pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物的方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種中藥有效成分的分離純化方法，具體為應(yīng)用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物(藥根堿、小檗堿、非洲防己堿、巴馬汀單體)的方法。

背景技術(shù)：
功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.)Carr或細葉十大功勞Mahoniafortunei(Lindl.)Fedde的干燥莖，其性味苦，寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。主治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、目赤腫痛、胃火牙痛，瘡癤癰腫。功勞木中生物堿類化合物主要為異喹啉類生物堿，包括藥根堿、巴馬汀和小檗堿，研究結(jié)果表明異喹啉類生物堿可以抑制自由基和脂氧合酶活性從而達到抗炎的作用。此外，生物堿的抗氧化能力還與其抗病性、抗逆性及延緩衰老有關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究表明，功勞木還具有一定的逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的作用?，F(xiàn)有關(guān)于功勞木中生物堿類單體化合物分離制備的文獻方法主要采用反復(fù)硅膠柱層析和SephadexLH-20凝膠柱色譜，其局限性是費時費力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對樣品有不可逆性吸附作用，分離得到生物堿單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術(shù)。高速逆流色譜(High-speedCounter-currentChromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題。pH-區(qū)帶精制逆流色譜(pH-Zone-RefiningCountercurrentChromatography)則是在普通的高速逆流色譜儀器的基礎(chǔ)上，通過對分離樣品所用的溶劑系統(tǒng)的組成的調(diào)配，采用化學(xué)的手段，使樣品組分的色譜分離過程增添了按pH區(qū)帶聚集的特征，同時，使組分的洗脫過程表現(xiàn)為類似置換(頂替)色譜(DisplacementChromatography)的洗脫過程，因此，它的色譜圖不再是高斯分布的色譜峰形系列，而成為按pH值的大小排列的邊界陡削的矩形區(qū)帶系列，其結(jié)果是能把相同容積的逆流色譜儀器的分離制備量提高數(shù)倍乃至十倍。雖然現(xiàn)有技術(shù)中有利用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離中藥中生物堿的報道，本領(lǐng)域公知，pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離中所用到的溶劑系統(tǒng)是影響分離結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，常用到的溶劑有甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、氯仿、乙腈等，每一溶劑系統(tǒng)中所使用的溶劑至少為兩種，不同中藥成分所具有的成分，以及生物堿的種類和數(shù)量不一樣，中藥經(jīng)過提取得到的生物堿總樣的成分不同，所以針對不同的中藥如何選擇溶劑系統(tǒng)的溶劑種類、各溶劑之間的用量比例以及配合該溶劑系統(tǒng)選擇怎樣的流速、上樣量、轉(zhuǎn)速等等才能得到純度較高的生物堿單體是沒有參考價值的。非洲防己堿具有興奮子宮的作用，目前已知的來源為小檗科植物日本小檗BerberisthunbergiiDC根莖、毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch根莖、防己科植物黃藤FibraureatinetoriaLour根、非洲掌葉防己Jatrorrhizapalmata(DC.)Miers(J.columba.Miers)、罌粟科植物博克尼木BocconiafrutescesLinn葉、番荔枝科植物依南木EnantiachloranthaOliver根。目前，還沒有從功勞木中分離出非洲防己堿的有關(guān)報道，也沒有利用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離功勞木中生物堿的記載。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種分離功勞木中生物堿類化合物的方法，應(yīng)用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離，所述的分離中所用到的條件是：溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：水＝3.5-4.5:2.5-3.5:2.5-3.5(優(yōu)選4:3:3)，pH-區(qū)帶精制逆流色譜儀柱體積為200-400(優(yōu)選300mL)，上樣量2-5g(優(yōu)選3g)，轉(zhuǎn)速300-1000rpm(優(yōu)選800rpm)，上相為固定相，下相為流動相，流速1.5-2.5mL/min(優(yōu)選2.0mL/min)，固定相保留率35.71％，檢測波長250-260nm(優(yōu)選254nm)。所述：功勞木中生物堿類化合物的提取方法：(1)采用乙醇對功勞木藥材進行提取，將提取液真空濃縮至無醇味，得總提取物；(2)將總提取物調(diào)至酸性，石油醚萃取脫脂后，調(diào)整至堿性，攪拌沉淀，即為功勞木生物堿粗提物。應(yīng)用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離的具體步驟如下：(1)將溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相，上相加入60mM鹽酸，下相加入7.5mM三乙胺；(2)取功勞木生物堿粗提物溶解于體積比為1:1的上相和下相的混合液中待用，所述功勞木生物堿粗提物與混合液的用量關(guān)系為3:10(g/mL)；(3)首先使半制備型高速逆流色譜儀進樣閥處于進樣狀態(tài)，將固定相用泵以20mL·min-1流速灌滿色譜分離柱，停泵，開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，達到設(shè)定轉(zhuǎn)速時，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進入色譜分離柱，設(shè)置流動相流速為1.5-2.5mL/min(優(yōu)選2.0mL/min)，開始泵流動相，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖3)接收目標成分，，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得固體粉末。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的方法制備成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡便，效率高，可以較大批量從中藥功勞木中，分離制備出純度大于96％的藥根堿、小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿單體化合物的分離制備方法，本發(fā)明首次從中藥功勞木中分離出非洲防己堿。附圖說明圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為功勞木生物堿總樣分離的pH-區(qū)帶精制逆流色譜圖；圖3為生物堿總樣的高效液相色譜圖；圖4為藥根堿單體的高效液相色譜圖；圖5為小檗堿單體的高效液相色譜圖；圖6為巴馬汀單體的高效液相色譜圖；圖7為非洲防己堿單體的高效液相色譜圖；圖8為對比例1功勞木生物堿總樣分離的pH-區(qū)帶精制逆流色譜；圖9為對比例2功勞木生物...