本發(fā)明涉及生物技術(shù)與基因治療領(lǐng)域，尤其涉及利用crispr系統(tǒng)靶向敲除ccr5基因和治療艾滋病的sgrna序列及其用途。
背景技術(shù)：
：crispr/cas系統(tǒng)是一種細(xì)菌和古細(xì)菌用于外源遺傳物質(zhì)的降解的適應(yīng)性免疫防御機制。在這些生物體中，來自噬菌體的外源遺傳物質(zhì)獲得和整合入crispr位點。這種新材料，也稱為間隔區(qū)，建立用于將來對噬菌體感染性的序列特異性的片段。這些序列特異性的片段被翻譯成引導(dǎo)crispr的rna(sgrnas)，其功能為經(jīng)由crispr相關(guān)(cas)蛋白的核酸酶活性，由crispr位點編碼導(dǎo)向，互補侵入dna裂解。ii型crispr系統(tǒng)cas9核酸酶具有rna結(jié)合域，α螺旋識別葉(rec)，核酸葉，其中包括ruvc和hnh的dna裂解和前間區(qū)序列鄰近基序(pam)交叉位點。sgrna形成與cas9核酸酶的復(fù)合通過結(jié)合到rec葉內(nèi)橋螺旋，并形成多個具有sgrna骨干的鹽橋。一旦sgrna結(jié)合到cas9，cas9核酸酶的構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生一條能通道，讓dna更容易結(jié)合。cas9/sgrna復(fù)合體掃描dna找到pam(5'-ngg)位點。識別pam位點導(dǎo)致dna解旋，使sgrna找到pam位點相鄰的dna互補鏈。當(dāng)cas9結(jié)合到pam位點相鄰的，與sgrna互補的dna序列上，rec葉內(nèi)部的橋螺旋和靶dna形成rna-dna異源雙鏈結(jié)構(gòu)。pam位點的識別包括可使靶dna雙鏈斷裂(dsb)的hnh和ruvc核斷裂的激活，和導(dǎo)致dna降解。如果sgrna與靶dna不互補，cas9將會釋放出來，尋找新的pam位點。dna中的線性靶基因組斷裂后可以通過非同源末端接合(nhej)或者同源介導(dǎo)的修復(fù)(hdr)來進行修復(fù)。非同源末端接合(nhej)會引起插入或者刪除錯誤。同源介導(dǎo)的修復(fù)(hdr)可在基因組的特異性位點結(jié)合特定標(biāo)記。crispr/cas9機制可用于包括哺乳動物細(xì)胞在內(nèi)的各種系統(tǒng)的基因工程中。如今，crispr/cas9系統(tǒng)在基因治療領(lǐng)域大放異彩，新近報道的利用crispr/cas9系統(tǒng)對先天性肌營養(yǎng)不良的基因編輯為病人恢復(fù)正常的肌肉功能更是獲得領(lǐng)域內(nèi)的大量關(guān)注。在crispr/cas9應(yīng)用于臨床的前景被一致看好的當(dāng)下，越來越多的crispr/cas9系統(tǒng)優(yōu)化方案被提出。近年來，艾滋病治療研究取得了突破性進展。2007年，德國一個醫(yī)療小組將ccr5基因缺陷的造血干細(xì)胞移植給一名患有白血病的艾滋病患者。通過四年多的觀察，病人hiv檢測結(jié)果為陰性，不再有白血病和hiv感染跡象。這一案例的成功，提示ccr5是艾滋病治療的理想靶點。以輔助受體為靶向的治療策略為功能性治愈艾滋病提供了一種新思路。已有研究表明，通過基因修飾消除細(xì)胞表面ccr5的表達可達到抗hiv病毒感染的目的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明利用crispr技術(shù)針對ccr5靶點，設(shè)計并篩選獲得了安全高效的sgrna，其具有切割效率高，脫靶概率小等優(yōu)點，在基因編輯效率和使用安全性方面具有最佳效果，并在艾滋病基因治療的臨床研究和應(yīng)用上具有廣泛的前景。所述位點也是基因治療艾滋病的最佳sgrna位點選擇。在一些實施方案中，本文提供針對ccr5基因的sgrna序列，所述sgrna序列選自：ccr5-sgrna1：agggcaactaaatacattct，cr5-sgrna2：tgccaaaaaatcaatgtgaa，ccr5-sgrna3：agtgggactttggaaataca，和ccr5-sgrna4：atgcacagggtggaacaaga。在一些實施方案中，本文提供編碼所述sgrna序列的dna序列，例如5'-tcccgttgatttatgtaaga-3'，5'-acggttttttagttacactt-3'，5'-tcaccctgaaacctttatgt-3'，5'-tacgtgtcccaccttgttct-3'。在一些實施方案中，本文提供包含所述sgrna序列或dna序列的載體，如質(zhì)粒。在一些實施方案中，本文提供包含所述載體的細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞、非人哺乳動物細(xì)胞、干細(xì)胞。在一些實施方案中，本文提供用于在真核細(xì)胞中修飾ccr5基因或調(diào)節(jié)ccr5基因表達的方法，所述方法包括向真核細(xì)胞引入所述sgrna序列，所述dna序列和/或所述的載體，并培養(yǎng)所述真核細(xì)胞使得sgrna將核酸內(nèi)切酶定向至ccr5基因。在一些實施方案中，其中所述方法在體外(invitro)和/或離體(exvivo)進行。在一些實施方案中，所述真核細(xì)胞是人細(xì)胞、非人哺乳動物細(xì)胞、干細(xì)胞。在一些實施方案中，所述修飾降低ccr5基因表達。在一些實施方案中，所述修飾敲除ccr5基因。在一些實施方案中，本文提供治療受試者的艾滋病的方法，所述方法包括向受試者引入所述sgrna序列，所述dna序列，所述載體和/或所述修飾的細(xì)胞，或向受試者的細(xì)胞中引入所述sgrna序列，所述dna序列和/或所述的載體，并培養(yǎng)所述真核細(xì)胞使得sgrna將核酸內(nèi)切酶定向至ccr5基因，從而降低ccr5基因表達，或敲除ccr5基因。在一些實施方案中，其中所述方法在體外和/或離體進行。在一些實施方案中，所述真核細(xì)胞是人細(xì)胞，例如自體的人細(xì)胞或來自其他供體的人細(xì)胞。在一些實施方案中，本文提供所述sgrna序列，所述dna序列、所述載體和/或所述細(xì)胞在制備用于治療受試者的艾滋病的藥物或試劑盒中的用途。在一些實施方案中，本文提供一種組合物或試劑盒，其包括選自所述sgrna序列，所述dna序列、所述的載體和/或所述的細(xì)胞中的任意一項或多項。在一些實施方案中，所述組合物和/或試劑盒包括使用說明書，優(yōu)選的所述試劑盒可以用于本文描述的用途和方法。在一些實施方案中，所述試劑盒來包括適合用于儲存所述sgrna序列、所述載體、和/或所述dna分子的各種試劑如緩沖液等。在一些實施方案中，所述試劑盒包括適合進行所述sgrna序列、所述載體、和/或所述dna分子與目標(biāo)基因反應(yīng)的各種試劑包括酶、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染試劑等。在一些實施方案中，所述試劑盒包括適合通過所述sgrna序列、所述載體、和/或所述dna分子通過與目標(biāo)基因反應(yīng)而調(diào)節(jié)目的基因表達(如降低ccr5基因表達的)試劑。在一些實施方案中，本文提供的rna序列如sgrna序列和/或dna序列是分離的序列或合成的序列。附圖說明圖1：cas9/sgrna體系轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞熒光照片(左為白光，右為綠色熒光)。圖2：4條sgrna對應(yīng)的t7酶切檢測電泳結(jié)果。圖3：grnat7酶切結(jié)果(sgrna1#-sgrna16#)。圖4：grnat7酶切結(jié)果(sgrna17#-sgrna33#)。具體實施方式現(xiàn)將結(jié)合附圖更全面地描述本發(fā)明，其中描述了本發(fā)明的一部分而非全部實施方案。實際上，這些發(fā)明可以許多不同的形式來體現(xiàn)，并且不應(yīng)理解為受本文所示實施方案的限制，其修改形式和其他實施方案也包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。1.sgrna一般而言，sgrna是與靶多核苷酸序列具有足夠互補性以便與該靶序列雜交并且指導(dǎo)crispr復(fù)合物與該靶序列特異性結(jié)合的任何多核苷酸序列。在一些實施方案中，可以對本發(fā)明的sgrna進行進一步修飾，以使修飾后的sgrna與上文列舉的序列ccr5-sgrna1：agggcaactaaatacattct，ccr5-sgrna2：tgccaaaaaatcaatgtgaa，ccr5-sgrna3：agtgggactttggaaataca，和ccr5-sgrna4：atgcacagggtggaacaaga具有約100％，約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的同一性，但是仍然能指導(dǎo)crispr復(fù)合物與靶序列特異性結(jié)合。用于比對序列的算法是本領(lǐng)域已知的，包括clustalw、clustalx、blast等。通過上述序列修飾后，具有所述序列同一性的sgrna序列可以通過本文描述的方法驗證其切割效率、脫靶概率，從而獲得修飾的序列。在一些實施方案中，具有所述序列同一性的sgrna序列至少具有原序列同樣的活性(如切割效率)。在一些實施方案中，具有所述序列同一性的sgrna序列具有提高的活性(如切割效率)。在一些實施方案中，具有所述序列同一性的sgrna序列具有降低的脫靶概率。在一些實施方案中，可以對本發(fā)明的sgrna進行進一步修飾，以使修飾后的sgrna與上文列舉的序列ccr5-sgrna1：agggcaactaaatacattct，ccr5-sgrna2：tgccaaaaaatcaatgtgaa，ccr5-sgrna3：agtgggactttggaaataca，和ccr5-sgrna4：atgcacagggtggaacaaga具有更短的序列。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠采用長度短于20nt的sgrna(例如17～18nt的“truncatedsgrna”)而不影響其活性，并可能顯著降低脫靶風(fēng)險。在一些實施方案中，可以采用更短的sgrna，例如17、18、19nt的sgrna。獲得更短的sgrna后可以通過本文描述的方法驗證其切割效率、脫靶概率，從而獲得修飾的序列。在一些實施方案中，所述更短的sgrna序列至少具有原序列同樣的活性(如切割效率)。在一些實施方案中，所述更短的sgrna序列具有提高的活性(如切割效率)。在一些實施方案中，所述更短的sgrna序列具有降低的脫靶概率。可以通過適合的測定法來評估sgrna指導(dǎo)crispr復(fù)合物與靶序列的序列特異性結(jié)合的能力。例如，足以形成crispr復(fù)合物的crispr系統(tǒng)的組分，包括待測的sgrna在內(nèi)，例如通過用編碼該crispr序列的組分的載體進行轉(zhuǎn)染而提供到具有相應(yīng)靶序列的宿主細(xì)胞中，隨后通過如本文所述方法進行評估。類似地，通過提供該靶序列、包括有待測試的sgrna在內(nèi)的crispr復(fù)合物的組分、和不同于該測試sgrna的對照sgrna，并且比較在該測試sgrna與該對照sgrna反應(yīng)之間的靶序列處的結(jié)合或切割率，可以獲得優(yōu)選的sgrna。在一些實施方案中，還提供了重組模板。重組模板可以是如本文所述的另一個載體的組分，其包含在一個分開的載體中，或者提供為一個分開的多核苷酸。在一些實施方案中，重組模板被設(shè)計為用作在同源重組中的模板，如在被作為crispr復(fù)合物的一部分的crispr酶切開或切割的靶序列之內(nèi)或在其附近。在一些實施方案中，該模板多核苷酸與包含靶序列的多核苷酸的一部分互補。在本文中，除另有明確說明外，核苷酸序列的順序均是指從5'端到3'端的順序。本文提供的sgrna可以是一種寡核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”是指通過共價連接兩種以上的核苷酸形成的分子。術(shù)語寡核苷酸通常包括寡核苷、寡核苷酸類似物、寡核苷酸模擬物和這些的嵌合組合。當(dāng)指核苷酸或單體序列時，其可以堿基序列，諸如，例如，a，t(或u)，g或c或其類似物的序列。本文中“核苷酸”用在本文中是指包含糖結(jié)構(gòu)部分、堿基結(jié)構(gòu)部分和共價連接的基團(如磷酸或硫代磷酸核苷酸間連接基團)的糖苷，并且包括天然存在的核苷酸(如dna或rna)和包含修飾的糖和/或堿基結(jié)構(gòu)部分的非天然存在的核苷酸，其在本文中還稱為“核苷酸類似物”。非天然存在的核苷酸包括具有修飾的糖結(jié)構(gòu)部分(如二環(huán)核苷酸或2’修飾的核苷酸，如2’取代的核苷酸)的核苷酸?！昂塑账犷愃莆铩笔翘烊淮嬖诘暮塑账?如dna或rna核苷酸)利用在糖和/或堿基結(jié)構(gòu)部分中的修飾產(chǎn)生的變體。類似物可以對所述寡核苷酸沒有功能性影響或具有功能性影響。例如，通過產(chǎn)生針對靶標(biāo)的增加的結(jié)合親和力和/或增加的對細(xì)胞內(nèi)核酸酶的抗性和/或增加的轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)的容易性。在一些實施方案中，所述sgrna包含1個、2個、3個或更多核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述寡聚體包含3-8個核苷酸類似物，例如6或7個核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述核苷酸類似物包括鎖定核酸(lna)。例如，所述核苷酸類似物中1個、2個、3個或更多核苷酸類似物可以是lna。本文定義的修飾的rna和/或dna分子可以含有核苷酸類似物/修飾，例如骨架修飾，糖修飾或堿基修飾。骨架修飾可以是核酸分子中包含的核苷酸骨架的磷酸酯被化學(xué)。修飾的修飾骨架的磷酸酯基團可以通過用不同取代基替代一個或多個氧原子來修飾，其實例包括例如硫代磷酸酯。2.crispr酶在一些實施方案中，本發(fā)明涉及crispr酶，例如cas9。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及核酸內(nèi)切酶如cas9，其包含至少一個核定位信號，至少一個核酸酶結(jié)構(gòu)域，和至少一個與sgrna相互作用以將核酸內(nèi)切酶靶向用于剪切的特異性核苷酸序列的結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述核酸內(nèi)切酶經(jīng)修飾而缺失至少一個功能性核酸酶結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸，其編碼本發(fā)明涉及的核酸內(nèi)切酶。在一些實施方案中，所述核酸針對哺乳動物細(xì)胞中的翻譯進行密碼子優(yōu)化。在一些實施方案中，所述核酸是針對人細(xì)胞中翻譯進行密碼子優(yōu)化。在一些實施方案中，編碼所述酶的核酸與啟動子序列可操作地連接。3.cas9、sgrna載體和遞送系統(tǒng)本文提供sgrna載體。sgrna載體包含能被轉(zhuǎn)錄為sgrna序列的多核苷酸，所述sgrna序列能對靶基因進行編輯。在一些實施方案中，該載體可以是病毒載體，如慢病毒或桿狀病毒或優(yōu)選地腺病毒/腺病毒相關(guān)病毒載體。在一些實施方案中，所述載體包括但不限于，單鏈、雙鏈、或部分雙鏈的核酸分子，包括dna、rna、或兩者的核酸分子。在一些實施方案中，所述載體是質(zhì)粒。在一些實施方案中，所述載體是病毒載體，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、復(fù)制缺陷型腺病毒、以及腺相關(guān)病毒(aav))的載體。在一些實施方案中，所述載體包含針對用于表達的宿主細(xì)胞而選擇的一種或多種調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件可操作地連接至待表達的核酸序列如sgrna。所述調(diào)節(jié)元件包括啟動子、增強子、內(nèi)部核糖體進入位點(ires)、和其他表達控制元件(例如轉(zhuǎn)錄終止信號，如多聚腺苷酸化信號和多聚u序列)。在一些實施方案中，本文提供用于sgrna與cas9的雙順反子載體。在一些實施方案中，sgrna與cas9可以由不同啟動子啟動，例如，cas9由cbh啟動子驅(qū)動，而sgrna由u6啟動子驅(qū)動。在一些實施方案中，載體可以被設(shè)計為用于在原核或真核細(xì)胞中表達crispr轉(zhuǎn)錄物(例如核酸轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、或酶)。在一些實施方案中，使用哺乳動物表達載體，載體能夠驅(qū)動一種或多種序列在哺乳動物細(xì)胞中表達。在一些實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)先在特定細(xì)胞類型中表達(例如，使用組織特異型調(diào)節(jié)元件來表達核酸)。組織特異型調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域中已知的。在一些實施方案中，將驅(qū)動crispr系統(tǒng)的一個或多個元件的表達的一種或多種載體引入到宿主細(xì)胞中，使得該crispr系統(tǒng)的這些元件的表達在一個或多個靶位點指導(dǎo)crispr復(fù)合物的形成。在一些實施方案中，一個載體包含一個或多個插入位點，可以插入兩個或更多個sgrna。在一些實施方案中，本文提供分離或重組體多核苷酸，其包含編碼sgrna的rna或dna序列、sgrna載體的各種組分。多核苷酸可以是rna或dna，它們可以是單鏈或雙鏈，任選地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸堿基。dna聚合物形式的多核苷酸可由cdna、基因組dna、合成dna或它們的混合物的一個或多個片段構(gòu)成。多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。所述脫氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。本發(fā)明所述多核苷酸也涵蓋所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。還提供了包含sgrna載體和其不同組分的重組多核苷酸。重組載體包含人工的或異源的核酸序列的組合例如非天然共存的調(diào)控和編碼序列。在其它實施方案中，重組載體可包含來源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或來源于相同來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。所述載體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。例如可以使用質(zhì)粒載體。為了成功地轉(zhuǎn)化、篩選和繁殖包括本發(fā)明任何分離核酸片段的宿主細(xì)胞，載體上可以包含的遺傳元件。因此為了獲得顯示期望的表達水平和模式的細(xì)胞系，可通過dna印跡分析、rna印跡分析、蛋白表達的免疫印跡分析或表型分析等進行篩選。在一些實施方案中，本文所述的一個或多個sgrna載體可以表達盒形式提供在不同細(xì)胞類型中表達。所述盒可包括5'和3'調(diào)控序列，其被可操作地與本文提供的多核苷酸連接。在轉(zhuǎn)錄的5'-3'方向中，所述表達盒可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、本文所提供的重組多核苷酸、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。許多啟動子可用于本文提供的sgrna載體。通過在sgrna載體中使用不同啟動子，可以調(diào)節(jié)sgrna表達的時間、位置和/或水平。如果需要，sgrna載體可含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予誘導(dǎo)型、組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達的調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄起始開始位點、核糖體結(jié)合位點、rna加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。4.導(dǎo)入的方法本文提供的方法包括將sgrna載體導(dǎo)入細(xì)胞。本文提供的方法不限于特定方法，只要使多核苷酸進入宿主的至少一個細(xì)胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于病毒介導(dǎo)的方法。導(dǎo)入包括指將核酸整合進真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合進細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且包括指將核酸或蛋白提供給細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方案以及用于將多核苷酸序列引入細(xì)胞內(nèi)的方案可以根據(jù)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的類型而改變。在一些實施方案中，可以使用病毒載體，如慢病毒或桿狀病毒或優(yōu)選地腺病毒/腺病毒相關(guān)病毒載體進行導(dǎo)入。在一些實施方案中，可以使用其他遞送系統(tǒng)，如酵母系統(tǒng)、微囊泡、基因槍/將載體附接到金納米粒子上。在所述載體中，sgrna或編碼dna可被可操作地連接到一個啟動子，而且指導(dǎo)核酸遞送到宿主細(xì)胞中。5.組合物和/或試劑盒本文提供使用sgrna的方法和提供包含sgrna的組合物和/或試劑盒，所述sgrna當(dāng)引入細(xì)胞時能夠?qū)Π谢蜻M行基因編輯。此類方法和組合物包含sgrna載體，所述載體具有編碼sgrna的多核苷酸序列。sgrna載體被設(shè)計成從所述載體產(chǎn)生sgrna。本文提供的組合物可包含分離或基本上經(jīng)純化的多核苷酸。“分離”或“純化的”多核苷酸，是基本上或本質(zhì)上不含那些在天然存在環(huán)境中正常伴隨多核苷酸或與其相互作用的游離組分。因此，分離或經(jīng)純化的多核苷酸基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)、或當(dāng)通過重組體技術(shù)生產(chǎn)時的培養(yǎng)基、或基本上不含當(dāng)通過化學(xué)合成時的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。在一些實施方案中，“分離”多核苷酸不含多核苷酸所來源于的生物的基因組dna中天然地存在于所述多核苷酸兩側(cè)(即，位于所述多核苷酸的5'和3'端)的序列。本發(fā)明的sgrna、載體、細(xì)胞可以用在藥物制劑和組合物中，也可制備成方便應(yīng)用的試劑盒。適當(dāng)?shù)?，所述組合物或試劑盒包含藥用溶劑，諸如水或鹽水，稀釋劑，載體，鹽或輔藥。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的寡核苷酸的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療疾病，例如用于基因治療。在一些實施方案中，本文提供的組合物和/或試劑盒包含：1)編碼sgrna的多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列包含一種或多種sgrna，該sgrna能夠雜交到真核細(xì)胞中的靶序列上，2)編碼crispr酶的多核苷酸序列。在轉(zhuǎn)錄時，該sgrna引導(dǎo)crispr復(fù)合物與該靶序列的序列特異性結(jié)合，其中該crispr復(fù)合物包含與雜交到該靶序列上的該sgrna和crispr酶。在一些實施方案中，所述多核苷酸包含在含有一種或多種載體的載體系統(tǒng)中。6.使用方法在一些實施方案中，本文提供用于在真核細(xì)胞中修飾ccr5基因或調(diào)節(jié)ccr5基因表達的方法，所述方法包括向真核細(xì)胞引入所述sgrna序列，所述dna序列和/或所述的載體，并培養(yǎng)所述真核細(xì)胞使得sgrna將核酸內(nèi)切酶定向至ccr5基因。在一些實施方案中，本文提供治療受試者的艾滋病的方法，所述方法包括向受試者引入所述sgrna序列，所述dna序列，所述的載體和/或所述修飾的細(xì)胞，或向受試者的細(xì)胞中引入所述sgrna序列，所述dna序列，所述的載體，并培養(yǎng)所述真核細(xì)胞使得sgrna將核酸內(nèi)切酶定向至ccr5基因，從而降低ccr5基因表達，或敲除ccr5基因。在一些實施方案中，本文提供的方法包括：提供1)編碼sgrna的多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列包含一種或多種sgrna，該sgrna能夠雜交到真核細(xì)胞中的靶序列上，2)編碼crispr酶的多核苷酸序列，該crispr酶任選地包含至少一個或多個核定位序列。在轉(zhuǎn)錄時，該sgrna引導(dǎo)crispr復(fù)合物與該靶序列的序列特異性結(jié)合，其中該crispr復(fù)合物包含與雜交到該靶序列上的該sgrna和crispr酶。在一些實施方案中，編碼crispr酶的多核苷酸序列是dna或rna。在一些實施方案中，編碼crispr酶的多核苷酸序列、sgrna任一者或全部可以是rna。在一些實施方案中，編碼crispr酶的序列、sgrna可以是rna并且可以經(jīng)由脂質(zhì)體、納米粒子、微囊泡、或基因槍進行遞送。在一些實施方案中，所述多核苷酸被包含在上文描述的一種或多種載體中。在一些實施方案中，本文提供的方法是在體外(invitro)和/或離體(exvivo)地進行的。在一些實施方案中，所述方法包括誘導(dǎo)表達。在一些實施方案中，所述載體是病毒載體，包括aav或慢病毒載體。在一些實施方案中，所述crispr酶是cas9。在一些實施方案中，sgrna的表達是在t7啟動子控制下并且是由t7聚合酶的表達驅(qū)動的。在一些實施方案中，本文提供的方法包括遞送crispr酶，例如通過向細(xì)胞遞送編碼該crispr酶的mrna來進行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括：1)向真核細(xì)胞引入(i)至少一種包含至少一個核定位信號的crispr酶或編碼至少一種包含至少一個核定位信號的crispr酶的核酸，(ii)至少一種編碼至少一種sgrna的rna或dna，和2)培養(yǎng)所述真核細(xì)胞使得sgrna將crispr酶定向至染色體序列中的靶位點，其中所述crispr酶將雙鏈斷裂引入該靶位點，并且所述雙鏈斷裂通過dna修復(fù)過程修復(fù)使得所述染色體序列被修飾。在一些實施方案中，所述crispr酶來自cas9。在一些實施方案中，編碼所述crispr酶的核酸是mrna。在一些實施方案中，編碼所述crispr酶的核酸是dna。在一些實施方案中，所述dna是載體的一部分，所述載體進一步包含編碼sgrna的序列。在一些實施方案中，所述真核細(xì)胞包括人細(xì)胞和非人哺乳動物細(xì)胞、干細(xì)胞。在一些實施方案中，本文提供的sgrna序列信息如下：ccr5-sgrna1：agggcaactaaatacattct，ccr5-sgrna2：tgccaaaaaatcaatgtgaa，ccr5-sgrna3：agtgggactttggaaataca，ccr5-sgrna4：atgcacagggtggaacaaga。在一些實施方案中，(1)sgrna1通過轉(zhuǎn)入的dna序列(5'-tcccgttgatttatgtaaga-3')進行轉(zhuǎn)錄合成，或者直接轉(zhuǎn)入sgrna序列(agggcaactaaatacattct)，通過與cas9蛋白結(jié)合形成切割復(fù)合體，sgrna序列通過識別嚴(yán)格互補序列，從而定位到人類基因組3號染色體ccr5基因序列上(nc_000003.12(46370142..46376206))，對該基因靶序列特定位點完成高效切割。在一些實施方案中，(2)sgrna2通過轉(zhuǎn)入的dna序列(5'-acggttttttagttacactt-3')進行轉(zhuǎn)錄合成，或者直接轉(zhuǎn)入sgrna序列(tgccaaaaaatcaatgtgaa)，通過與cas9蛋白結(jié)合形成切割復(fù)合體，sgrna序列通過識別嚴(yán)格互補序列，從而定位到人類基因組3號染色體ccr5基因序列上(nc_000003.12(46370142..46376206))，對該基因靶序列特定位點完成高效切割。在一些實施方案中，(3)sgrna3通過轉(zhuǎn)入的dna序列(5'-tcaccctgaaacctttatgt-3')進行轉(zhuǎn)錄合成，或者直接轉(zhuǎn)入sgrna序列(agtgggactttggaaataca)，通過與cas9蛋白結(jié)合形成切割復(fù)合體，sgrna序列通過識別嚴(yán)格互補序列，從而定位到人類基因組3號染色體ccr5基因序列上(nc_000003.12(46370142..46376206))，對該基因靶序列特定位點完成高效切割。在一些實施方案中，(4)sgrna1通過轉(zhuǎn)入的dna序列(5'-tacgtgtcccaccttgttct-3')進行轉(zhuǎn)錄合成，或者直接轉(zhuǎn)入sgrna序列(atgcacagggtggaacaaga)，通過與cas9蛋白結(jié)合形成切割復(fù)合體，sgrna序列通過識別嚴(yán)格互補序列，從而定位到人類基因組3號染色體ccr5基因序列上(nc_000003.12(46370142..46376206))，對該基因靶序列特定位點完成高效切割。在一些實施方案中，對于所述sgrna中，所述基因組物種均為人，所述位置均在ccr5基因中，所述的序列信息分別為：agggcaactaaatacattct；tgccaaaaaatcaatgtgaa；agtgggactttggaaataca；atgcacagggtggaacaaga，序列按照5'端到3'端的規(guī)則書寫。在一些實施方案中，sgrna序列位置信息包括dna序列信息對應(yīng)的rna序列信息。在一些實施方案中，本文提供用任一所述sgrna序列制備crispr/sgrna載體的方法。在一些實施方案中，所述方法可以包括如下步驟：1)根據(jù)所述sgrna序列設(shè)計合成crispr體系所需的sgrna載體；2)使用步驟1)獲得的載體進行人ccr5基因編輯。在一些實施方案中，所述的crispr/sgrna載體包括dna載體和rna載體。在一些實施方案中，所述方法運用crispr技術(shù)進行基因編輯，所需要的靶向引導(dǎo)載體包含本文提供的sgrna序列。本發(fā)明的目的之一在于在人ccr5基因上設(shè)計出適合crispr技術(shù)基因編輯的多個sgrna位點。在一些實施方案中，本文提供sgrna設(shè)計方法，所述方法包括：根據(jù)對crispr/cas9的sgrna的設(shè)計規(guī)則，在人ccr5基因的多個外顯子上的不同范圍內(nèi)設(shè)計多個可能的sgrna。在一些實施方案中，所述方法包括在引物的設(shè)計中尋找相應(yīng)的pam序列。在一些實施方案中，在所需切割位置附近找到pam序列后，將與其相鄰的18-23bp的片段可以作為可能的sgrna備選。在一些實施方案中，sgrna的選擇位置則分布在ccr5上多個外顯子中。本發(fā)明的目的之一還在于提供在上述設(shè)計的sgrna中篩選出基因編輯安全性高的sgrna位點的方法。在一些實施方案中，所述高安全性sgrna篩選方法包括：在上述多個設(shè)計的sgrna的基礎(chǔ)上，利用多種預(yù)測軟件，如crisprdesigntool預(yù)測每個sgrna產(chǎn)生脫靶的可能性。不同的軟件根據(jù)不同的原理預(yù)測脫靶。在一些實施方案中，綜合考慮多個軟件的評分后選擇出多個軟件中預(yù)測脫靶均較低的sgrna。在篩選過程中，以crisprdesigntool為主要參考，我們設(shè)定了以下標(biāo)準(zhǔn)：切割效率評判應(yīng)當(dāng)在50以上；脫靶位點最高評分不能超過3分；1分以上的脫靶位點不能超過1個；使用cctop工具沒有檢測出新的脫靶位點。在一些實施方案中，將篩選出的sgrna序列通過引物設(shè)計引物的方式連接到載體質(zhì)粒的相應(yīng)位置，通過pcr的方式生產(chǎn)質(zhì)粒進行體內(nèi)的測試。在一些實施方案中，在構(gòu)建過程中使用takara公司的primestar酶，使用50ul的反應(yīng)體系。在引物的設(shè)計中將設(shè)計好的低脫靶的sgrna的序列加在末端，通過pcr的方式將新的20bp的sgrna序列替換至載體的相應(yīng)位置上。在一些實施方案中，為方便之后的測試，選用的cas9載體上同時插入了gfp的熒光蛋白序列。轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞后第二天觀察熒光強度(見圖1)。通過上述方法，發(fā)明人在人ccr5基因外顯子上設(shè)計了不同sgrna，并對脫靶位點及脫靶概率進行了分析(見下表1-5)。表1.ccr5-sgrna1外顯子上可能脫靶位點及脫靶概率得分表2.ccr5-sgrna2外顯子上可能脫靶位點及脫靶概率得分sequencescoremismatcheslocustttacattcattttttggtatgg0.63mms[3:9:19]chr17:+62865344ttcccacccattttttggcaggg0.64mms[4:7:8:9]chr1:-184677338ttaatttttattttttggcagag0.54mms[3:5:6:9]chr22:-43219702ttaagattcattttttggtatgg0.34mms[3:5:9:19]chr8:+87153638ctcacagagattttgtggcaggg0.34mms[1:7:8:15]chr14:-95107782ttcacagtgattttttagaaaag0.23mms[7:17:19]chr9:-17299443ttcacatggattttttcacagag0.23mms[8:17:18]chr17:-12901819ttaacattgagattttggcctgg0.24mms[3:11:12:20]chr16:+21664069ttcatatacattttttgccaaag0.24mms[5:8:9:18]chr1:+121312867ttcatatacattttttgccaaag0.24mms[5:8:9:18]chr5:-49692828ttcacttagactctttggcagag0.24mms[6:8:11:13]chr16:+11650266gtgacactgatttcttggcaggg0.24mms[1:3:7:14]chr3:-15298856ttcaccttgtttctttggccaag0.14mms[6:10:13:20]chr1:-192128429tccacatttattgtttggaaagg0.14mms[2:9:13:19]chr2:+170062975ttcagtttcatttttgggcagag0.14mms[5:6:9:16]chr22:+30489822tccacactgatctcttggcatgg0.14mms[2:7:12:14]chr10:+25889757ttcagattaatttttttccagag0.14mms[5:9:17:18]chr4:+129793538ttcacatggattctatggcttgg0.14mms[8:13:15:20]chr2:+210889782tttacattcattttttgatatgg0.14mms[3:9:18:19]chr17:-44617453tttacattcattttttgatatgg0.14mms[3:9:18:19]chr17:-44399599ttcagattgatctttctgcatgg04mms[5:12:16:17]chr4:+81967055ttcacattgatgttttcgtccag04mms[12:17:19:20]chrx:-46457538ttgacattgatcttgaggcagag04mms[3:12:15:16]chr1:-36379536表3.ccr5-sgrna3外顯子上可能脫靶位點及脫靶概率得分表4.ccr5-sgrna4外顯子上可能脫靶位點及脫靶概率得分sequencescoremismatcheslocusatccacaggaaggaacaagaagg1.33mms[3:10:11]chr19:-43990455agggacagggtggaaaaagagag0.53mms[2:4:16]chr11:-86126410attcacagcctggaacaaaagag0.34mms[3:9:10:19]chr17:+3527515aagctcagggaggagcaagatgg0.24mms[2:5:11:15]chr10:-104374957gtgctcagggtggaaccaaagag0.24mms[1:5:17:19]chr2:-220470931ctggacagggtggaccaagtaag0.24mms[1:4:15:20]chr2:-54159878ctgctcagggtggatccagagag0.24mms[1:5:15:17]chr6:-689106aagcacacggttgaaaaagaagg0.14mms[2:8:12:16]chr3:-37547441ttgcacagtgtgtaacaaaaaag0.14mms[1:9:13:19]chr1:-155889682ctgcagagtgtggaacaggaaag0.14mms[1:6:9:18]chr3:-52873581atgctctggggggaaaaagaaag0.14mms[5:7:11:16]chrx:-41029225acgcaccgggtggaagtagatgg0.14mms[2:7:16:17]chr22:+50688848atgaagagggtgaaacaggaaag0.14mms[4:6:13:18]chr1:+233397754atgcccagagtgtaacacgatgg0.14mms[5:9:13:18]chr1:+186113596attcacagggaggcacaggacag04mms[3:11:14:18]chr6:-166354166atgcacaggctggcaccggaagg04mms[10:14:17:18]chr9:+139903922表5.低脫靶g(shù)rna篩選在一些實施方案中，本發(fā)明的目的之一在于提供在以上這些sgrna中進一步篩選出具有高效基因編輯的sgrna位點的方法。所述方法包括獲得一系列低脫靶的sgrna，連接到相應(yīng)載體上，檢測這些sgrna的切割效率。此前有相關(guān)文章報道過crispr/cas9的切割效率很大程度上受到了sgrna的影響。在一些實施方案中，應(yīng)用了293t細(xì)胞進行了測試了上述篩選后的高安全性的sgrna。在一些實施方案中，所述的高效基因編輯的sgrna篩選方法如下：在獲得了各個sgrna的熒光數(shù)據(jù)后，進一步檢測了每種sgrna的切割效率。將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)了的293t細(xì)胞收集后，使用qiagen盒子提取基因組。使用不同sgrna在ccr5的不同位置上通過pcr擴增包含了預(yù)期切割位點的序列。在使用tiangen試劑盒回收pcr產(chǎn)物之后，使用neb的t7限制性內(nèi)切酶切割。這一酶會非特異性切割dna上不完美吻合的位置。如果在crispr/cas9作用下，目標(biāo)位置有可能被切割，然后再nhej的作用下會產(chǎn)生能被t7識別的不匹配序列，從而被切割。如圖2。通過上述檢測方法，發(fā)明人測試的33組grna切割效率相關(guān)數(shù)據(jù)如下表6：表6：grna切割效率由上表可以看出12#(grna1)，17#(grna2)，9#(grna3)，19#(grna4)四組grna切割效率最高(t7酶切結(jié)果見圖3，圖4)，均高于70％的切割效率。在切割過程中，可以使用了20ul的體系，其中包括了2ul10xnebbuffer2，1000ngdna，以及補足體系的去離子水。為了保證酶切的效果，在加入t7酶之前，pcr產(chǎn)物經(jīng)過了退火程序。然后在t7酶切1個小時以后進行瓊脂糖電泳鑒定。為了進一步確定所選sgrna的切割效率，對有清晰t7切割的pcr產(chǎn)物，將其連接在transgene公司生產(chǎn)的bluntsimple載體上進行測序。并挑出30個至100個克隆進行測序，確定切割比例及切割方式。通過本發(fā)明的方法，綜合比對了細(xì)胞死亡率，核轉(zhuǎn)效率，以及切割效率之后，能夠獲得高效的、低脫靶效率的sgrna。7.應(yīng)用本發(fā)明的寡核苷酸可以用作研究試劑，例如，用于診斷、治療和預(yù)防。在研究中，所述寡核苷酸可以用于特異性結(jié)合目的，可以對所述基因進行編輯，例如降低其表達或?qū)⑵淝贸?，由此促進對靶標(biāo)的功能性分析或?qū)ζ渥鳛橹委煾深A(yù)的靶標(biāo)的評估。對于治療劑，患有艾滋病的受試者可以通過施用本發(fā)明所述的寡核苷酸進行治療。進一步提供治療懷疑患有或傾向于患有艾滋病的哺乳動物(如治療人)的方法，所述通過通過施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的寡核苷酸或組合物。本發(fā)明所述的寡核苷酸或藥物組合物典型地以有效量施用。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。1.sgrna質(zhì)粒載體的構(gòu)建(1)引物設(shè)計與合成我們從人ccr5基因第一個外顯子開始到ccr5-δ32位置為止，參照sgrna設(shè)計規(guī)則找到正、反義鏈上所有的sgrna序列設(shè)計引物，通過生物信息學(xué)評價，篩選低脫靶的sgrna設(shè)計相應(yīng)的引物，發(fā)送到引物合成公司進行合成。(2)sgrna引物溶解及退火取公司合成引物，3000rpm離心5min，加te溶解至200um，37℃放置15min。取5μl的forwardprimer及對應(yīng)的reverseprimer于pcr管中，混勻。退火程序:95℃x10min95℃x1s(-2.0℃/cycle)，goto2，4times85℃x1s(-0.2℃/cycle)，goto4，299times25℃x1min(3)sgrna插入片段與載體的連接1)去30ug插入片段與5ug的sgrna載體配成連接混合液(solutionⅰ體系)，37℃連接1小時。2)使用全式金trans5α或者t1感受態(tài)菌，向每一管中加入25μl感受態(tài)菌液，冰上放置30min。3)42℃水浴90s，之后冰上復(fù)蘇3min，加入100μl無抗性lb培養(yǎng)基。37℃搖床中復(fù)蘇15min-30min。4)將125μl菌液中65μl涂于0.001％amp的lb平板上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h-16h。5)每個平板挑取4個克隆，溶于100μlamplb培養(yǎng)基中。37℃搖床培養(yǎng)3-10h。測序鑒定出正確的克隆。2.sgrna質(zhì)粒載體的高度純化該載體的高度純化，采用qiagen去內(nèi)毒素套裝的中提試劑盒，其每次提取dna總量可在50-100μg。(1)提取talen質(zhì)粒需要的菌液準(zhǔn)備1)配置100ml0.001％amp的lb培養(yǎng)基，將菌種中50μl放入錐形瓶中，在37℃搖床中搖16h。2)取出多個50ml離心管，將菌液分三次倒入50ml離心管中，12000rpm/min離心7min，倒掉上清液。(2)qiagen試劑盒中提過程1)向每管中加入4ml加入好rnasea的p1溶液，重懸菌液。2)加入4mlp2溶液，顛倒混勻數(shù)次，室溫放置3-5分鐘，此時溶液會出現(xiàn)粘稠狀物質(zhì)并呈現(xiàn)藍(lán)色。3)加入10mlp3溶液，溶液中藍(lán)色退去，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，顛倒混勻數(shù)次使得其均勻，放入4℃離心機20000xg離心30分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的50ml管中，注意盡量不要倒出白色沉淀物。4)向每個50ml離心管中加入840μlendotoxicremovalbuffer，冰上放置30min。5)使用4mlbufferqbt平衡qiagen-tip100吸附柱。6)將含有質(zhì)粒的混合液通過注射器與濾膜，將液體注入到吸附柱中。7)使用10ml的qcbuffer洗滌qiagen-tip100吸附柱兩次。8)將吸附柱架在一個新的離心管上，用5ml的bufferqf洗脫dna。9)向新的離心管中加入3.5ml異丙醇，放入4℃離心機20000xg，離心30分鐘，去除上清液。10)向新的離心管中加入2ml70％乙醇洗滌，放入4℃離心機20000xg，離心30分鐘。11)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間，去除上清液，晾干，用40-100μl無菌水或te洗脫液溶解質(zhì)粒，放置5min。12)分裝，使用nanodrop測定質(zhì)粒溶液的吸光度和濃度，一般而言a260/a280大于1.9，a260/a230接近或大于2，濃度大于500ng/μl可進行下一步實驗。3.sgrna質(zhì)粒陽轉(zhuǎn)與純化(1)sgrna質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化1)使用全式金trans5α或者t1感受態(tài)菌，向每一管中加入25μl感受態(tài)菌液，冰上放置30min。2)42℃水浴90s，之后冰上復(fù)蘇3min，加入100μl無抗性lb培養(yǎng)基。37℃搖床中復(fù)蘇15min-30min。3)將125μl菌液中65μl涂于0.001％amp的lb平板上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h-16h。4)每個平板挑取2個克隆，溶于100μlamplb培養(yǎng)基中。37℃搖床培養(yǎng)3-10h。(2)sgrna質(zhì)粒的提取按照unitassembling質(zhì)粒小提方式相同的提取方式，保種并提取陽性轉(zhuǎn)化后搖起來的感受態(tài)大腸桿菌中的質(zhì)粒。4.在293t細(xì)胞上進行sgrna效率篩選293t細(xì)胞易于存活，生長速度快，基因組狀態(tài)較為松弛，對于細(xì)菌內(nèi)毒素抗性顯著強于人類cd34+細(xì)胞群。適合用于該檢測實驗。轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前的質(zhì)粒要進行滅菌處理，盡量消除其污染細(xì)胞的可能性。(1)質(zhì)粒的沉降和滅菌1)將純化好sgrna質(zhì)粒載體中加入兩倍體積無水乙醇和1/10體積的3m醋酸鈉，混合均勻，放入-20℃中沉降30min以上。2)4℃12000rpm/min離心15min，此時可見白色沉淀團塊，除去上清液，加入1ml70％乙醇洗滌。3)4℃12000rpm/min離心15min，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間超凈臺，管壁噴灑酒精。4)移走70％乙醇，吹干殘留液體，加入10-20μl無菌水溶解5-10min。5)轉(zhuǎn)移出1μl至一個新的小管中，測濃度和a260/a280，a260/a230，要求達到濃度＞300ng/μl，a260/a280＞1.9，a260/a230接近或＞2.0。(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染sgrna和cas9質(zhì)粒進入293t細(xì)胞1)觀察293t細(xì)胞貼壁情況，對于生長均勻，無重疊，且覆蓋培養(yǎng)皿70-80％面積的293t細(xì)胞適宜進行轉(zhuǎn)染實驗。2)按照孔板和細(xì)胞數(shù)量的大小，配制ltx混合液和質(zhì)粒-plus混合液，按照invitrogen公司提供的表進行配制(表7，經(jīng)修改)。通常，按照1×106細(xì)胞轉(zhuǎn)染單側(cè)1.5μg或2μgtalen(共4μg)，轉(zhuǎn)染2μg。3)將混合好的dna-plus混合液緩慢加入ltx混合液中，迅速振蕩混勻。4)混合好所有的管后再次使用vortex振蕩，將混合液緩慢加入鋪有293t細(xì)胞的孔中，在鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和混合的顆粒大小及均勻程度。5)放在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，晃動均勻，培養(yǎng)。6)12h后觀察gfp質(zhì)粒孔的狀態(tài)，判斷轉(zhuǎn)染效率。更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新放回37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，至第72小時。(3)提取293t細(xì)胞基因組使用tiangen細(xì)胞基因組提取試劑盒，提取293t細(xì)胞基因組。1)293t細(xì)胞預(yù)處理：吸走293t細(xì)胞上層的培養(yǎng)基成分，使用胰蛋白酶適量(1ml對應(yīng)6孔板，500μl對應(yīng)12孔板)，在37℃溫箱中消化3min。2)從細(xì)胞間將孔板轉(zhuǎn)移到分子實驗區(qū)，將孔內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5mltube中，12000rpm/min離心2min，去上清。3)用1mlpbs洗滌孔板，并將洗滌液轉(zhuǎn)移到tube中，12000rpm/min離心2min，去上清。4)按照200μlga，20μl蛋白酶k(試劑盒自帶)，4μlrnasea(試劑盒自帶)配置混合重懸液，加入到tube中重懸細(xì)胞團至沒有團塊。5)加入200μlgb，混勻，70℃放置15min，每隔5min顛倒混勻一次，至溶液清亮。6)加入200μl無水乙醇，短暫離心除去管壁水珠。7)將混合液加入到已插入到收集管內(nèi)的cb3柱中，12000rpm/min離心30s，倒掉收集管內(nèi)的廢液。8)將600μlgd加入到cb3柱中，12000rpm/min離心30s，倒掉收集管內(nèi)的廢液。9)將700μlpw加入到cb3柱中，12000rpm/min離心30s，倒掉收集管內(nèi)的廢液。10)重復(fù)9)。11)12000rpm/min離心2min，甩干pw以免其對后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生影響，將cb3柱插入到一個干凈的1.5mltube內(nèi)，室溫放置5min。12)將洗脫液te放于65℃空氣浴上加熱。13)向cb3柱中央加入35μl洗脫緩沖液te，12000rpm/min離心30s。14)將1.5mltube中的洗脫緩沖液再次加入cb3柱中，12000rpm/min離心30s。15)使用nanodrop測定質(zhì)粒溶液的吸光度和濃度，一般而言a260/a280大于1.8，濃度大于10ng/μl可進行下一步實驗。16)抽取5μl左右載體進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有單一條帶且其大小在15000bp左右或以上的可進行下一步實驗。(4)pcr反應(yīng)獲得特異性切割部分附近的片段設(shè)計引物，使得pcr產(chǎn)物的大小在500-1500之間，同時可以覆蓋sgrna所覆蓋的序列范圍，引物距離sgrna切割位點各有200bp以上的距離。由于有些sgrna作用的位點在基因組上位置比較集中，故可以共用引物，則引物數(shù)量比sgrna數(shù)量顯著減少，表8列出了部分最常用的檢測引物及其可以檢測的sgrna(由上海生工公司合成)。順序大體代表引物常用程度。pcr反應(yīng)采用takaraprimestar體系如下：總pcr體系大小：50μl(一般為兩管)在pcr儀中使用如下pcr程序進行反應(yīng)：98℃5min，98℃10s，58℃15s，72℃50s)循環(huán)35次；72℃10min；4℃forever。1)使用1％瓊脂糖凝膠電泳，判斷條帶是否單一及有無正確大小的條帶。若條帶單一且大小正確，采用pcr產(chǎn)物電泳回收試劑盒；若條帶有大小正確但不單一，則采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒。2)對于回收的片段使用nanodrop檢測其濃度和吸光度，一般而a260/a280大于1.8，濃度大于20ng/μl可進行下一步實驗。(5)t7內(nèi)切酶i檢測突變片段t7內(nèi)切酶i可以識別雙鏈dna頸環(huán)或泡狀結(jié)構(gòu)等不完全匹配的部分，并將其切成兩部分。由于cas9/sgrna作用會引發(fā)基因組非同源末端修復(fù)機制并產(chǎn)生不同的隨機修復(fù)片段，當(dāng)混合有各種處理過的片段的pcr產(chǎn)物在一起進行梯度退火時，片段經(jīng)歷不斷的“解鏈-結(jié)合”的過程，使得兩端匹配但cas9/sgrna作用區(qū)不匹配的片段比例增加，而這種片段正可以被t7內(nèi)切酶i所切割，產(chǎn)生兩條條帶。1)將pcr產(chǎn)物與nebbuffer2及水按照以下的配方混合：h2ouptobuffer22μlpcr500μ放入pcr儀中，以如下程序進行多重梯度退火：95℃5min；95℃-85℃，每3秒鐘下降2℃；85℃1min；85℃-25℃，每秒鐘下降0.3℃，每逢5x℃停留1min；25℃forever。2)向處理過的pcr產(chǎn)物混合液中加入1μlt7endonuclease，放入37℃。pcr儀中溫浴2h。3)配置2％的瓊脂糖凝膠，向pcr產(chǎn)物中加入takara10×loading。4)輸出電泳圖，判斷cas9/sgrna在293t細(xì)胞系上的效率特性。當(dāng)前第1頁12