本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領域。具體涉及乙酰化酶基因osgcn5在調(diào)控水稻抗旱和根的發(fā)育中的應用。乙酰轉(zhuǎn)移酶基因osgcn5屬于水稻gnat亞家族蛋白基因，申請人通過體外酶活的方法鑒定了該基因的酶活特性，利用轉(zhuǎn)基因的方法對該基因在水稻抗旱中的功能(包括對水稻抗旱反應的調(diào)節(jié)和與干旱相關(guān)的根發(fā)育調(diào)控)進行了分析，并提出其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上潛在的應用價值。

背景技術(shù)：

表觀遺傳學是上世紀末逐漸興起的一門學科，是研究與經(jīng)典的孟德爾遺傳學法則不相符合的生命現(xiàn)象中逐漸發(fā)展起來的。表觀遺傳學是指不依賴于dna改變的可遺傳的變異(bonasioetal.,selectiverecognitionofmethylatedlysine9onhistoneh3bythehplchromodomain.nature,2001,410:120-124)。它的物質(zhì)基礎是dna纏繞著核小體八聚體形成的染色體空間結(jié)構(gòu)，核小體八聚體分別為兩個拷貝的組蛋白h3、h4、h2a和h2b組成，其中h3和h4蛋白的n端賴氨酸殘基上可以進行多種甲基化和乙?；刃揎?bhaumiketal.,covalentmodificationsofhistonesduringdevelopmentanddiseasepathogenesis,2007.natstructmolbiol,14(11):1008-1016)，賴氨酸乙?；揎椏梢运沙诤诵◇w對dna的纏繞作用，進而有利于促進轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄(zupkovitzetal.,negativeandpositiveregulationofgeneexpressionbymousehistonedeacetylase1.molcellbiol,2006,26(21):7913-7928.verdoneetal.,roleofhistoneacetylationinthecontrolofgeneexpression.biochemcellbiol,2005,83(3):344-353)。迄今為止，各種各樣帶有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中包括gcn5、p/caf、esa1、cbp/p300和rtt109。其中g(shù)cn5蛋白屬于gnat亞家族(gcn5相關(guān)的n端乙酰轉(zhuǎn)移酶亞家族)，是一類廣譜的乙?；?，可以乙?；痟3k9、h3k14、h3k27等多個位點(patricketal.,expandedlysineacetylationspecificityofgcn5innativecomplexes.thejournalofbiologicalchemistry,1999,274:5895-5900)。在后續(xù)的研究過程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；覆粌H可以修飾組蛋白也可以修飾非組蛋白，例如酵母中發(fā)現(xiàn)gcn5可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ifh1的乙?；竭M而調(diào)控其對基因表達的調(diào)控(downeyetal.,gcn5andsirtuinsregulateacetylationoftheribosomalproteintranscriptionfactorifh1.currentbiology,2013,23:1638-1648)。這說明gcn5具有除組蛋白外的更廣泛的乙?；钚怨δ?。除此之外，gcn5還參與了轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成，其乙?；饔每梢运沙谵D(zhuǎn)錄起始位點dna和核小體的纏繞作用，使rnapolⅱ復合物(rna聚合酶復合物)更容易結(jié)合在dna上從而促進轉(zhuǎn)錄(featherstone,coactivatorsintranscriptioninitiation:hereareyourorders.curropingenetdev.2002,12(2):149-155)。目前為止，人們對于擬南芥中g(shù)cn5基因的生物學功能已經(jīng)進行了廣泛地研究。gcn5突變體植株地下地上部分的生長均變?nèi)?，花器官發(fā)育異常(vlachonasiosetal.,disruptionmutationsofada2bandgcn5transcriptionaladaptorgenesdramaticallyaffectarabidopsisgrowth,development,andgeneexpression.plantcell,2003,15:626-638)。同年bertrandetal.(bertrandetal.,arabidopsishistoneacetyltransferaseatgcn5regulatesthefloralmeristemactivitythroughthewuschel/agamouspathway.thejounalofbiologicalchemistry,2003,278:28246-28251)的研究結(jié)果進一步表明atgcn5可以通過wuschel/agamous途徑調(diào)控花器官的發(fā)育。atgcn5通過plt途徑調(diào)控擬南芥根干細胞的多少，從而影響根發(fā)育(kornetetal.,membersofthegcn5histoneacetyltransferasecomplexregulateplethora-mediatedrootstemcellnichemaintenanceandtransitamplifyingcellproliferationinarabidopsis.plantcell,2009,21(4):1070-1079)。atgcn5還可以和開花途徑中的hd1、taf1/haf2相互作用影響擬南芥光應答基因的表達(benhamedetal.,arabidopsisgcn5,hd1,andtaf1/haf2interacttoregulatehistoneacetylationrequiredforlight-responsivegeneexpression.plantcell,2006,18:2893-2903)。所有這些結(jié)果都表明gcn5參與了擬南芥各個發(fā)育時期和環(huán)境的應答反應過程中，具有非常廣泛的生物學功能。

水稻(oryzasatival.)作為人類主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量不僅與生長發(fā)育相關(guān)而且與在發(fā)育過程中應對各種逆境的能力相關(guān)。逆境分為生物逆境和非生物逆境，其中非生物逆境包括如干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等。其中干旱是威脅水稻產(chǎn)量的主要因素之一。在長期的進化過程中水稻進化出了一套自己的干旱應答反應機制，其中包括由信號分子介導的干旱信號傳導、逆境相關(guān)基因的激活和各種功能蛋白合成等。其中已經(jīng)鑒定到的參加干旱反應的蛋白主要包括：分子伴侶、滲透壓調(diào)節(jié)蛋白(tamuraetal.,osmoticstresstoleranceoftransgenictobaccoexpressingageneencodingamembrane-locatedreceptor-likeproteinfromtobaccoplants.plantphysiol,2003,131:454-462)、離子通道(wardetal.,calcium-activatedk+channelsandcalcium-inducedcalciumreleasebyslowvacuolarionchannelsinguardcellvacuolesimplicatedinthecontrolofstomatalclosure.plantcell,1994,6:669-683)、轉(zhuǎn)運蛋白(kleinetal.,disruptionofatmrp4,aguardcellplasmamembraneabcc-typeabctransporter,leadstoderegulationofstomatalopeningandincreaseddroughtsusceptibility.plantjournal,2004,39:219-236)和抗氧化或細胞解毒蛋白(bartelsetal.,targetingdetoxificationpathways:anefficientapproachtoobtainplantswithmultiplestresstolerance.trendsplantsci,2001,6:284-286)。在水稻遭受逆境脅迫時細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)而對細胞機能造成負面影響，ros清除蛋白在這個過程中發(fā)揮了重要作用，其中過氧化物酶(prx)和谷胱甘肽s基轉(zhuǎn)移酶(gstu)是參與這個過程的重要酶類(rezaeietal.,glutathiones-transferase(gst)familyinbarley:identificationofmembers,enzymeactivity,andgeneexpressionpattern.jplantphysiol,2013,170(14):1277-1284.shankeretal.,droughtstressresponsesincrops.functintegrgenomics,2014,14(1):11-22)。而這些下游基因的應答反應絕大部分是受到特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。其中bzip是一類由基本氨基酸構(gòu)成核心區(qū)域毗鄰一個亮氨酸拉鏈的而構(gòu)成的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，它通過識別aba應答原件參與到了aba介導的基因表達調(diào)控過程中。據(jù)報道，水稻中osbzip46參與了水稻的抗旱反應，超表達該基因水稻表現(xiàn)出干旱敏感的表型(tangetal.,constitutiveactivationoftranscriptionfactorosbzip46improvesdroughttoleranceinrice.plantphysiology,2012,158:1755-1768)。同時osbzip23同時參與了水稻的抗鹽和抗旱反應(xiangetal.,characterizationofosbzip23asakeyplayerofthebasicleucinezippertranscriptionfactorfamilyforconferringabscisicacidsensitivityandsalinityanddroughttoleranceinrice.plantphysiology,2008,148:1938-1952)。abi是另外一類受aba誘導并參與逆境應答的轉(zhuǎn)錄因子家族。

表觀修飾作為一種新型的基因調(diào)控機制，也參與到了逆境應答反應當中，擬南芥已經(jīng)報道多種與表觀相關(guān)的酶參與植物的逆境反應。ros1作為一種全新的dna去甲基化酶是在刷選調(diào)控激活rd29a啟動子(一個擬南芥逆境應答基因的啟動子)的實驗中被刷選出來的，即ros1可以去除rd29a基因啟動子上面的dna甲基化進而促進下游該基因的表達，ros1突變體表現(xiàn)出對雙氧水的敏感效應(gongetal.,ros1,arepressoroftranscriptionalgenesilencinginarabidopsis,encodesadnaglycosylase/lyase.cell,2002,111(6):803-814)。hda9作為一個組蛋白去乙?；竻⑴c了擬南芥鹽脅迫和旱脅迫中基因沉默效應(zhengetal.,histonedeacetylasehda9negativelyregulatessaltanddroughtstressresponsivenessinarabidopsis.jexpbot,2016)。擬南芥中的gcn5復合物和冷誘導轉(zhuǎn)錄因子cbf1互作，同時根據(jù)vlachonasiosetal.(vlachonasiosetal.,disruptionmutationsofada2bandgcn5transcriptionaladaptorgenesdramaticallyaffectarabidopsisgrowth,development,andgeneexpression.plantcell,2003,15:626-638)的研究表明gcn5和ada2b的突變體中cor基因在冷誘導過程中上調(diào)表達相較于野生型要慢。這些結(jié)果說明了gcn5可能直接參與調(diào)控了冷應答基因的表達。

作為糧食作物和對干旱特別敏感的水稻中，表觀修飾特別是乙?；揎検侨绾螀⑴c到干旱響應過程中的目前報道還很少。我們利用水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)篩選到了與擬南芥atgcn5同源的基因，命名為osgcn5，并利用該數(shù)據(jù)庫中提供的信息在水稻的cdna中擴增到了該基因的全長序列。構(gòu)建酵母表達載體表達了該基因的全長蛋白，體外酶活顯示該蛋白是一個廣譜的乙?；富?，利用轉(zhuǎn)基因的方法我們獲得了該基因的抑制表達材料，并發(fā)現(xiàn)該基因抑制表達后降低了水稻的抗旱能力，失水率相較于野生型有所提高。rt-pcr的結(jié)果顯示該基因的下降會影響部分逆境應答基因的表達，同時對抑制表達材料的形態(tài)學進一步觀察后發(fā)現(xiàn)其冠根的數(shù)目顯著下降。以上結(jié)果表明osgcn5可以同時通過調(diào)控逆境響應基因的表達和水稻根的發(fā)育來影響水稻的抗旱反應。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種乙酰化酶基因osgcn5在調(diào)控水稻抗旱和根發(fā)育中的應用，即鑒定一個參與水稻抗旱反應和根(例如冠根)發(fā)育的廣譜乙?；富騩sgcn5并分析了其在水稻生產(chǎn)上的應用價值。osgcn5基因是一個廣譜乙?；富?，在各個組織中均有表達，抑制該基因的表達后植株表現(xiàn)出對干旱敏感和冠根(crownroot，cr)數(shù)目變少的表型；分子生物學的結(jié)果表明該基因參與調(diào)控了部分抗旱基因的表達。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

從水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)篩選與擬南芥atgcn5同源的水稻基因(利用蛋白質(zhì)序列同源比對)，我們將該個基因命名為osgcn5，其核苷酸序列為seqidno：1所示，序列長度為1536bp；其中序列的1-1536位也是其編碼區(qū)(即cds)，共編碼511個氨基酸，其蛋白質(zhì)序列如seqidno：2所示。

擴增了該蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域(乙?；δ芙Y(jié)構(gòu)域和bromodomain結(jié)構(gòu)域)之間的一段非保守的區(qū)域，連接到抑制特異基因表達的載體pds1301(圖1)上，然后轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11，得到轉(zhuǎn)基因水稻抑制材料，提取轉(zhuǎn)基因家系mrna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna后檢測osgcn5在各個家系中的表達量，發(fā)現(xiàn)7個轉(zhuǎn)基因家系中osgcn5的表達量被明顯抑制了(圖2)。利用水稻葉片cdna擴增獲得osgcn5的全長cdna，并將其克隆到pgex6p-1的載體上(圖3)，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋白原核表達菌株，用iptg誘導表達osgcn5-gst的融合蛋白。并利用gstbeads純化，獲得純化后的gst蛋白和osgcn5-gst的融合蛋白(圖3)。利用體外酶活體系將osgcn5-gst融合蛋白和組蛋白h3或h4進行孵育反應，并利用westernblot技術(shù)用各種乙?；贵w進行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)osgcn5可以直接乙酰化h3的k9、k27、k4、k14和h4的k5等位點(圖4)，進一步證明了osgcn5是一個廣譜乙?；?。同時用水稻不同時期組織材料的rna進行反轉(zhuǎn)錄，通過qrt-pcr的方法檢測osgcn5基因表達的組織特異性，結(jié)果表明osgcn5在各個組織中均有表達(圖5)。將獲得的osgcn5rnai家系和對照野生型中花11進行小紅桶干旱處理(植株生長到一個月時狀態(tài)一致時處理)，發(fā)現(xiàn)osgcn5rnai家系表現(xiàn)出干旱敏感的表型(圖6a)，通過失水率實驗發(fā)現(xiàn)osgcn5rnai家系失水速率更快(圖6b)。同時取干旱處理7天的葉片，抽提mrna并進行反轉(zhuǎn)錄，利用qrt-pcr的方法檢測逆境應答相關(guān)基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分逆境應答基因在osgcn5rnai家系中表達量明顯地下降了(圖7)。研究表明根在植物抗旱反應起到了非常重要的作用(janiaketal.,geneexpressionregulationinrootsunderdrought.2015,jexpbot,67(4):1003-1014)，于是我們對osgcn5rnai各家系和野生型中花11材料中根的表型進行了進一步觀察統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)osgcn5表達量被抑制后，轉(zhuǎn)基因植株冠根的數(shù)目和根長均顯著地減少(圖8)。以上結(jié)果說明osgcn5基因可能同時通過影響水稻根的數(shù)目和逆境相關(guān)基因的表達來參與水稻的抗旱反應。

可以歸納的本發(fā)明的發(fā)明要點如下：

1、廣譜乙?；富騩sgcn5在調(diào)控水稻抗旱反應中的應用，該基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

2、osgcn5基因的應用方式為：其編碼的蛋白質(zhì)中的乙?；该富钔ㄟ^正調(diào)控下游基因的表達，在水稻葉片抗旱逆境響應過程中正向調(diào)控了部分逆境應答基因的表達，進而促進水稻的抗旱反應。

3、廣譜乙酰化酶基因osgcn5在調(diào)控水稻根發(fā)育過程中的應用，該基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)為一個廣譜乙?；?，通過正向調(diào)控水稻根的發(fā)育。

4、所述的正向調(diào)控水稻根的發(fā)育包括水稻冠根數(shù)目和根長度調(diào)控的應用。

本發(fā)明的具體操作步驟如下：

(1)通過在ricegenome網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)查找與擬南芥atgcn5基因同源的水稻的osgcn5基因(loc_os10g28040)。根據(jù)網(wǎng)站公布的序列設計相關(guān)載體的引物，以水稻葉片cdna為模板，擴增其全長cdna序列(翻譯起始位點至下游1536個堿基)，測序發(fā)現(xiàn)我們擴增到的cdna序列與上述網(wǎng)站公布cdna序列完全一致，如seqidno:1所示。擴增所用引物序列如下：

osgcn5-f:5’-ggggtaccatggacgggctcgcggcgcc-3’,

osgcn5-r:5’-cgggatcctcagttcttcgttgaggcttgggc-3’

(2)根據(jù)osgcn5基因序列信息，利用smart網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其蛋白質(zhì)序列(seqidno:2)，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列存在兩個保守的結(jié)構(gòu)域，分別為乙酰化功能結(jié)構(gòu)域(211位氨基酸到287位氨基酸)和bromodomain結(jié)構(gòu)域(396位氨基酸到505位氨基酸)，在兩個保守結(jié)構(gòu)域中間的序列是該基因的特異序列，據(jù)此我們設計雙鏈抑制引物(dsrnai引物)，并利用步驟1)中的全長cdna為模板，通過pcr擴增得到雙鏈抑制區(qū)段特異的dna，擴增序列如seqidno:3所示，擴增所用的引物序列如下：

osgcn5-rnai-f:5’-gggactagtggtaccggacaaagaaagatggcaagg-3’，

osgcn5-rnai-r:5’-ggggagctcggatccgttgcctgtaagtactgtaatcagg-3’

(3)將步驟2)中擴增得到的片段用限制性內(nèi)切酶酶切并連接載體的方法將雙鏈抑制區(qū)段dna構(gòu)建到載體pds1301上，獲得轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301。利用農(nóng)桿菌(eha105)介導的轉(zhuǎn)基因方法(hieiet.al.,1994.efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantjournal.6:271-282)將所述的轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301導入水稻受體品種中花11，獲得轉(zhuǎn)化植株osgcn5-rnai(將轉(zhuǎn)化植株依次命名為osgcn5-rnai-n，n＝0，1，2，3……)。

(4)抽提轉(zhuǎn)基因各個家系的基因組dna并利用pcr方法檢測陽性植株；然后抽提陽性植株的mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr的方法檢測各個家系中osgcn5基因的表達量，獲得osgcn5被抑制表達的轉(zhuǎn)基因植株。

(5)以步驟(1)中涉及的osgcn5基因的全長cdna為模板擴增osgcn5的全長dna并構(gòu)建到pgex-6p載體上(gehealthcarelifescience)，獲得osgcn5-pgex-6p載體，電轉(zhuǎn)化表達菌株bl21并表達osgcn5-gst融合蛋白。利用gstbeads(glutathionesepharose4fastflow,gehealthcare,17-5132-01)純化回收表達的蛋白質(zhì)(包括gst蛋白和osgcn5-gst融合蛋白)，sds-page蛋白膠跑膠檢測。構(gòu)建該載體所用的擴增引物序列如下：

osgcn5-6p-f:5’-ggatccatggacgggctcgcggc-3’，

osgcn5-6p-r:5’-gtcgacctcagttcttcgttgaggcttgg-3’

(6)利用步驟(5)中純化回收的osgcn5-gst融合蛋白和組蛋白h3或h4進行孵育反應(gst蛋白為對照)，利用westernblot技術(shù)檢測反應后的組蛋白上的各種乙?；揎?。

(7)抽提水稻各個組織部位的rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr檢測osgcn5在各個組織中的表達量。

(8)將osgcn5各抑制家系和野生型對照中花11種植在小紅桶中，生長到一個月時進行干旱處理，并觀察表型。干旱處理7天后，取osgcn5抑制家系和野生型的葉片，抽提mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr檢測逆境應答相關(guān)基因在兩種材料中的表達量。

(9)在含有生根培養(yǎng)基的方皿上發(fā)芽osgcn5各抑制家系和野生型對照中花11，觀察其根部表型并進行統(tǒng)計分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

水稻是人類的主要糧食作物之一，對保障糧食安全起到了非常重要的作用。如何提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)是一項重要的科學問題。然而相對缺乏的淡水資源往往嚴重影響了水稻的產(chǎn)量，隨著我國人口持續(xù)增長，水資源緊缺將成為現(xiàn)階段糧食安全的瓶頸。而解決這一問題的一個重要途徑就是改良水稻的抗旱性(都浩，水稻中激素和肌醇磷酸代謝相關(guān)基因的抗逆功能研究，2013，華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文)。水稻在抗旱方面的機制研究已經(jīng)比較多，但乙?；附閷У慕M蛋白乙酰化是如何參與水稻的抗旱反應的還不是很清楚。本發(fā)明中所涉及到的廣譜乙酰化酶基因osgcn5，發(fā)現(xiàn)其在水稻的逆境應答中起到了非常重要的作用。本發(fā)明通過體外酶活實驗證明osgcn5是一個廣譜乙?；?圖3、圖4)。遺傳轉(zhuǎn)化該基因雙鏈抑制rnai載體，獲得相應的轉(zhuǎn)基因植株。干旱逆境處理發(fā)現(xiàn)，抑制該基因的表達后水稻的抗旱性明顯減弱，熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)部分抗旱基因的表達在轉(zhuǎn)基因植株中受到了影響(圖7)，說明gcn5蛋白影響了部分抗旱基因的表達。同時通過發(fā)芽表型觀察發(fā)現(xiàn)osgcn5抑制材料冠根數(shù)目變少(圖8)。以上結(jié)果說明gcn5蛋白可能同時通過影響水稻根的數(shù)目和逆境基因的表達來影響水稻的抗旱反應。

對本發(fā)明的詳細描述參見《具體實施方式》內(nèi)容。

附圖說明

序列表seqidno:1是本發(fā)明克隆的廣譜乙酰化酶基因osgcn5的核苷酸序列。序列長度為1536bp(含結(jié)尾處的終止密碼子tga)，編碼511個氨基酸。

序列表seqidno:2是廣譜乙?；富騩sgcn5的蛋白質(zhì)序列。

序列表seqidno:3是本發(fā)明構(gòu)建的的雙鏈抑制rnai載體(或稱之為轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301)的核苷酸序列。序列長度為329bp。

圖1：是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化載體osgcn5-rnai(或稱之為轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301)構(gòu)建示意圖。其中上圖為該轉(zhuǎn)基因植株所用抑制表達載體pds1301的結(jié)構(gòu)示意圖，下圖為該基因被抑制的特異片段位置示意圖(抑制區(qū)段位置：876-1204bp，黃色方框標注)。

圖2：轉(zhuǎn)基因植株osgcn5-rnai陽性家系中osgcn5表達量檢測?？v坐標為相對于actin(水稻內(nèi)的一個表達量非常穩(wěn)定的激動蛋白基因，登錄號為loc_os11g06390)的相對表達量值。

圖3：osgcn5-gst融合蛋白表達。圖3a是本發(fā)明所用的表達載體pgex-6p的圖譜。圖3b左邊為大腸桿菌表達osgcn5-gst融合蛋白sds-page蛋白膠檢測圖。附圖標記說明：從左至右泳道分別為誘導表達0小時、1小時、3小時、5小時大腸桿菌取樣樣品和超聲波處理后沉淀和上清樣品，“*”指示融合蛋白表達出來的位置。圖3b右邊為gstbeads(glutathionesepharose4fastflow,gehealthcare,17-5132-01)純化回收表達的蛋白質(zhì)sds-page蛋白膠檢測圖。

圖4：osgcn5體外酶活試驗結(jié)果。用westernblot檢測和osgcn5-gst融合蛋白孵育后的組蛋白h3和h4多種乙?；揎棤顟B(tài)，gst蛋白孵育作為對照。試驗重復兩次。

圖5：osgcn5基因在根(發(fā)芽10天苗)、幼莖(正在伸長莖桿)、幼苗(發(fā)芽5天)、幼穗(0.2cm-1cm)、葉片(2個月水稻成熟葉)中mrna水平表達量檢測結(jié)果。附圖標記說明：縱坐標為相對于actin的表達量。

圖6：osgcn5-rnai材料和野生型材料干旱處理及干旱應答基因檢測。圖6a為小紅桶干旱處理試驗，分別為處理前和干旱處理14天后復水一個星期表型。圖6b為各材料失水速率調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果。

圖7：osgcn5-rnai材料和野生型材料干旱處理7天葉片中干旱應答基因在osgcn5-rnai材料和野生型中相對表達量檢測。

圖8：osgcn5-rnai材料和野生型材料初生根(pr)，冠根(cr)和地上部分的形態(tài)學差異。附圖標記說明：圖8中的左圖為形態(tài)學觀察照片，圖8中的右圖為試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

具體實施方式

實施例1：osgcn5基因的克隆

本發(fā)明的基因osgcn5的克隆(登陸號loc_os10g28040)主要通過rt-pcr(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pcr擴增)的方法獲得(方法參見：j.薩姆布魯克，ef弗里奇，t曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，北京，科學出版社，2002版)。具體操作步驟如下：

(1)抽提水稻品種“中花11”(中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所)成熟葉片mrna，mrna抽提后用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)；

(2)rt-pcr反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈的步驟如下：①配制混合液1：抽提的總rna4μg，dnasei1μl(2u/μl),10×dnaseibuffer1μl，加不含rna酶的雙蒸水(0.01％depc處理過的雙蒸水，depc又名焦碳酸二乙酯，rna酶的強烈抑制劑)3μl，混勻后將混合液1在37℃放置15分鐘以除去dna，②15分鐘后將混合液1置于65℃水浴中溫浴變性10分鐘以使dnasei失活，然后置于冰上5分鐘，③向混合液1中分別加入1μl500μg/ml的oligo(dt)和1μl10mm/l的dntp的并充分混勻，④將混合液1立即置于65℃水浴中溫浴10分鐘，然后置于冰上5分鐘，使mrna徹底變性并讓oligo(dt)結(jié)合在mrna3’末端，⑤配制混合液2：5×firststrandbuffer4μl，0.1mdtt(巰基乙醇)2μl，rrⅰ，反轉(zhuǎn)錄酶ssⅲ1μl，混勻后將混合液2置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時，⑥反應結(jié)束后將混合液2置于90℃干浴10分鐘變性，⑦-20℃保存最終反應產(chǎn)物，反應中用到的試劑全部購自于invitrogen公司。

(3)然后根據(jù)ricegenome數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)提供的osgcn5基因的全長cdna序列設計引物利用pcr擴增全長。pcr體系具體為：反轉(zhuǎn)錄cdna產(chǎn)物1μl，10×pcrbuffer2μl，10mm/ldntp2μl，正向引物(f)和反向引物(r)各0.4μl，la-taq酶0.2μl，補雙蒸水12μl(所用到的pcrbuffer、dntp、taq酶等均購自takara公司)。pcr反應程序如下：①94℃5分鐘，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃120秒，⑤從②－④循環(huán)30次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。用來克隆osgcn5全長的引物為：

osgcn5-f:5’-ggggtaccatggacgggctcgcggcgcc-3’,

osgcn5-r:5’-cgggatcctcagttcttcgttgaggcttgggc-3’

最終擴增得到的osgcn5全長連接-teasy載體(promega公司)，利用t7和sp6引物測序發(fā)現(xiàn)擴增得到的核苷酸序列與ricegenome數(shù)據(jù)庫所提供的序列完全一致，如seqidno：1所示。測序用的引物序列為：

t7:5’-attatgctgagtgatatccc-3’,

sp6:5’-taaatccactgtgatatctt-3’,

實施例2：雙鏈抑制dsrnai載體的構(gòu)建

根據(jù)ricegenome數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)公布的osgcn5基因的全長cdna序列，利用smart網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其編碼的蛋白質(zhì)序列(seqidno:2)存在兩個保守的結(jié)構(gòu)域，分別為乙酰化功能結(jié)構(gòu)域(211位氨基酸到287位氨基酸)和bromodomain結(jié)構(gòu)域(396位氨基酸到505位氨基酸)，在兩個保守結(jié)構(gòu)域中間非保守區(qū)域設計雙鏈抑制引物(dsrnai引物),并利用實施例1中克隆到的基因全長為模板pcr擴增得到雙鏈抑制區(qū)段dna，設計引物時在上游引物5’端添加spei和kpni限制性內(nèi)切酶位點，在下游引物5’端依序添加saci和bamhi限制性內(nèi)切酶位點。pcr擴增出該目的序列后，擴增產(chǎn)物通過t/a克隆連接到-teasy載體(promega公司)進行測序驗證其擴增的dna片段(序列表seqidno:3)。利用該載體酶切獲得目標dna片段連接后續(xù)載體pds1301。具體步驟如下：

(1)將帶有osgcn5的rnai片段的t/a克隆質(zhì)粒用kpni和bamhi限制性內(nèi)切酶酶切，回收目標條帶，與經(jīng)kpni和bamhi酶切的載體質(zhì)粒pds1301(由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室已畢業(yè)博士儲昭輝改造而成；該質(zhì)粒的圖譜見圖1；參見文獻：chu等,promotermutationsofanessentialgeneforpollendevelopmentresultindiseaseresistanceinrice.genesdevelopment,2006,20:1250-1255.)進行16℃、6小時連接反應(所使用的內(nèi)切酶均購于寶生物工程大連有限公司，按照該公司提供的產(chǎn)品說明書操作；連接酶購自promega公司)；

(2)將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌(dh10b菌株)感受態(tài)中，并挑取單克隆進行后續(xù)的測序驗證，獲得pds1301連有第一鏈的克隆質(zhì)粒。

(3)用spei和saci酶切相同的帶有osgcn5的rnai片段的克隆質(zhì)粒，并利用spei和saci酶切2)中構(gòu)建好的載體，利用上述連接反應連接外源片段和載體、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中用載體引物測序驗證。用來構(gòu)建雙鏈抑制dsrnai載體的引物為：

osgcn5-rnai-f:5’-gggactagtggtaccggacaaagaaagatggcaagg-3’，

osgcn5-rnai-r:5’-ggggagctcggatccgttgcctgtaagtactgtaatcagg-3’

最終得到的osgcn5基因雙鏈抑制rnai載體(或稱之為表達載體osgcn5-pds1301)。

實施例3.osgcn5體外酶活驗證

(1)以實施例1中涉及的osgcn5全長載體為模板設計引物并擴增osgcn5基因全長，左端引物(osgcn5-6p-f)和右端引物(osgcn5-6p-r)的5’端分別添加bamhi和sali酶切位點，擴增片段連接-teasy載體(promega公司)，連接反應條件為16℃、6小時。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受體(dh10b菌株)，并挑選單克隆進行后續(xù)的測序獲得不存在突變的克隆子。利用bamhi和sali限制性內(nèi)切酶分別酶切上述克隆獲得的載體獲得dna片段外源，同時用bamhi和sali限制性內(nèi)切酶酶切osgcn5-pgex-6p載體，將二者進行連接反應，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)挑選單克隆并測序獲得osgcn5-pgex-6p載體(所使用的內(nèi)切酶均購于寶生物工程大連有限公司，參照產(chǎn)品說明書操作；連接酶購自promega公司)。構(gòu)建該載體所用的擴增引物序列如下：

osgcn5-6p-f:5’-ggatccatggacgggctcgcggc-3’，

osgcn5-6p-r:5’-gtcgacctcagttcttcgttgaggcttgg-3’

(2)將構(gòu)建好的osgcn5-pgex-6p載體利用電轉(zhuǎn)化將其導入到大腸桿菌表達菌株(bl21菌株)中，挑選單克隆，擴大培養(yǎng)，當菌株搖到od值＝0.5時加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷，上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)至最終濃度為0.2mm/l，并于0小時、1小時、3小時、5小時時取樣，同時將5小時菌液收集后用緩沖液(20mm/ltris-hcl,200mm/lnacl,0.5％np-40(sigma，18896),1mm/ledtaph＝8.0,0.01g/mlproteaseinhibitor(roche，04693159001))重懸，并用超聲波儀(soniprep150，美國)處理后12000rpm5分鐘離心分離出沉淀和上清樣品，溶于蛋白上樣緩沖液中(配方：62.5mmtris-hcl,ph6.8；2％sds；25％甘油(glycerol)；0.01％溴酚藍(bromophenolblue)；10％β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，95℃變性10分鐘，冰上放置5分鐘。經(jīng)濃度為15％的sds-page蛋白膠進行電泳(電泳采用bio-rad公司的mini-protean3電泳槽系統(tǒng)，按照說明書進行操作)。驗證蛋白是否表達出來(圖3)。

(3)將步驟(2)表達的上清利用gstbeads(glutathionesepharose4fastflow,gehealthcare,17-5132-01)進行純化回收，具體步驟如下：將gstbeads用緩沖液洗兩天，500g離心去上清，加入2)中上清液，beads和上清混勻4℃過夜，500g離心去上清，利用緩沖液重懸beads，混勻4℃搖10分鐘，離心去上清，如此清洗6遍。將上清去盡。加100μlgst溶解緩沖液(15.366mg-30.732mgglutathionereduced(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)，250μl1m/ltris-hclph＝8.0)，4℃溶解半小時。500g離心取上清，取15μl上清加入蛋白上樣緩沖液95℃變性10分鐘，冰上放置5分鐘，經(jīng)濃度為15％的sds-page蛋白膠進行電泳檢測(電泳采用bio-rad公司的mini-protean3電泳槽系統(tǒng)，按照電泳槽說明書進行操作)，如圖3所示，申請人純化到了較為干凈的gst空蛋白和osgcn5-gst融合蛋白。

(4)利用步驟(3)中純化回收的蛋白，和組蛋白h3或h4進行孵育反應，并利用westernblot技術(shù)檢測組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)(方法參考：tieetal.,2009.cbp-mediatedacetylationofhistoneh3lysine27antagonizesdrosophilapolycombsilending.development.136(18):3131-3141)。孵育反應如下：40mm/ltris-hclph＝8.0，0.1m/lnacl，10％glycerol，0.1mm/ledta，1mm/ldtt，1mm/lpmsf，5mm/l丁酸鈉，0.1mm/lacetyl-coa(sigma公司)，10μl組蛋白h3或h4(sigma公司)。30℃孵育4小時。westernblot技術(shù)如下：轉(zhuǎn)膜使用bio-rad公司的minitrans-blotcell轉(zhuǎn)印槽系統(tǒng)，按照其說明書，將組蛋白轉(zhuǎn)至amersham公司的hybond-ppvdf膜上，含有2％小牛血清蛋白(bsa)的pbs緩沖液(nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo44.3mmol/l，kh2po41.4mmol/l，ph7.5)室溫進行封閉2小時，以體積比1:10000加入不同的抗體(如后所示)室溫孵育1.5個小時左右。所用抗體分別為：h3(ab1791，abcom公司)、h3k9ace(07-352，millipore公司)、h3k27ace(07-360，millipore公司)、h3k4ace(07-539，millipore公司)、h3k14ace(04-1044，millipore公司)、h4k16ace(07-329，millipore公司)、h4k5ace(04-118，millipore公司)、h4(ab70701，abcom公司)。將一抗溶液回收，用pbs緩沖液洗膜六次，每次10分鐘，再加入按體積比1:10000稀釋的hrp標記的羊抗兔二抗或抗鼠二抗(購自southernbiotech公司，得博生物科技有限公司(北京)代理)，室溫孵育1.5小時，然后用pbs緩沖液洗膜六次，每次10分鐘，使用supersingnalpico(購自pierce公司)試劑盒按說明書操作方法進行x光片顯影，并用掃描儀記錄圖片。結(jié)果圖4所示，說明osgcn5可以直接乙?；痟3k9、k27、k4、k14和h4k5等位點，為一個廣譜的乙酰化酶。

實施例4.osgcn5在調(diào)控水稻抗旱反應中的功能驗證

1、雙元ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽性和表達量檢測：

(1)用實施例2中獲得的轉(zhuǎn)化載體pds1301-osgcn5轉(zhuǎn)化水稻受體品種“中花11”，轉(zhuǎn)化方法按照華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室的標準方法(例如：專利號zl2011100940899，發(fā)明的名稱：組蛋白去甲基化酶基因osj5在提高水稻抗性中的應用；專利公開號：cn102732535；專利授權(quán)日：2013年08月28日的專利文獻)進行。所獲得的t0代轉(zhuǎn)基因植株命名為osgcn5-rnai(依次命名為osgcn5-rnai-n，n＝0，1，2，3……)。

(2)取田間種植的t0代轉(zhuǎn)化植株葉片并抽提總dna。dna抽提方法為ctab法(zhang等，geneticdiversityanddifferentiationofindicaanjaponicaricedetectedbyrflpanalysis,1992,theoreticalandappliedgenetics,83,495-499)。用pcr方法對雙鏈抑制t0代轉(zhuǎn)化植株用載體第二鏈引物(pmcg2f和pmcg2r)進行陽性檢測。所用pcr載體引物如下：

pmcg2f：5’-ggctcaccaaaccttaaacaa-3’，

pmcg2r：5’-ctgagctacacatgctcaggtt-3’。

(以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)

pcr反應體系配方為：模板2μl(約100ng)，10×pcrbuffer2μl，10mm/ldntp2μl，正向引物(pmcg2f)和反向引物(pmcg2r)各0.4μl，r-taq酶0.2μl，補雙蒸水12μl(所用到的pcrbuffer、dntp、taq酶等均購自takara公司)。pcr反應條件如下：①94℃4分鐘，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃1分鐘，⑤從②－④循環(huán)32次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。pcr產(chǎn)物在1％(質(zhì)量/體積)的tbe瓊脂糖凝膠上電泳檢測。載體第二鏈引物(pmcg2f和pmcg2r)擴增片段為轉(zhuǎn)基因植株特有，野生型植株中擴增不出相應片段。對t0代陽性植株收種子(稱為t1代)，為t1代的植株性狀調(diào)查做準備。(3)為了檢測pds1301-osgcn5轉(zhuǎn)基因植株中目標基因的表達量，申請人通過熒光定量pcr的方法對轉(zhuǎn)基因t0代植株進行了表達分析。抽提t(yī)0代轉(zhuǎn)基因陽性植株的總mrna并進行反轉(zhuǎn)錄，抽提用試劑為invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(按試劑盒說明書操作)，rt-pcr中反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈的步驟如下：

①配制混合液1：抽提的總rna4μg，dnasei1μl(2u/μl),10×dnaseibuffer1μl，加不含rna酶的雙蒸水(0.01％depc處理過的雙蒸水，depc又名焦碳酸二乙酯，rna酶的強烈抑制劑)3μl，混勻后將混合液1在37℃放置15分鐘以除去dna；

②15分鐘后將混合液1置于65℃水浴中溫浴變性10分鐘以使dnasei失活，然后置于冰上5分鐘；

③向混合液1中分別加入1μl500μg/ml的oligo(dt)和1μl10mm/l的dntp的并充分混勻；

④將混合液1立即置于65℃水浴中溫浴10分鐘，然后置于冰上5分鐘，使mrna徹底變性并讓oligo(dt)結(jié)合在mrna3’末端；

⑤配制混合液2：5×firststrandbuffer4μl，0.1mdtt(巰基乙醇)2μl，rrⅰ，反轉(zhuǎn)錄酶mlv1μl，混勻后將混合液2置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時；

⑥反應結(jié)束后將混合液2置于90℃干浴10分鐘變性；

⑦-20℃保存最終反應產(chǎn)物，反應中用到的試劑全部購自于invitrogen公司。

得到產(chǎn)物后用實時熒光定量pcr的方法檢測osgcn5的表達量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應體系參見說明書。pcr儀為美國abi公司的7500，pcr參數(shù)為95℃預變性10秒，進入循環(huán)后95℃變性5秒，60℃退火延伸40秒，45個循環(huán)。real-timepcr所用引物序列為：

osgcn5realtime-f：5'-cagataacaatgccgttggct-3’

osgcn5realtime-r：5'-tgacgcctaatcatcgttgc-3’

osgcn5表達量結(jié)果整理如圖2所示，其中osgcn5基因表達量抑制比較好的家系為2、6、10、14、18、20、48。

2、t2代轉(zhuǎn)基因植株性狀調(diào)查和表達分析：

(1)osgcn5基因在不同組織部位的表達

對水稻品種中花11的不同組織部分進行取材，并利用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)抽提mrna，反轉(zhuǎn)錄后利用熒光定量pcr檢測osgcn5基因在根根(發(fā)芽10天苗)、幼莖(正在伸長莖桿)、幼苗(發(fā)芽5天)、幼穗(0.2cm-1cm)、葉片(2個月水稻成熟葉)中的表達量，結(jié)果如圖5所示。由圖可知

分別取水稻品種中花11不同生長時期的不同組織，用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)抽提rna，反轉(zhuǎn)錄后用熒光定量pcr儀檢測osgcn5基因在根(發(fā)芽10天苗)、幼莖(正在伸長莖桿)、幼苗(發(fā)芽5天)、幼穗(0.2cm-1cm)、葉片(2個月水稻成熟葉)中的表達量，結(jié)果如圖5，由圖可知，該基因各個組織和器官中均有表達，但是在葉片組織中表達量最高，這說明osgcn5是一個組織器官組成性表達的基因。

(2)osgcn5基因在水稻抗逆中的作用檢測

將發(fā)芽10天的osgcn5各抑制家系和野生型對照中花11種植在小紅桶中(一半種植osgcn5抑制家系；一半種植野生型中花11)，當二者生長到一個月時，水稻植株大小和生長狀態(tài)基本一致。將桶中明水倒掉并保持持續(xù)不澆水的狀態(tài)使土壤慢慢失去水分，干旱處理14天后植株出現(xiàn)非常明顯的干旱表型，主要表現(xiàn)為葉片卷曲并慢慢枯萎，此時開始復水讓植株重新獲得水分并觀察表型(小紅桶干旱試驗參照：tangetal.,constitutiveactivationoftranscriptionfactorosbzip46improvesdroughttoleranceinrice,2012,plantphysiology,155,1755-1768.)，如圖6a所示。為了進一步確認上述觀察表型，我們?nèi)⊥瑯訔l件下生長一個月的osgcn5抑制家系和野生型中花11為對照材料，測試離體葉片失水率。具體做法：將一個月水稻植株的葉片用剪刀于基部剪下，并立即稱取鮮重(g0h)，然后每隔一個小時稱取材料重量(gxh)，x小時對應的失水率為(gxh-g0h)/g0h(方法參考：tangetal.,constitutiveactivationoftranscriptionfactorosbzip46improvesdroughttoleranceinrice.plantphysiology,2012,158:1755-1768)。結(jié)果統(tǒng)計如圖6b所示，osgcn5抑制家系失水效率高于對照野生型中花11。同時為了尋找osgcn5可能影響的下游基因，我們?nèi)「珊堤幚?天后的osgcn5抑制家系和野生型中花11的葉片，抽提mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr檢測逆境應答基因在兩種材料中的表達量，發(fā)現(xiàn)部分逆境應答基因如過氧化物酶(prx)和谷胱甘肽s基轉(zhuǎn)移酶(gstu)等參與逆境ros(活性氧)清除的基因和部分與逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因如abi和bzip類基因在osgcn5抑制家系相對于野生型下調(diào)表達。說明在水稻的干旱脅迫過程中osgcn5參與調(diào)控了部分逆境應答基因的表達(圖7)。檢測用的引物序列如下：

loc_os11g10460-f:5'-ctggggtctcagaagatggaa-3’

loc_os11g10460-r:5'-cagtttcactcggcaacaaatc-3’，

loc_os02g14430-f:5'-tgtgagattaccatggcttcga-3’

loc_os02g14430-r:5'-ggaggaagaaggccagcaa-3’，

loc_os03g04240-f:5'-gcgacaagactcttgttgattca-3’

loc_os03g04240-r:5'-cccgtcgtctgggaactg-3’，

loc_os10g38540-f:5'-gtcactgctttgggcctttg-3’

loc_os10g38540-r:5'-tgacccggaagaacatcaca-3’，

loc_os01g68370-f:5'-ggatgatatttgatcagtaacccgtagt-3’

loc_os01g68370-r:5'-caacgatgaacaaccaaaccat-3’，

loc_os03g19370-f:5'-gccacagatcgagatgctgtac-3’

loc_os03g19370-f:5'-cgtagccctgcagcatactg-3’，

(3)osgcn5基因在水稻冠根發(fā)育過程中的表型觀察

由于水稻根系與水稻的抗旱反應密切相關(guān)，于是我們考察了osgcn5抑制家系中冠根的發(fā)育狀況。具體如下，在含有生根培養(yǎng)基的方皿上發(fā)芽osgcn5各抑制家系和對照野生型中花11，7天后觀察表型，并對地上部分高度，地下部分長度和冠根數(shù)目進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)osgcn5抑制家系地下部分明顯變?nèi)?，特別冠根數(shù)目有顯著減少(圖8)，說明osgcn5可能通過影響水稻根的發(fā)育來參與水稻的干旱反應。