本發(fā)明涉及中藥有效成分的分離純化方法，具體為應用高速逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物(藥根堿、小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿單體)的方法。技術背景功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.)Carr或細葉十大功勞Mahoniafortunei(Lindl.)Fedde的干燥莖，其性味苦，寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。主治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、目赤腫痛、胃火牙痛，瘡癤癰腫。功勞木中生物堿類化合物主要為異喹啉類生物堿，包括藥根堿、巴馬汀和小檗堿，研究結果表明異喹啉類生物堿可以抑制自由基和脂氧合酶活性從而達到抗炎的作用。此外，生物堿的抗氧化能力還與其抗病性、抗逆性及延緩衰老有關?，F(xiàn)代藥理研究表明，功勞木還具有一定的逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的作用?，F(xiàn)有關于功勞木中生物堿類單體化合物分離制備的文獻方法主要采用反復硅膠柱層析和SephadexLH-20凝膠柱色譜，其局限性是費時費力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復柱層析對樣品有不可逆性吸附作用，分離得到生物堿單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術。高速逆流色譜(High-speedCounter-currentChromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題，使用其它液相色譜法進行制備型分離時，其分配效率會顯著降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分辨度，分離量大、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。高速逆流色譜能直接進大量粗提樣品或合成混合物，分離結果能達到相當高的純度，已廣泛應用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領域化學物質(zhì)的制備分離和純化。雖然現(xiàn)有技術中有利用高速逆流色譜分離中藥中生物堿的報道，本領域公知，高速逆流色譜分離中所用到的溶劑系統(tǒng)是影響分離結果的關鍵因素之一，常用到的溶劑有甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、氯仿、乙腈等，每一溶劑系統(tǒng)中所使用的溶劑至少為兩種，不同中藥成分所具有的成分，以及生物堿的種類和數(shù)量不一樣，中藥經(jīng)過提取得到的生物堿總樣的成分不同，所以針對不同的中藥如何選擇溶劑系統(tǒng)的溶劑種類、各溶劑之間的用量比例以及配合該溶劑系統(tǒng)選擇怎樣的流速、上樣量、轉(zhuǎn)速等等才能得到純度較高的生物堿單體是沒有參考價值的。非洲防己堿具有興奮子宮的作用，目前已知的來源為小檗科植物日本小檗BerberisthunbergiiDC根莖、毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch根莖、防己科植物黃藤FibraureatinetoriaLour根、非洲掌葉防己Jatrorrhizapalmata(DC.)Miers(J.columba.Miers)、罌粟科植物博克尼木BocconiafrutescesLinn葉、番荔枝科植物依南木EnantiachloranthaOliver根。目前，還沒有從功勞木中分離出非洲防己堿的有關報道，也沒有利用高速逆流色譜分離功勞木中生物堿的記載。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種應用高速逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種分離功勞木中生物堿類化合物的方法，應用高速逆流色譜分離，所述分離中所用到的條件是：溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：0.5mol·L-1鹽酸溶液＝3.5-4.5:1-2:1.5-2.5(優(yōu)選：4:1.5:2)，高速逆流色譜儀柱體積為200-400(優(yōu)選300mL)，上樣量200-500(優(yōu)選300mg)，轉(zhuǎn)速300-1000rpm(優(yōu)選800rpm)，上相為固定相，下相為流動相，流速1.5-2.5mL/min(優(yōu)選2.0mL/min)，固定相保留率71.67％，檢測波長250-260nm(優(yōu)選254nm)。所述：功勞木中生物堿類化合物的提取方法：(1)采用乙醇對功勞木藥材進行提取，將提取液真空濃縮至無醇味，得總提取物；(2)將總提取物調(diào)至酸性，石油醚萃取脫脂后，調(diào)整至堿性，攪拌沉淀，即為功勞木生物堿粗提物。應用高速逆流色譜分離的具體步驟如下：(1)將溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相；(2)取功勞木生物堿粗提物溶解于體積比為1:1的上相和下相的混合液中待用，所述功勞木生物堿粗提物與混合液的用量關系為20:1(g/L)；(3)首先使半制備型高速逆流色譜儀進樣閥處于進樣狀態(tài)，將固定相用泵以20mL·min-1流速灌滿色譜分離柱，停泵，開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，達到設定轉(zhuǎn)速時，設置流動相流速為1.5-2.5mL/min(優(yōu)選2.0mL/min)，開始泵流動相，達到流體動力學平衡后，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進入色譜分離柱，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖接收目標組分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得固體粉末。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的方法制備成本低于現(xiàn)有技術，操作簡便，效率高，可以較大批量從中藥功勞木中，分離制備出純度大于96％的藥根堿、小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿單體化合物的分離制備方法，本發(fā)明首次從中藥功勞木中分離出非洲防己堿。附圖說明圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為功勞木生物堿總樣分離的高速逆流色譜圖；圖3為生物堿總樣的高效液相色譜圖；圖4為藥根堿單體的高效液相色譜圖；圖5為小檗堿單體的高效液相色譜圖；圖6為巴馬汀單體的高效液相色譜圖；圖7為非洲防己堿單體的高效液相色譜圖；圖8為對比例1功勞木生物堿總樣分離的高速逆流色譜圖；圖9為對比例2功勞木生物堿總樣分離的高速逆流色譜圖。具體實施方式下面結合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1如圖1功勞木中單體制備流程圖所示。取功勞木藥材2kg粉碎后用95％乙醇回流提取3次(每次2h)，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味。將上述濃縮后的提取液，加鹽酸調(diào)節(jié)pH＝3，石油醚萃取3～5次除去脂溶性成分，萃取后的水層加氨水調(diào)節(jié)pH＝9，過濾得沉淀10.6g，即為所需生物堿總樣。應用高速逆流色譜分離純化功勞木生物堿總樣溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：0.5mol·L-1鹽酸溶液＝4:1.5:2，高速逆流色譜儀柱體積為300mL，上樣量300mg，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速2.0mL/min，固定相保留率71.67％，檢測波長254nm。具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相，取200mg功勞木生物堿粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合物中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300mL)等組成，首先使進樣閥處于進樣狀態(tài)，將固定相用泵以流速20mL·min-1灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達800rpm時，設置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相，達到流體動力學平衡后，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進入色譜分離柱。然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖2)接收目標成分，得藥根堿(15.1mg)，小檗堿(13.4mg)，非洲防己堿(8.6mg)，巴馬汀(17.3mg)和未知成分(13.2mg)，HPLC分析純度均為96％以上。利用高效液相色譜分析分離物，如圖3-圖7，液相條件：Kromasil100-5C18柱(4.6×250mmmm)，紫外檢測波長265nm，柱溫：25℃，流速：1.0mL/min，進樣量：10μL，流動相采用乙腈：鹽溶液(1％三乙胺溶液，用磷酸調(diào)pH＝3)＝25:75。結構鑒定：對分離得到的生物堿應用Agilent5973N質(zhì)譜儀和Varian600MHz核磁共振波譜儀分別進行MS，1HNMR譜的測定，所得數(shù)據(jù)如下：藥根堿：UV(λmax,MeOH):264,345nm.PositiveESI-MSm/z338[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.86(1H,s,H-8),8.98(1H,s,H-13),8.19(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.69(1H,s,H-1),6.86(1H,s,H-4),4.91(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.09(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.94(3H,s,2-OCH3),3.14(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).小檗堿：UV(λmax,MeOH):263and346nm.PositiveESI-MSm/z336[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.90(1H,s,H-8),8.96(1H,s,H-13),8.21(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.80(1H,s,H-1),7.09(1H,s,H-4),6.18(2H,s,2,3-OCH2O),4.94(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.10(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.21(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).非洲防己堿：UV(λmax,MeOH):263,345nm.PositiveESI-MSm/z338[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.88(1H,s,H-8),8.82(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.06(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.57(1H,s,H-1),7.06(1H,s,H-4),4.93(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.09(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.90(3H,s,3-OCH3),3.19(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).巴馬?。篣V(λmax,MeOH):272,345nm.PositiveESI-MSm/z352[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.90(1H,s,H-8),9.08(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.04(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.73(1H,s,H-1),7.10(1H,s,H-4),4.96(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.10(3H,s,10-OCH3),4.08(3H,s,9-OCH3),3.94(3H,s,2-OCH3),3.88(3H,s,3-OCH3),3.23(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).對比例1：二氯甲烷：甲醇：0.5mol.L-1鹽酸溶液＝5:2:3，流速：2mL.min-1，進樣量：200mg，固定相保留：60％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實施例1中的一樣。對比例2：二氯甲烷：甲醇：mol.L-1鹽酸溶液＝4:1.5:2，流速：2mL.min-1，進樣量：200mg，固定相保留：66.7％，轉(zhuǎn)速：800rpm。由圖8和圖9可以看出，對比例1與實施例1是在溶劑系統(tǒng)中將三氯甲烷換成了二氯甲烷，并且將溶劑系統(tǒng)的比例發(fā)生了改變，就導致各有效成分之間不能分離，對比例2僅僅是在溶劑系統(tǒng)中將三氯甲烷換成了二氯甲烷，溶劑系統(tǒng)的比例都沒有改變，同樣導致了各有效成分之間不能分離。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)只有本發(fā)明的實驗條件才能將功勞木中的生物堿很好的分離出來，并且得到非洲防己堿。上述雖然結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。