，因此可通過此表型變化來鑒別水稻品種真?zhèn)?，提高雜交水稻種子純度。
【主權(quán)項】
1.一個受溫度調(diào)控水稻葉色基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個受溫度調(diào)控水稻葉色基因，其特征在于所述的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示的381個氨基酸序列。3.—種用于檢測權(quán)利要求1所述的受溫度調(diào)控水稻葉色基因的特異性dCAPs PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列為: 上游:5’-CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3'(SEQ ID N0.3) 下游:5 ’ -CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3 '(SEQ ID N0.4)。4.一種用于檢測權(quán)利要求1所述的受溫度調(diào)控水稻葉色基因的方法，其特征在于，用權(quán)利要求所述的特異性dCAPs PCR引物對野生型水稻和攜帶受溫度調(diào)控葉色基因水稻苗期所提取的DNA進行PCR擴增反應(yīng)，得到208bp核苷酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的受溫度調(diào)控水稻葉色基因的檢測方法，其特征在于所述的野生型水稻208bp核苷序列如SEQ ID N0.5所示，所述的攜帶受溫度調(diào)控葉色基因水稻208bp核苷序列如SEQ ID N0.6所示。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的受溫度調(diào)控水稻葉色基因的檢測方法，鑒別是否含有溫度調(diào)控基因的步驟為，將野生型水稻如嘉花I號的DNA擴增所得到的208bp片段用Ec0RII酶切出現(xiàn)30bp和178bp的特異性片段，而由攜帶受溫度調(diào)控葉色基因水稻植株DNA擴增得到的208bp片段用EcoRH酶切后仍是208bp，說明含有溫度調(diào)控水稻葉色基因。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一個受溫度調(diào)控水稻葉色的基因及其檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開了一個受溫度調(diào)控水稻葉色的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。利用設(shè)計一對SEQ ID No.3和SEQ ID No.4特異性PCR引物，對水稻中所提取的DNA進行PCR擴增后，經(jīng)EcoRII酶切后再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，即可快速有效的檢測到含有該基因的水稻植株，具有檢測精確度高，操作方便，成本低廉等特點。攜帶該基因的水稻植株在低溫下表現(xiàn)黃化苗。本發(fā)明得到的受溫度調(diào)控水稻葉色基因可應(yīng)用到雜交水稻制種，可提高雜交水稻不育系本身及其它配制雜交水稻的純度。
【IPC分類】C12Q1/68, C07K14/415, C12N15/11, C12N15/29
【公開號】CN105713910
【申請?zhí)枴緾N201610110381
【發(fā)明人】趙懷玉, 江泉, 陳佳穎, 林琛, 林冬芝, 董彥君
【申請人】上海師范大學(xué)