本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種能與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體及其用途。

背景技術(shù)：

成纖維細胞生長因子21(fibroblastgrowthfactor21，fgf21)是成纖維細胞生長因子家族(fgf19，fgf21和fgf23)的一名新成員，屬于分泌型蛋白質(zhì)(itohetal.,(2004)trendgenet.20:563-69)。fgfs與存在于細胞表面的生長因子受體(fgfrs)結(jié)合，將信號傳遞到細胞內(nèi)。fgfrs有4種亞型(fgfrl-4)，屬跨膜蛋白，主要由三個部分組成：即胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，包含多個可變剪切體，如fgfr1c，fgfr2c，fgfr3c和fgfr4。與多數(shù)生長因子受體一樣，fgfrs都是酪氨酸激酶受體，在與配體結(jié)合后發(fā)生二聚化，從而激活酪氨酸激酶活性，導致下游信號活化，包括mapks、raf1、akt1及stats(kharitonenkovetat.,(2008)biodrugs22:37-44)。fgf21不能與肝素特異性結(jié)合，在肝素的參與下，也不能與可溶性fgfrs結(jié)合，它需要另外一種跨膜蛋白β-klotho的參與，才能穩(wěn)定地結(jié)合fgfr1c，從而激活fgf21的信號轉(zhuǎn)導。在對小鼠3t3-l1細胞(表面主要表達fgfrlc，低表達fgfr2c)的研究表明，β-klotho作為支架蛋白，先與fgfr1c形成復合物，通過變構(gòu)活化后，促進fgf21與fgfr1c的結(jié)合，引起fgfr受體二聚化，激活下游信號通路(ogawaetal.,(2007)pnas104:7432-7)。

過表達fgf21的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為低胰島素、低膽固醇及低甘油三酯，胰島素敏感性提高，阻止高脂食物引起的體重增加(kharitonenkovetal.,(2005)jclininvest115:1627-35)；相反，fgf21基因敲除小鼠表現(xiàn)為體重增加、糖耐量受損。這些數(shù)據(jù)表明，fgf21通過作用于脂肪組織及胰腺來改善血糖、三酰甘油和胰高血糖素，改善胰島β細胞的功能，從而預防飲食誘導的肥胖及胰島素抵抗。fgf21也被證明可作為一種主要的內(nèi)源性調(diào)控因子，在禁食和酮癥時起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。更為重要的是，通過給予fgf21，不會導致低血糖癥。因此，作為一種不依賴胰島素的血糖調(diào)節(jié)因子，fgf21目前已被看作治療ii型糖尿病的潛在的新型治療手段。

盡管目前有很多通過基因工程的方法改造天然的fgf21，使之成為新的治療藥物的例子(adamsetal.,(2013)plosone8(6):e65763)，但是，改造后的fgf21在有些藥學特性還遠遠不能滿足要求，比如藥代動力學、穩(wěn)定性、溶解性等等。而另外一種可行的辦法是產(chǎn)生全新的、具有類似fgf21活性的蛋白質(zhì)，比如抗體。

β-klotho已被證明是fgf19和fgf21所必需的共受體，它特異性地表達在肝臟、胰腺及脂肪組織中(ogawaetal.,(2007)pnas104:7432-7)。相對于fgfrs廣泛表達于各種組織，加上單克隆抗體具有很好的結(jié)合特異性，給予抗β-klotho抗體可以有效地降低藥物的毒副作用。本發(fā)明提供了一類新的，可以和β-klotho跨膜蛋白特異性結(jié)合的抗體，通過蛋白與蛋白之間的相互作用，模擬fgf21的作用，激活人β-klotho/fgfr1c復合受體，引起細胞內(nèi)erk的磷酸化，以及制備和應用這類生物大分子的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體，能與成纖維細胞生長因子21(fibroblastgrowthfactor21，fgf21)的輔助受體β-klotho特異性結(jié)合，可以激活人β-klotho/fgfr1c復合受體的功能，本發(fā)明抗體可以應用于治療或預防哺乳動物中的ii型糖尿病以及相關(guān)疾病。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種能與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.選自以下序列之一的輕鏈cdr3序列:

與選自l1-l3的輕鏈cdr3序列：seqidno:15、seqidno:24、seqidno:34其中之一相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr3序列；

優(yōu)選的，與選自l1-l3的輕鏈cdr3序列：seqidno:15、seqidno:24、seqidno:34其中之一相差總共不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr3序列；更優(yōu)選，與選自l1-l3的輕鏈cdr3序列：seqidno:15、seqidno:24、seqidno:34其中之一相差總共不超過一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr3序列。

b.選自以下序列之一的重鏈cdr3序列：

與選自h1-h3的重鏈cdr3序列：seqidno:10、seqidno:19、seqidno:29其中之一相差總共不超過四個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr3序列；

優(yōu)選的，與選自h1-h3的重鏈cdr3序列：seqidno:10、seqidno:19、seqidno:29其中之一相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr3序列；

優(yōu)選的，與選自h1-h3的重鏈cdr3序列：seqidno:10、seqidno:19、seqidno:29其中之一相差總共不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr3序列；

更優(yōu)選，與選自h1-h3的重鏈cdr3序列：seqidno:10、seqidno:19、seqidno:29其中之一相差總共不超過一個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr3序列。

c.方案a的輕鏈cdr3序列和方案b的重鏈cdr3序列。

作為優(yōu)選，所述抗體還包含以下方案的一種或幾種組合的氨基酸序列：

a.選自以下之一的輕鏈cdr1序列：

與選自l1-l3的輕鏈cdr1序列：seqidno:13、seqidno:22、seqidno:32其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr1序列；

優(yōu)選的，與選自l1-l3的輕鏈cdr1序列：seqidno:13、seqidno:22、seqidno:32其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr1序列；

更優(yōu)選，與選自l1-l3的輕鏈cdr1序列：seqidno:13、seqidno:22、seqidno:32其中之一相差不超過一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr1序列。

b.選自以下之一的輕鏈cdr2序列：

與選自l1-l3的輕鏈cdr2序列：seqidno:14、seqidno:23、seqidno:33其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr2序列；

優(yōu)選的，與選自l1-l3的輕鏈cdr2序列：seqidno:14、seqidno:23、seqidno:33其中之一相差不超過一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈cdr2序列。

c.選自以下之一的重鏈cdr1序列：

與選自h1-h3的重鏈cdr1序列：seqidno:8、seqidno:18、seqidno:27其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr1序列；

優(yōu)選的，與選自h1-h3的重鏈cdr1序列：seqidno:8、seqidno:18、seqidno:27其中之一相差不超過一個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr1序列。

d.選自以下之一的重鏈cdr2序列：

與選自h1-h3的重鏈cdr2序列：seqidno:9、seqidno:28其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr2序列；

優(yōu)選的，與選自h1-h3的重鏈cdr2序列：seqidno:9、seqidno:28其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr2序列；更優(yōu)選，與選自h1-h3的重鏈cdr2序列：seqidno:9、seqidno:28其中之一相差不超過一個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈cdr2序列。 一種能與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體，

所述抗體包含以下方案之一：

方案a：包含輕鏈cdr1序列、輕鏈cdr2序列、輕鏈cdr3序列中的一種或幾種的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈cdr1序列選自seqidno:13、seqidno:22、seqidno:32其中之一；所述輕鏈cdr2序列選自seqidno:14、seqidno:23、seqidno:33其中之一；所述輕鏈cdr3序列選自seqidno:15、seqidno:24、seqidno:34其中之一；

方案b：包含重鏈cdr1序列、重鏈cdr2序列、重鏈cdr3序列中的一種或幾種的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈cdr1序列選自seqidno:8、seqidno:18、seqidno:27其中之一；所述重鏈cdr2序列選自seqidno:9、seqidno:28其中之一；所述重鏈cdr3序列選自seqidno:10、seqidno:19、seqidno:29其中之一；

方案c：方案a的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和方案b的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的組合。

一種能與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列：

方案a.選自以下選項之一的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：

i.具有與選自l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：seqidno:16、seqidno:25、seqidno:35其中之一至少80％相同的氨基酸序列；

ii.具有與編碼l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的多聚核苷酸序列：seqidno:12、seqidno:21、seqidno:31其中之一至少80％相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列；

方案b.選自以下選項之一的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：

i.具有與h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：seqidno:11、seqidno:20、seqidno:30其中之一至少80％相同的氨基酸序列；

ii.具有與編碼h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的多聚核苷酸序列：seqidno:7、seqidno:17、seqidno:26其中之一至少80％相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列；

方案c.方案a的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和方案b的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的組合。

作為優(yōu)選，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列：

方案a.選自l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：seqidno:16、seqidno:25、seqidno:35其中之一的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列；

方案b.選自h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列:seqidno:11、seqidno:20、seqidno:30其中之一的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列；

方案c.方案a的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和方案b的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的組合。

作為優(yōu)選，方案c中方案a的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列與方案b的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的組合選自以下之一：l1h1、l2h2、l3h3。

作為優(yōu)選，所述抗體為鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結(jié)合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、fab片段、f(ab’)x片段、結(jié)構(gòu)域抗體、igd抗體、ige抗體、igm抗體、iggl抗體、igg2抗體、igg3抗體、igg4抗體中的一種。

作為優(yōu)選，當所述抗體與人β-klotho受體結(jié)合時：

a.以與成纖維細胞生長因子21(fgf21)基本相同的kd與人β-klotho受體結(jié)合；

b.以與fgf21基本相同的ec50激活人β-klotho/fgfr1c受體復合物；

c.在人β-klotho受體上與fgf21沒有交叉競爭結(jié)合。

作為優(yōu)選，所述抗體為鼠源抗體或人源化抗體時，當其與人β-klotho受體結(jié)合時：

a.以≤200nm的ec50值增強人β-klotho信號傳導；

b.在ii型糖尿病大鼠模型或ii型糖尿病小鼠模型中改善ii型糖尿??；

c.a和b兩者。

一種藥用組合物，其包含與藥用可接受載體混合的本發(fā)明的抗體。

作為優(yōu)選，所述抗體選自鼠源抗體或人源化抗體。

一種分離的核酸，其包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域兩者的多聚核苷酸序列。

作為優(yōu)選，編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸序列選自seqidno:12、seqidno:21、seqidno:31其中之一；

編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸序列選自seqidno:7、seqidno:17、seqidno:26其中之一。

一種重組表達載體，其包含本發(fā)明的核酸。

一種宿主細胞，其包含本發(fā)明的載體。

一種生產(chǎn)能與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體的方法，包括在允許表達 所述抗體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞。

一種本發(fā)明的藥用組合物在制備用于治療ii型糖尿病以及相關(guān)病癥的藥物中的用途。

本發(fā)明的有益效果是：

(a)本發(fā)明的單克隆抗體針對人β-klotho受體有高親和力和激活活性，在細胞水平可以明顯激活β-klotho/fgfr1c復合受體信號通路。

(b)本發(fā)明的單克隆抗體針對人β-klotho受體，目前在國內(nèi)外均無針對相同靶標的抗體專利或藥物。

因此，本發(fā)明的高親和力、高特異性的單克隆抗體在臨床上具有重要的價值。

附圖說明

圖1顯示了流式細胞術(shù)(facs)檢測雜交瘤細胞上清的anti-klb(a-1，a-3)與人klb的特異性結(jié)合結(jié)果。從左至右：灰色峰為陰性對照，虛線表示anti-klb與cho-dhfr的結(jié)合曲線，實線表示anti-klb與cho-dhfr-klb的結(jié)合曲線。

圖2顯示了流式細胞術(shù)(facs)檢測重組表達的anti-klb(a-1，a-3)與人klb的特異性結(jié)合結(jié)果。從左至右：灰色峰為陰性對照，虛線表示anti-klb與cho-dhfr的結(jié)合曲線，實線表示anti-klb與cho-dhfr-klb的結(jié)合曲線。

圖3顯示了報告基因?qū)嶒灆z測重組表達的anti-klb(a-1，a-2，a-3)與 人klb的濃度梯度激活曲線(ec50＝3.29nm，r²＝0.94)(a-1),(ec50＝5.89nm，r²＝0.95)(a-2)，(ec50＝33.90nm，r²＝0.97)(a-3)。

圖4顯示了重組表達的anti-klb(a-1，a-2)在10nm的濃度下，均可引起細胞內(nèi)erk的磷酸化升高。

具體實施方式

下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

本發(fā)明涉及抗體例如可與人β-klotho受體(klb)特異性結(jié)合的抗體。這些包括與人klb結(jié)合并激活人β-klotho/fgfr1c復合受體的抗體。在一個實施方案中提供了包括激活性抗體的可改善動物模型ii型糖尿病的鼠源抗體。

本發(fā)明進一步提供可特異性結(jié)合至人β-klotho受體的抗體相關(guān)的組合物、試劑盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含編碼與β-klotho受體結(jié)合的多肽的全部或部分的多聚核苷酸，例如編碼全部或部分抗β-klotho受體抗體、抗體片段或抗體衍生物的核酸。本發(fā)明進一步提供包含該類核酸的載體和質(zhì)粒以及包含該類核酸和/或載體和質(zhì)粒的細胞和細胞系。所提供方法包括，例如，制備、鑒定或分離與人klb結(jié)合的抗體例如抗klb抗體的方法，測定該抗體是否與klb結(jié)合的方法、以及將 與klb結(jié)合的抗體給予動物模型的方法。

定義

使用標準的單字母或三字母縮寫表明多聚核苷酸和多肽序列。除非另外指明，多肽序列的氨基端在左而它們的羧基端在右，單鏈核酸序列和雙鏈核酸序列的上游鏈的5’端在左而它們的3’端在右。多肽的具體部分可由氨基酸殘基編號表示，例如氨基酸80至130，或由該位點的實際殘基表示例如lys80至lys130。也可通過解釋其與參比序列的差異描述具體的多肽或多聚核苷酸序列。具體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸和多肽可表示為l1(“輕鏈可變結(jié)構(gòu)域1”)，h1(“重鏈可變結(jié)構(gòu)域1”)。包含輕鏈和重鏈的抗體可通過結(jié)合輕鏈的名稱和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的名稱表示。例如，“l(fā)1h1"表示包含l1輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和h1重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體。

除非本文另外定義，與本文相關(guān)的科學和技術(shù)術(shù)語應具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的含義。

抗體

一方面，本發(fā)明提供與人β-klotho受體特異性結(jié)合的抗體(例如，抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體突變蛋白和抗體變異體)。在一個實施方案中該抗體為鼠源抗體或其人源化抗體。

根據(jù)本發(fā)明的抗體包括與人β-klotho受體結(jié)合并通過β-klotho受體激活人β-klotho/fgfr1c復合受體介導信號傳導的抗體。在一個實施方案中，該抗體的ec50值為200nm或更低。另一方面，該抗體與β-klotho受體特異性結(jié)合，激活信號傳導并顯示出治療性生物作用，例如改善動物模 型的ii型糖尿病。在一個實施方案中，該抗體為與β-klotho受體特異性結(jié)合并通過人β-klotho/fgfr1c復合受體激活信號傳導的鼠源抗體。在另一實施方案中，該抗體為與β-klotho體特異性結(jié)合、通過人β-klotho/fgfr1c復合受體激活信號傳導并可以改善ii型糖尿病的鼠源抗體。

在一個實施方案中，該抗體包含與下表中a-1至a-3的cdr序列各相差5、4、3、2、1或0個單氨基酸添加、替換和/或缺失的序列。如本文所使用，與表1所示的cdr序列最多不超過例如四個氨基酸添加、瞽換和或缺失的cdr序列指與表1中的序列相比具有4、3、2、1或0個單氨基酸添加、替換和/或缺失的序列。

在另一個實施方案中，該抗體包含一個或多個cdr一致序列(consensussequences)。提供了輕鏈cdr1、cdr2、cdr3和重鏈cdr1、cdr2和cdr3的一致序列。

抗體a-1-a-3的輕鏈cdrs以及示例性抗體a-1-a-3的重鏈cdrs見表1。a-1至a-3對應于下文的ll至l3以及下文的h1至h3。也顯示了編碼cdrs氨基酸序列的多聚核苷酸序列。

另一方面，本發(fā)明提供包含選自l1-l3的輕鏈可變區(qū)或選自h1-h3的重鏈可變區(qū)及其片段、衍生物、突變蛋白或變異體的抗體。可用名稱“l(fā)xhy”表示該類抗體，其中“x”對應于輕鏈可變區(qū)并且“y”對應于重鏈可變區(qū)。例如，l2h1指具有包含如下文表2所示l2氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含h1氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體。本發(fā)明抗體包括例如包含選 自組合l1h1、l2h2、l3h3的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的組合。在一個實施方案中，該抗體為鼠源抗體或其人源化抗體。

表1：輕、重鏈可變區(qū)序列

表2提供了編碼示例性klb抗體的可變輕鏈和可變重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多聚核苷酸(dna)序列。

表2：輕、重鏈可變區(qū)多聚核苷酸和氨基酸序列

本發(fā)明抗體的具體實施方案包含與一個或多個上文所列cdrs和/或frs(骨架區(qū))的氨基酸序列相同的一個或多個氨基酸序列。在一個實施方案中，該抗體包含上文所列輕鏈cdr1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的輕鏈cdr2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的輕鏈cdr3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的重鏈cdr1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的重鏈cdr2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的重鏈cdr3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的輕鏈fr1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列的輕鏈fr2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列輕鏈fr3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列輕鏈fr4序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列重鏈fr1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列重鏈fr2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列重鏈fr3厚列。在另一個實施方案中，該抗體包含上文所列重鏈fr4序列。

在另一個實施方案中，至少一個抗體的cdr3序列與來自a-1至a-3的cdr3序列的差異最多不超過6、5、4、3、2、1或0個單氨基酸添加、替換和/或缺失。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈cdr3序列與上述a-1 至a-3的輕鏈cdr3序列的差異不得超過6、5、4、3、2、1或0個單氨基酸添加、替換和/或缺失并且抗體的重鏈cdr3序列與上文所述a-1至a-3的重鏈cdr3序列的差異最多不超過6、5、4、3、2、1或0個單氨基酸添加、替換和/或缺失。在另一個實施方案中，抗體進一步包含1、2、3、4或5個cdr序列，各序列獨自與a-1至a-3的cdr序列的差異最多不超過6、5、4、3、2、1或0個單氨基酸差異。在另一個實施方案中，抗體包含上文所列輕鏈可變區(qū)的cdrs和重鏈可變區(qū)的cdrs。在另一實施方案中，抗體包含上文所述的1、2、3、4、5和/或6個一致cdr序列。在進一步的實施方案中，該抗體包含l1h1、l2h2、l3h3中任何之一的cdrs。在一個實施方案中，該抗體為鼠源抗體。

在一個實施方案中，該抗體(例如抗體或抗體片段)包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含與選自l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個氨基酸差異的氨基酸序列，其中各該序列的差異獨立為一個氨基酸殘基的缺失、插入或替換。在另一個實施方案中，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與選自l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在另一個實施方案中，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與下文所列l(wèi)1-l3多聚核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。在另一個實施方案中，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含在中等條件下與編碼選自l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸互補序列雜交的多聚核苷酸編碼的氨基酸序列。在另一個實施方棠中，該輕鏈可變結(jié) 構(gòu)域包含在嚴格條件下與編碼選自l1-l3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸的互補序列雜交的多聚核苷酸編碼的氨基酸序列。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，該可變結(jié)構(gòu)域包含選自h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個殘基存在差異的氨基酸序列，其中各該序列差異獨立為一個氨基酸的缺失、插入或替換。在另一個實施方案中，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與選自h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在另一個實施方案中，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含在中等嚴格條件下與編碼選自h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸互補序列雜交的多聚核苷酸編碼的氨基酸序列。在一個實施方案中，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含在嚴格條件下與編碼選自h1-h3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸互補序列雜交的的多聚核苷酸編碼的氨基酸序列。

生產(chǎn)鼠單克隆抗體的可選擇方法為將雜交瘤細胞注入同系基因小鼠的腹膜腔，例如經(jīng)處理(例如姥鮫烷初次免疫)促進形成包含單克隆抗體的腹水的小鼠?？赏ㄟ^多種已確立的技術(shù)分離和純化單克隆抗體。該類分離技術(shù)包括使用蛋白a-瓊脂糖的親和色譜法、分子排阻色譜法和高子交換色譜法(參見，例如，coligan第2.7.1-2.7.12頁和第2.9.1-2.9.3頁；baines等，“purificationofimmunoglobuling(igg),”methodsinmolecularbiology，第10卷，第79-104頁(thehumanapress，inc.，1992)?？墒褂没诳贵w的特殊性質(zhì)(例如，重鏈或輕鏈同種型、結(jié)合特異性等)篩選的適當配基通過親 和色譜法純化單克隆抗體。固定化于固體載體的適當配基的實例包括蛋白a、蛋白g、抗恒定區(qū)(輕鏈或重鏈)抗體、抗獨特型抗體以及tgf-p結(jié)合蛋白或其片段或變異體。

可使用抗體結(jié)合位點中央的互補決定區(qū)(cdrs)的分子進化分離親和性增加的抗體，例如對c-erbb-2親和性增加的抗體，如schier等，1996，j.mol.biol.263:551所述。因此，該類技術(shù)可用于制備人β-klotho受體的抗體。

例如可在檢測是否存在β-klotho受體的體外或體內(nèi)測定法中使用針對人β-klotho受體的抗體。

也可通過任何傳統(tǒng)技術(shù)制備抗體。例如，可從天然表達這些抗體的細胞將其純化(例如，可從生產(chǎn)抗體的雜交瘤將其純化)或使用本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)在重組表達系統(tǒng)中生產(chǎn)。參見，例如，monoclonalantibodies,hybridomas:anewdimensioninbiologicalanalyses,kennet等編輯，plenumpress(1980)；和antibodies:alaboratorymanual,harlowandland編輯,coldspringharborlaboratorypress(1988)。這在下文的核酸部分討論。

可通過任何已知技術(shù)制備抗體并篩選期望性質(zhì)。一些技術(shù)涉及分離編碼相關(guān)抗體(例如，抗β-klotho受體抗體)的多肽鏈(或其部分)的核酸，并通過重組dna技術(shù)操作核酸。該核酸可與另一相關(guān)核酸融合或經(jīng)修飾(例如通過誘變或其它傳統(tǒng)技術(shù))以添加、缺失或替換一個或多個氨基酸殘基。

在另一方面本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明多肽或其部分的核酸的載體。 載體的實例包括但是不限于質(zhì)粒、病毒載體、非游離基因哺乳動物載體和表達載體，例如重組表達載體。

本發(fā)明的重組表達載體可包含適于該核酸在宿主細胞中表達的形式的本發(fā)明核酸。該重組表達載體包括一個或多個調(diào)控序列，基于用于表達的宿主細胞進行篩選，其與該預表達的核酸序列可操作性相連。調(diào)控序列包括引導核苷酸序列在多個種類宿主細胞中組成型表達的(例如，sv40早期基因增強劑、勞斯氏肉瘤病毒啟動子和細胞巨化病毒啟動子)，引導僅在某些宿主細胞中核苷酸序列的表達的(例如，組織特異調(diào)控序列，參見voss等，1986，trendsbiochem.sci.11:287，maniatis等，1987，science236：1237，其完整內(nèi)容以參考形式并于本文)以及引導核苷酸序列響應具體處理或條件的誘導型表達的(例如，原核和真核系統(tǒng)二者中的四環(huán)霉素反應(tet-responsive)啟動子和/或鏈霉素反應啟動子)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解表達載體的設(shè)計取決于例如用于轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需蛋白表達水平等因素。本發(fā)明的表達載體可引入宿主細胞，藉此生產(chǎn)由本文所述核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

另一方面，本發(fā)明提供可引入本發(fā)明表達載體的宿主細胞。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。原核宿主細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。更高級的真核細胞包括昆蟲細胞、酵母細胞以及哺乳動物源的確立細胞系。適當哺乳動物宿主細胞系的實例包括中國倉鼠卵巢(cho)細胞或它們的衍生物例如veggiecho和在無血清培養(yǎng)基中生長的相關(guān)細胞系(參見rasmussen等，1998，cytotechnology28:31)或 cho株dxb-11，其缺失dhfr(參見urlaub等，1980，proc.natl.acad,sci.usa77:4216-20)。其它cho細胞系包括cho-k1(atcc#ccl-61)、em9(atcc#crl-1861)，和uv20(atcc#crl-1862)，其它宿主細胞包括猴腎細胞的cos-7系(atcc#crl-1651)(參見gluzman等，1981，cell23:175)、l細胞、c127細胞、3t3細胞(atccccl-163)，am-1/d細胞(描述于美國專利序列號6210924)、hela細胞、bhk(atcccrl-10)細胞系、來源于非洲綠猴腎細胞系cv1的cv1/ebna細胞系(atccccl-70)(參見mcmahan等，1991，emboj.10:2821)、人胚腎細胞例如293，293ebna或msr293、人上皮a431細胞、人c010205細胞、其它經(jīng)轉(zhuǎn)化靈長動物細胞系、正常二倍體細胞、來源于初生組織體外培養(yǎng)物的細胞株、初移植體、hl-60、u937、hak或jurkat細胞。用于細菌、真菌、酵母和哺乳細胞宿主的適當克隆和表達載體描述于pouwels等(cloningvectors：alaboratorymanual，elsevier，1985)。

可通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體dna引入原核或真核細胞中。對于穩(wěn)定的哺乳動物轉(zhuǎn)染而言，取決于使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，已知只有一小部分細胞可將外源dna鏊合入它們的基因組中。為了鑒定和篩選這些整合子，通常將編碼篩選標記(例如抗生素抗性)的基因與所關(guān)注基因一起引入宿主細胞。優(yōu)選的篩選標記包括可賦予藥物(如g418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。在其它方法中可通過藥物篩選鑒別包含被引入核酸的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(例如，整合了篩選基因的細胞可存活，而其它細胞則死亡)。

可在提高多肽表達的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化細胞，可通過常規(guī)蛋白純化方法回收多肽。一種該純化方法描述于下文實施例。預用于本文的多肽包括基本同源的重組哺乳動物抗β-klotho受體抗體多肽，其基本不含污染性內(nèi)源材料。

適應癥

糖尿病尤其是ii型糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為全世界日益嚴重的問題。通常，該疾病由胰臟β細胞胰島素生成受損引起。在ii型糖尿病(此疾病最常見的形式)中，人們認為遺傳和環(huán)境因素聯(lián)合引起β細胞衰竭，使得在人體中引起胰島素分泌和活性受損以及胰島素抵抗。一般認為肥胖癥是促使成人甚至兒童中ii型糖尿病增加的病癥。

人們還認為血脂異常，或者異常hdl(高密度脂蛋白)和ldl(低密度脂蛋白)均與ii型糖尿病相關(guān)。ii型糖尿病的特征為肌肉和其它器官不能響應正常循環(huán)濃度的胰島素。隨后胰臟β細胞分泌胰島素增多，即高胰島素血癥的病癥。最終β細胞無法再補償，導致葡萄糖耐量降低、空腹葡萄糖濃度受損、慢性高血糖和組織損傷。此外，人們認為早發(fā)ii型糖尿病與血脂異常，或者異常hdl(高密度脂蛋白)和ldl(低密度脂蛋白)有關(guān)。代謝綜合癥患者都表現(xiàn)血脂異常和高血糖癥。

本發(fā)明提供抗原結(jié)合蛋白，尤其是可與人β-klotho受體體內(nèi)結(jié)合、降低動物模型血糖濃度的人類抗體?？乖Y(jié)合蛋白還可改善葡萄糖耐量。在一個實施方案中，本發(fā)明提供具有體內(nèi)效價的人源化抗體。對ob/ob小鼠單次注射抗體的作用可在注射后數(shù)天內(nèi)降低血糖，為高血糖、ii型糖尿病 以及相關(guān)病癥提供了有效、持久的治療。單次注射抗體也可改善在下文所述食蟹猴上進行的葡萄糖耐量試驗(gtt)中血樣的葡萄糖清除率(改善葡萄糖耐量)。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白，尤其是人類抗體可用于降低血液或血漿葡萄糖，改善葡萄糖耐量降低，改善空腹葡萄糖水平以及改善血脂異常。這樣，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白，尤其是人類抗體可用于治療高血糖癥、ii型糖尿病、代謝綜合癥和包括血脂異常的其它相關(guān)癥狀。此外，已顯示降低血糖可在某些情況下用于預防和治療具體的癌癥例如結(jié)腸癌，如richardson等，natureclinpractoncol2:48-53(2005)；giovannucci等，gastroenterology132:2208-2225(2007)；krone等，integrativecancerther4:25-31(2005)；chang等，diabetologia46:595-607(2003)；jee等，yonseimedj46:449-55(2005)所述。

本發(fā)明提供可與人β-klotho受體特異性結(jié)合，改善動物模型ii型糖尿病的抗體?？梢悦黠@改善動物模型的ii型糖尿病的癥狀。

治療方法

另一方面，治療受試者的方法，包括給予治療劑量的本發(fā)明提供的抗體。在一個實施方案中，抗體為鼠源抗體或人源化抗體。本文中，術(shù)語“受試者”指哺乳動物，包括人類，可與術(shù)語“患者”交替使用。鼠源抗體或其人源化抗體可用于治療和控制患者體內(nèi)ii型糖尿病為特點的病癥或癥狀。術(shù)語“治療”包括減輕或預防至少一種癥狀或病癥的其它方面，或者減輕疾病嚴重性，等等。本發(fā)明的抗體不需要產(chǎn)生完全治愈的效果，或根除疾病的所有癥狀或表現(xiàn)，即可構(gòu)成有效治療劑。如相關(guān)領(lǐng)域所公認，作為治療劑 的藥物可減少給定疾病狀態(tài)的嚴重程度，但不需消除疾病的所有表現(xiàn)即可被認為是有效的治療劑。相似地，預防給藥治療不需在預防癥狀出現(xiàn)上完全有效即可構(gòu)成有效預防劑。只減少疾病的影響(例如，通過減少其癥狀的數(shù)量或嚴重度，或通過提高另一治療效果，或通過產(chǎn)生另一有效作用)，或者減少受試者中疾病發(fā)生或加重的可能性就已經(jīng)足夠。本發(fā)明的一個實施方案涉及包含以足以誘導反應具體病癥嚴重性的指示劑高于基線水平的持續(xù)改善的量和時間給予患者抗體的方法。

給藥劑量和頻率可根據(jù)以下因素而改變：給藥途徑、所用具體抗體、所治疾病的性質(zhì)和嚴重度、癥狀為急性還是慢性以及患者的體積和總體癥狀?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法確定適當劑量，例如在臨床試驗中包括劑量放大研究。

本發(fā)明抗體可在例如一段時間內(nèi)按規(guī)律間隔給藥一次或多次。在具體實施方案中，在至少一個月或更長時間給藥一次給予鼠源抗體或人源化抗體，例如一個、兩個或三個月或者甚至不確定。對于治療慢性癥狀，長期治療通常最有效。但是，對于治療急性癥狀，短期給藥例如從一周至六周就已足夠。通常，給予人類抗體直至患者表現(xiàn)出所選體征或指示劑高于基線水平的醫(yī)學相關(guān)改善度為止。

本發(fā)明方法和組合物的具體實施方案涉及使用例如抗體和一個或多個β-klotho拮抗劑、兩個或更多本發(fā)明抗體，或者本發(fā)明抗體和一個或更多其它β-klotho拮抗劑。在進一步的實施方案中，單獨或與其它用于治療使患者痛苦的癥狀的藥劑組合給予抗體。這些藥劑的實例包括蛋白質(zhì)以及非 蛋白質(zhì)藥物。當聯(lián)合給予多種藥物時，如本領(lǐng)域所熟知其劑量應相應調(diào)整。“聯(lián)合給藥”組合療法不限于同時給藥，也包括在涉及給予患者至少一種其它治療劑的療程中至少給予一次抗原和蛋白的治療方案。

另一方面，本發(fā)明提供治療ii型糖尿病及相關(guān)病癥藥用組合物，其包含本發(fā)明抗體與藥學可接受輔料中的混合物，用于治療ii型糖尿病的相關(guān)病癥。藥劑制備方法如上所述。

具體實施例：

1、免疫用抗原細胞穩(wěn)定株的構(gòu)建

接種cho-dhfr細胞(中科院細胞庫)至6孔板中，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染含v5-hklb基因的質(zhì)粒(市售)于6孔板中的細胞，轉(zhuǎn)染前更換培養(yǎng)液，按照invitrogen公司推薦lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染條件進行轉(zhuǎn)染。48小時后，再換為含有10nm甲氨碟呤(methotrexate，mtx)的完全培養(yǎng)基，每隔3天換液，待兩周左右，出現(xiàn)穩(wěn)定生長的克隆，消化分散細胞集落，待長至50％愈合度時，逐漸提高mtx的濃度進行加壓篩選，最高至10um濃度的mtx。構(gòu)建的穩(wěn)定細胞株分別進行facs檢測，利用klb蛋白n’-端v5標簽抗體(fitc-anti-v5，invitrogen)鑒定加壓后的細胞群體，篩選后的cho-dhfr-v5-hklb細胞膜上hklb有大量表達，最后經(jīng)過亞克隆、鑒定獲得2株klb高表達細胞穩(wěn)定株。

2、抗體的制備

將在弗氏佐劑中乳化的cho-dhfr-v5-hklb全細胞，以2×10⁶細胞/只的劑量皮下注射balb/c小鼠(6-8周齡)。2周后，使用不完全弗氏佐劑 乳化免疫原，加強免疫小鼠，此后每周加強一次。通過剪尾的方式采血，離心分離血清，進行facs檢測血清效價。直至達到適合抗體滴度時，斷頸處死小鼠，無菌狀態(tài)下獲取脾臟細胞。收集生長狀態(tài)處于對數(shù)生長期的sp2/0細胞，2000rpm，3min離心，沉淀用無血清培養(yǎng)至重懸，再次離心-重懸，計數(shù)?；旌掀⑴K細胞和sp2/0細胞，保證sp2/0：脾臟細胞≥1:1，共“洗滌-離心”3次。彈散最后一次離心后的沉淀，逐滴加入1ml預溫的peg-1350(30s內(nèi)滴完)，上下吹吸1分鐘，緩慢加入30ml預熱的無血清培養(yǎng)基以終止peg的融合作用，1500rpm，5min離心，彈散細胞沉淀，加入融合培養(yǎng)基，按每孔20000個脾細胞及5000個飼養(yǎng)層細胞鋪于96孔板中,每孔100ul。融合后的雜交瘤細胞和飼養(yǎng)層細胞一起在96孔板中進行培養(yǎng)，并進行hat(次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸苷)篩選，以除去非融合的細胞。10天后收取培養(yǎng)板中的雜交瘤細胞上清進行elisa檢測。

3、全細胞elisa篩選

將cho-dhfr-v5-hklb過表達hklb細胞和不表達hklb的cho-dhfr空白細胞分別接種至96孔板，長至90％愈合度。除去細胞培養(yǎng)上清，pbs洗兩遍，加入100ul100％甲醇，4℃固定10min。再加入100ul新鮮配制的0.6％h2o2-pbs，室溫處理20min，用pbs緩沖液洗滌2遍。經(jīng)過pbs-1％bsa封閉后，加入雜交瘤細胞上清，4℃孵育90min。多次洗滌后，每孔加入100ul稀釋的gxm-hrp-fc二抗(bd，50倍稀釋)，37℃孵育0.5h。洗滌5次后,每孔加入100ultmb顯色底物，37℃反應15min，2mh2so4終止，讀取od450值。陽性對照為免疫小鼠的血清；陰性對照 為細胞培養(yǎng)基上清。選取分泌抗hklb抗體的雜交瘤株，進行克隆化以獲得能穩(wěn)定分泌針對hklb的細胞株。最后選取雜交瘤細胞分泌的抗體上清進行facs驗證。

4、陽性雜交瘤細胞上清流式分析鑒定(facs)

用含10mmedta的pbs消化、收集10⁵個cho-dhfr-v5-hklb細胞，分別加入1.5mlep管，離心后棄上清，陰性對照樣本用流式上樣緩沖液(pbs，2％fbs)重懸。陽性處理組細胞每管加200ul抗體上清，室溫孵育；1500rpm離心，棄上清，用流式上樣緩沖液洗一次，再離心，重懸，加入1:50稀釋的fitc標記的羊抗鼠熒光二抗(bd，200ul/孔)，室溫避光孵育30min；離心，棄上清，再用流式上樣緩沖液洗一次，離心，最后用流式上樣緩沖液重懸，上機檢測。如1和圖2所示，雜交瘤細胞上清和表達有klb的cho-dhfr細胞有特異性結(jié)合，灰色峰和虛線峰為陰性對照，雜交瘤細胞上清對應的實線峰有明顯右移。

5、抗體基因的克隆及亞克隆

收集分泌抗體的雜交瘤細胞，按照qiagen的mrna抽提試劑盒操作規(guī)程，提取雜交瘤細胞的mrna。然后將提取后的mrna反轉(zhuǎn)錄成cdna，逆轉(zhuǎn)錄引物為小鼠輕、重鏈恒定區(qū)的特異性引物，重鏈逆轉(zhuǎn)錄引物為(5’-tttggrgggaagatgaagac-3’)(seqidno:36)，輕鏈逆轉(zhuǎn)錄引物為(5’-ttaacactctcccctgttgaa-3’)(seqidno:37)和(5’-ttaacactcattcctgttgaa-3’)(seqidno:38)。rt-pcr的反應條件為：25℃5min；50℃60min；70℃15min。將反轉(zhuǎn)錄的cdna用0.1mm 的te稀釋至500ul，加入到超濾離心管(amiconultra-0.5)中，2000×g離心10min；棄濾液，再加500ul的0.1mm的te，，2000×g離心10min；棄濾液，將制備管倒置到新的離心管中，2000×g離心10min，得到純化后的cdna；取10ul的純化后的cdna作為模板，加入4ul的5×tailingbuffer(promega)，4ul的datp(1mm)和10u的末端轉(zhuǎn)移酶(promega)后混勻，37℃孵育5min后65℃5min；然后以加上polya尾的cdna為模板，pcr擴增抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因。上游引物均為oligodt，重鏈下游引物為(5’-tggacagggatccagagttcc-3’)(seqidno:39)和(5’-tggacagggctccatagttcc-3’)(seqidno:40)，輕鏈下游引物為(5’-actcgtccttggtcaacgtg-3’)(seqidno:41)。pcr反應條件：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min40cycles；72℃7min；pcr產(chǎn)物連接到pmd18-t載體(takara)后進行測序?？寺〉目贵w是:a-1,a-2,a-3。

基于已測序得到的抗體的dna序列設(shè)計pcr引物，從而將完整輕鏈、重鏈信號肽和可變域以及小鼠igg1恒定區(qū)與表達載體(市售)相連。

6.抗體的瞬時表達

接種5×10⁵/ml的懸浮hek293或者cho表達細胞系至轉(zhuǎn)瓶中，經(jīng)過24小時37℃，5％co2旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)后，密度達到1×10⁶/ml后被用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程中使用polyethylenimine(pei)作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將其與的dna(dna用量為每1×10⁶個細胞0.5ug，其中抗體輕鏈和重鏈的比重為3:2混合，pei和dna的質(zhì)量混合優(yōu)選配比為3:1。兩者混合物在靜置孵育15分鐘后被加 入到細胞培養(yǎng)中。細胞在接受pei與dna混合物后繼續(xù)37℃，5％co2旋轉(zhuǎn)培24小時后，向細胞培養(yǎng)液中加入0.5％的胰蛋白胨作為表達需要的氨基酸源，最后在表達完成后(96小時以上)收集細胞上清用于抗體的純化分離。

7、抗體的純化分離

收集的細胞上清經(jīng)過高速(8000rpm，15分鐘)離心去除細胞以及細胞碎片后，再用0.45um濾膜過濾澄清，澄清后的上清被用于純化。純化過程由層析儀完成。上清首先流過蛋白g親和層析柱，上清中包含的抗體在此期間與蛋白g親和層析柱的配基相結(jié)合后被滯留于柱內(nèi)，然后低ph值(小于等于3.0)的洗脫緩沖液灌洗層析柱解離與層析柱結(jié)合的抗體，收集到的抗體洗脫液用1m的tris-hcl迅速中和以保護抗體不變性失活。得到的抗體洗脫液經(jīng)過16小時的透析后置換成pbs緩沖液。

8、報告基因?qū)嶒灆z測抗體體外激活人β-klotho/fgfr1c受體復合物的功能。

以每孔20000個接種共表達hklb/fgfr1c-sre-luciferase的cho-dhfr-細胞(在cho-dhfr-hklb細胞的基礎(chǔ)上，采用實例1中的方法轉(zhuǎn)染fgfr1c和sre-luciferase，潮霉素和g418抗生素篩選亞克隆，建立細胞穩(wěn)定株)至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜。第二天除去培養(yǎng)基上清，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞表面兩次，吸去殘液，再加入100μl用無血清培養(yǎng)基稀釋純化抗體或fgf21，37℃孵育4小時。刺激結(jié)束后，加入100μlpromega的brightglo化學發(fā)光底物，最后將細胞裂解物轉(zhuǎn)移至白色96孔板，在moleculardevices的spectramaxl酶標儀上讀取相對發(fā)光強度。 結(jié)果表明：重組表達的anti-klb(a-1，a-2，a-3)和fgf21一樣，均可激活人β-klotho/fgfr1c復合受體的功能(圖3)。

9、免疫印跡

以每孔20000個接種共表達hklb/fgfr1c的cho-dhfr-細胞(在cho-dhfr-hklb細胞的基礎(chǔ)上，采用實例1中的方法轉(zhuǎn)染fgfr1c，潮霉素篩選亞克隆，建立細胞穩(wěn)定株)至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜。第二天除去培養(yǎng)基上清，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞表面兩次，吸去殘液，無血清中饑餓30分鐘。吸去培養(yǎng)液后，再加入100μl用無血清培養(yǎng)基稀釋純化抗體或fgf21，37℃孵育15分鐘。刺激結(jié)束后，加入細胞裂解液(ripa，thermo)裂解細胞，抽取細胞裂解液上清蛋白進行sds-page電泳分離，半干法轉(zhuǎn)膜，1％bsa-pbst封閉后的pvdf膜，按照廠家說明書的方法，分別用anti-erk和anti-p-erk抗體(cellsignalingtechnology)進行免疫印跡，曝光后的結(jié)果表明：重組表達的anti-klb(a-1，a-2)在10nm的濃度下，均可引起細胞內(nèi)erk的磷酸化條帶變粗變濃，即刺激后細胞內(nèi)erk磷酸化水平升高(圖4)。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。