本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及利用構(gòu)建抑制性trna延長致病基因無義突變體的截短蛋白，使哺乳動物細胞中產(chǎn)生全長有功能的蛋白，從而恢復突變體的正常結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明主要涉及構(gòu)筑對應三種終止密碼子的19種抑制性trna，在哺乳動物細胞中通讀dystrophin蛋白并在腫瘤細胞通讀無義突變蛋白，作用顯著。
背景技術(shù)：
：無義突變及其引起的遺傳性疾病人類基因組中的存在許多種基因突變類型，無義突變是基因突變中的一類?；蛲蛔兪腔蚪Mdna分子發(fā)生的可遺傳的變異現(xiàn)象，其中包括移碼突變和堿基置換。移碼突變包括堿基的插入和缺失，堿基置換主要為錯義突變和無義突變。無義突變是指編碼基因的某個堿基發(fā)生突變，產(chǎn)生終止密碼子uag、uaa和uga，終止密碼子不編碼任何氨基酸。終止密碼子不能與轉(zhuǎn)移rna(trna)的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鍵的合成，使蛋白質(zhì)合成終止，因而生成不完整和沒有功能的蛋白質(zhì)。無義突變的發(fā)生使基因框內(nèi)產(chǎn)生提前終止密碼子(prematureterminationcodons，ptc)，導致基因編碼的兩種結(jié)果，一種即產(chǎn)生截短型蛋白，另一種則導致含有ptc的mrna的穩(wěn)定性降低，從而引發(fā)相應的遺傳性疾病。據(jù)統(tǒng)計，大約有11.2％的單基因遺傳性疾病會產(chǎn)生ptc突變，被稱作提前終止密碼子病(prematureterminationcodonsdiseases，ptcdiseases)，另一方面，許多癌癥發(fā)生也會產(chǎn)生ptc突變(keelingk.m.etal.criticalreviewsinbiochemistryandmolecularbiology，2012，47：444-463.)。杜氏肌營養(yǎng)不良(duchennemusculardystrophy，dmd)是ptc疾病中的一個典型代表。dmd是一種嚴重的肌肉萎縮疾病，也是最常見的x連鎖隱性遺傳性疾病，以進展性、致死性為主要特點。dmd基因的無義突變則是導致dmd發(fā)生的主要原因之一。無義突變產(chǎn)生提前終止密碼子uag、uaa、uga，生成截短了的多肽產(chǎn)物，使患者缺失或缺少功能性的抗萎縮蛋白(dystrophin)，致使肌肉萎縮。據(jù)報道，duchenne型肌營養(yǎng)不良癥在活產(chǎn)男嬰中的發(fā)病率為1/6300～1/3500[dooleyj.etal.clinpediatr(phila)，2010，49：177-179.]。該病目前尚無有效治愈方法，多于幼年期發(fā)病，青少年期喪失行走能力，成年早期死亡，給患者個人、家庭和社會造成沉重心理和經(jīng)濟負擔抑制性trna通讀無義突變?nèi)祟惢蚪M中的61種密碼子可以被trna識別，編碼20種氨基酸，三種終止密碼子(uag、uaa、uga)沒有相應的trna識別，不編碼氨基酸，進而終止翻譯。但是有研究發(fā)現(xiàn)，存在可以識別終止密碼子的trna，使終止密碼子編碼氨基酸，蛋白翻譯正常進行。這種能夠識別終止密碼子的trna，即為無義突變抑制性trna。抑制性trna存在廣泛，無論在植物細胞還是動物細胞中，都發(fā)現(xiàn)了抑制性trna。但由于抑制性trna在細胞中含量極少，因此抑制性trna不易被檢測到。無義突變抑制性trna由正常編碼氨基酸t(yī)rna反密碼子環(huán)堿基突變產(chǎn)生，突變后的trna能識別終止密碼子并與終止密碼子完全互補配對，同時仍能攜帶氨基酸，能夠在提前終止密碼子處插入特定氨基酸，通讀無義突變?；谝种菩詔rna能夠通讀無義突變的特性，有文獻報道應用抑制性trna通讀原核和真核細胞中含有提前終止密碼子的蛋白，恢復蛋白表達。由于大約30％人類遺傳性疾病中存在ptc，但抑制性trna對于人類遺傳性疾病相關(guān)蛋白通讀情況研究仍不清楚，因此，利用構(gòu)建抑制性trna延長致病基因無義突變體的截短蛋白，使哺乳動物細胞中產(chǎn)生全長有功能的蛋白，從而恢復突變體的正常結(jié)構(gòu)和功能顯得十分重要。另一方面，雖然抑制性trna能夠恢復含無義突變蛋白表達，但是，不同抑制性trna通讀效率有何差異，仍不得而知。因此，構(gòu)建多種抑制性trna，比較在哺乳動物細胞中通讀效率差異，需找高效抑制性trna也十分重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明人經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的思考和研究，構(gòu)建19種無義突變抑制性trna(序列如seqidno：1-19)，抑制性trna攜帶對應氨基酸并與提前終止密碼子完全互補配對，通讀無義突變，恢復ptc疾病中致病蛋白表達，并比較得通讀無義突變效率最高的抑制性trna。發(fā)明人首先確定了人類遺傳性疾病中19種無義突變頻率較高的氨基酸密碼子，改變識別這19種密碼子的相應trna反密碼子環(huán)堿基，通過soepcr的方法構(gòu)建無義突變抑制性trna，并在抑制性trna5’端連接7sk啟動子。再將抑制性trna與含有提前終止密碼子的dystrophin蛋白基因轉(zhuǎn)染至293t細胞，在哺乳細胞中恢復dystrophin蛋白表達。同時，應用含有終止密碼子的雙熒光素酶報告基因和gfp報告基因比較不同抑制性trna促進通讀效率，比較得到通讀效率最高的抑制性trna分別為amber抑制性trna(gln)；ocher抑制性trna(gln)；opal抑制性trna(arg)。本發(fā)明的優(yōu)點可體現(xiàn)在如下中的一個或幾個：1、通過soepcr的方法，實現(xiàn)任意一種抑制性trna的快速構(gòu)建。2、獲得了三種能夠高效通讀無義突變的抑制性trna-amber抑制性trna(gln)；ocher抑制性trna(gln)；opal抑制性trna(arg)。3、利用多種抑制性trna，實現(xiàn)通讀單基因遺傳性疾病和腫瘤中的無義突變，恢復截短蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能。具體地，在本發(fā)明的一個實施方案中，構(gòu)建抑制性trna并在293t細胞中恢復dmd疾病相關(guān)蛋白dystrophin蛋白表達，主要通過：(1)構(gòu)建含有7sk啟動子的19種抑制性trna的表達載體bjmu-strnagln-uag；bjmu-strnatyr-uag；bjmu-strnalys-uag；bjmu-strnaleu-uag；bjmu-strnaglu-uag；bjmu-strnatrp-uag；bjmu-strnaarg-uga；bjmu-strnagln-uga；bjmu-strnatrp-uga；bjmu-strnagly-uga；bjmu-strnacys-uga；bjmu-strnaleu-uga；bjmu-strnaser-uga；bjmu-strnagln-uaa；bjmu-strnatyr-uaa；bjmu-strnalys-uaa；bjmu-strnaglu-uaa；bjmu-strnaleu-uaa；bjmu-strnaser-uaa，19種抑制性trna對應19種較易發(fā)生無義突變的119種氨基酸密碼子；(2)構(gòu)建中間含有終止密碼子的雙熒光素酶報告系統(tǒng)pgl4-2luc-tag；pgl4-2luc-taa；pgl4-2luc-tga和含有提前終止密碼子的gfp報告基因pcdna3.1-gfp-39tag；pcdna3.1-gfp-39taa；pcdna3.1-gfp-39tga；(3)根據(jù)dmd病人中無義突變位點，利用點突變技術(shù)在dystrophin蛋白的同源異構(gòu)體蛋白dp71b蛋白相應位點引入提前終止密碼子，構(gòu)建分別含有提前終止密碼子uag，uaa，uga的dp71b蛋白質(zhì)粒dp71b3115tag；dp71b3216taa；dp71b3112tga；(4)將步驟(1)和步驟(2)中載體分別對應共轉(zhuǎn)染至293t細胞中，利用雙熒光素酶和gfp報告-系統(tǒng)比較不同抑制性trna通讀效率差異；(5)將步驟(1)的抑制性trna分別與步驟(3)中的含有提前終止密碼子的dp71b蛋白共同轉(zhuǎn)染至293t細胞，westernblot方法檢測dp71b表達恢復情況，最終確定多種抑制性trna能夠恢復無義突變的dp71b蛋白表達，其中抑制性trna(gln)對于uag、uaa、uga三種終止密碼子的無義突變均有較高的通讀效率；(6)將步驟(1)的抑制性trna轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞系a549和du145，培養(yǎng)48小時后提取蛋白，經(jīng)westernblot證明在腫瘤細胞系a549和du145中stk11蛋白和全長ephb2蛋白恢復表達抑制性trna通讀無義突變的原理在于：(1)在細胞正常的翻譯過程中，提前終止密碼子被第一類肽鏈釋放因子erf1識別，而正常trna不能識別終止密碼子，erf3是一類依賴于核糖體和第一類肽鏈釋放因子的gtpase，協(xié)同erf1促進肽鏈從核糖體上釋放，翻譯過程終止(zhouravleva，g.etal.emboj，1995，14，4065-72.)。而構(gòu)建的抑制性trna為正常trna通過反密碼子環(huán)改造而來，其反密碼子環(huán)能夠與終止密碼子uag、uaa、uga完全互補配對，與erf1競爭識別提前終止密碼子，改變反密碼子環(huán)的trna仍能攜帶對應的氨基酸，因此，抑制性trna在提前終止密碼子位置插入氨基酸，使翻譯過程繼續(xù)進行，通讀無義突變；(2)所構(gòu)建的抑制性trna5’段連有7sk啟動子，能夠啟動抑制性trna在哺乳動物細胞中大量表達，最終恢復蛋白表達。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，利用soepcr方法實現(xiàn)任意一種帶有7sk啟動子的抑制性trna的快速構(gòu)建。原理在于，抑制性trna只是正常trna單個堿基的替換，大小一般在80bp左右，長度較小，可以設(shè)計部分互補配對的上下游兩段引物直接pcr合成，合成的抑制性trna進行第二步pcr，連接于7sk啟動子3’端。具體地為，設(shè)計覆蓋全部抑制性trna并部分互補的上下游引物，其余引物設(shè)計按照soepcr常規(guī)方法設(shè)計。第一步pcr分別合成抑制性trna及7sk啟動子序列，第二步pcr實現(xiàn)抑制性trna與7sk啟動子的連接，實現(xiàn)帶有7sk啟動子的抑制性trna的合成。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，利用中間分別含有終止密碼子uag、uaa、uga的renila熒光素酶和firefly酶雙熒光素酶報告基因pgl4-2luc-tag；pgl4-2luc-taa；pgl4-2luc-tga，檢測不同抑制性trna的通讀效率。即在293t細胞中轉(zhuǎn)染抑制性trna和相應雙熒光素酶報告基因，通過分別測定firefly和renila的熒光讀值，根據(jù)firefly相對于renila的熒光相對值，反應通讀效率差異。同時，利用點突變技術(shù)將gfp熒光基因第39位氨基酸密碼子分別點突變?yōu)閡ag、uaa、uga三種提前終止密碼子得到pcdna3.1-gfp-39tag；pcdna3.1-gfp-39taa；pcdna3.1-gfp-39tga載體，通過測定293t細胞中g(shù)fp熒光強度，確定抑制性trna通讀效率，最終確定通讀uag、uaa、uga效率最高的抑制性trna分別為amber抑制性trna(gln)；ocher抑制性trna(gln)；opal抑制性trna(arg)。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，將抑制性trna應用于恢復人類遺傳性疾病相關(guān)無義突變蛋白表達。根據(jù)人類dmd疾病中無義突變位置，在正常dp71b序列對應位置進行點突變，模擬人類dmd疾病中dmd基因序列，含有提前終止密碼子uag的dp71b3115tag，突變?yōu)閏.9346c＞t，含有提前終止密碼子uaa的dp71b3216taa，突變?yōu)閏.9651c＞a；含有提前終止密碼子uga的dp71b3112tga，突變?yōu)閏.9337c＞t。將突變后的dp71b蛋白質(zhì)粒與不同的抑制性trna共轉(zhuǎn)染至293t細胞中，恢復dp71b的表達。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，將抑制性trna用于通讀腫瘤細胞中抑癌基因的無義突變位點。將bjmu-strnagln-uag轉(zhuǎn)染腫瘤細胞系a549和du145(人肺癌細胞a549基因組上stk11發(fā)生無義突變c.109c＞t，p.q37x，為終止密碼子uag；人前列腺癌細胞du145基因組上ephb2基因發(fā)生無義突變c.2167c＞t，p.q723x，為終止密碼子uag)。加入非天然氨基酸培養(yǎng)48小時后提取蛋白，經(jīng)westernblot證明基因密碼子擴展技術(shù)在腫瘤細胞系a549和du145中恢復了全長stk11蛋白和全長ephb2蛋白的表達。更為具體地，本發(fā)明提供了1.含有7sk啟動子的19種抑制性trna的表達載體bjmu-strnagln-uag；bjmu-strnatyr-uag；bjmu-strnalys-uag；bjmu-strnaleu-uag；bjmu-strnaglu-uag；bjmu-strnatrp-uag；bjmu-strnaarg-uga；bjmu-strnagln-uga；bjmu-strnatrp-uga；bjmu-strnagly-uga；bjmu-strnacys-uga；bjmu-strnaleu-uga；bjmu-strnaser-uga；bjmu-strnagln-uaa；bjmu-strnatyr-uaa；bjmu-strnalys-uaa；bjmu-strnaglu-uaa；bjmu-strnaleu-uaa；bjmu-strnaser-uaa，其可實現(xiàn)不同抑制性trna的過表達。2.含有終止密碼子的雙熒光素酶報基因pgl4-2luc-tag；pgl4-2luc-taa；pgl4-2luc-tga，其序列如seqidno：22所示?？赏ㄟ^測定該基因的firely相對于renila熒光強度，反映抑制性trna通讀效率。3.攜帶tyr39位分別突變?yōu)閡ag、uaa、uga的綠色熒光蛋白報告基因載體pcdna3.1-gfp-39tag；pcdna3.1-gfp-39taa；pcdna3.1-gfp-39tga，該載體可通過熒光強度反映通讀效率，未經(jīng)突變的序列如seqidno：21所示。4.含有提前終止密碼子uag，uaa，uga的dp71b蛋白質(zhì)粒dp71b3115tag；dp71b3216taa；dp71b3112tga。未經(jīng)突變的dp71b序列如seqidno：23所示。附圖說明：圖1：抑制性trna質(zhì)粒構(gòu)建a：正常trna改造反密碼子環(huán)合成抑制性trna；b：抑制性trna通讀ptc示意圖，攜帶氨基酸的抑制性trna反密碼子環(huán)與提前終止密碼子完全互補配對，通讀ptc；c：soepcr方法將7sk啟動子連接至抑制性trna5’端；d：用bamhi和bglii雙酶切抑制性trna，bamhi單酶切bjmu載體，將酶切產(chǎn)物連接，得到連有7sk-抑制性trna的bjmu載體。圖2：雙熒光素酶報告基因及gfp報告基因檢測抑制性trna通讀效率a：雙熒光素酶報告基因及gfp報告基因構(gòu)建，雙熒光素酶中間連有含有終止密碼子的linker，野生型gfp基因通過點突變將39為氨基酸突變?yōu)樘崆敖K止密碼子；b：雙熒光素酶報告基因檢測不同抑制性trna通讀效率，不同抑制性trna通讀效率不同，通讀uag、uaa、uga效率最高的抑制性trna分別為amber抑制性trna(gln)；ocher抑制性trna(gln)；opal抑制性trna(arg)；c：gfp報告基因熒光強度檢測不同抑制性trna通讀效率，進一步驗證了抑制性trna不同通讀效率。圖3：抑制性trna恢復ptc疾病中及腫瘤細胞無義突變蛋白表達a：抑制性trna能夠恢復dp71b蛋白表達，但恢復效率不同；b：轉(zhuǎn)染抑制性trnagln-uag，a549中stk11蛋白表達恢復；c：轉(zhuǎn)染抑制性trnagln-uag，du145中ephb2蛋白表達恢復。為了更好地理解本發(fā)明，發(fā)明人用實施例對具體試驗進行闡述和說明，其中所述實施例僅用于說明，并不限定本發(fā)明的保護范圍。任何與本發(fā)明等價的變體或者實施方案都包括在本發(fā)明中。實施例1：19種抑制性trna的獲得(1)確定19種抑制性trna根據(jù)人類ptc疾病突變特點，確定19種可發(fā)生無義突變的氨基酸密碼子所對應trna的序列，改變trna反密碼子環(huán)得到與提前中終止密碼子完全互補配對的抑制性trna，19種抑制性trna分別為，amber抑制性trna：抑制性trna(gln/uag)、抑制性trna(tyr/uag)、抑制性trna(lys/uag)、抑制性trna(leu/uag)、抑制性trna(glu/uag)、抑制性trna(trp/uag)；opal抑制性trna：抑制性trna(arg/uga)、抑制性trna(gln/uga)、抑制性trna(trp/uga)、抑制性trna(gly/uga)、抑制性trna(cys/uga)、抑制性trna(leu/uga)、抑制性trna(ser/uga)；ocher抑制性trna：抑制性trna(gln/uaa)、抑制性trna(tyr/uaa)、抑制性trna(lys/uaa)、抑制性trna(glu/uaa)、抑制性trna(leu/uaa)、抑制性trna(ser/uaa)。(2)soepcr引物及點突變引物設(shè)計根據(jù)以確定的19中抑制性trna序列合成19種5’端連接有7sk啟動子的19種抑制性trna其中3種抑制性trna，抑制性trna(gln/uag)、抑制性trna(tyr/uag)、抑制性trna(lys/uag)由序列全合成得到，其余13種由soepcr法合成抑制性trna并在5‘端連接7sk啟動子，3種由得到的抑制性trna點突變獲得。表17sk啟動子序列表2soepcr引物序列表3抑制性trna點突變引物設(shè)計點突變引物名稱引物序列(5’-3’方向)7sk-gln-ugaforctcggatcgctggatttgaagtccagagtgctaac7sk-gln-ugarevgttagcactctggacttcaaatccagcgatccgag7sk-tyr-uaaforgcgacctaaggatctaaagtcctccgctctacc7sk-tyr-uaarevggtagagcggaggactttagatccttaggtcgc7sk-trp-uag-forgcaacggcagcgcgtctgactctagatcagaaggtuag-trp-revaccttctgatctagagtcagacgcgctgccgttgc(3)抑制性trna連接至bjmu載體在得到抑制性trna的基礎(chǔ)上，用bamhi和bglii雙酶切抑制性trna，bamhi單酶切bjmu載體，將酶切產(chǎn)物連接，得到連有7sk-抑制性ttrna的bjmu載體。實施例2：利用雙熒光素報告基因和點突變的gfp報告基因檢測19種抑制性trna通讀效率(1)構(gòu)建含有提前終止密碼子的gfp報告基因綠色熒光蛋白gfp是最常用的報告基因，也是指示非天然氨基酸插入的有力工具，其由238個氨基酸組成，其基因序列如seqidno：21。將gfp序列插入pcdna3.1商業(yè)質(zhì)粒上，將gfp熒光基因第39位氨基酸密碼子分別點突變?yōu)閡ag、uaa、uga三種提前終止密碼子。設(shè)計能夠使編碼所述氨基酸的密碼子分別突變?yōu)槿N終止密碼子的引物，具體引物如下表所示。表4gfp突變引物列表gfp-39-uag-forggcgagggcgatgccacctagggcaagctgaccctgaagttcgfp-39-uag-forgaacttcagggtcagcttgccctaggtggcatcgccctcgccgfp-39-uaa-forggcgagggcgatgccacctaaggcaagctgaccctgaagttcgfp-39-uaa-forgaacttcagggtcagcttgccttaggtggcatcgccctcgccgfp-39-uag-forggcgagggcgatgccacctgaggcaagctgaccctgaagttcgfp-39-uag-forgaacttcagggtcagcttgcctcaggtggcatcgccctcgcc利用定點突變試劑盒(lightningsite-directedmutagenesiskits，catalog#210518)，按說明書操作，以野生型gfp表達載體pcdna3.1-gfp-wt為模板將第39位的氨基酸密碼子分別突變?yōu)槿N終止密碼子，構(gòu)建得到表達質(zhì)粒(pcdna3.1-gfp-39tag、pcdna3.1-gfp-39taa和pcdna3.1-gfp-39tga)，經(jīng)測序驗證突變成功。(2)293t細胞中分別轉(zhuǎn)染不同抑制性trna質(zhì)粒和雙熒光素酶報基因驗證抑制性trna通讀效率將抑制性trna載體與和雙熒光素報告基因pgl4-2luc-tag；pgl4-2luc-taa；pgl4-2luc-tga質(zhì)粒按表5的分組以1∶2比例混合，再與轉(zhuǎn)染試劑megatrans1.0按1∶3比例混合，共同加入293t細胞，6小時后換液，至細胞于37℃，5％co2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細胞，向細胞裂解液加入熒光素酶底物，檢測熒光讀值。結(jié)果如圖2b所示。加入抑制性trna后，可以得到全長有活性的突變型螢火蟲熒光素酶蛋白。最終確定通讀uag、uaa、uga效率最高的抑制性trna分別為amber抑制性trna(gln)：ocher抑制性trna(gln)；opal抑制性trna(arg)。表5雙熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分組(3)293t細胞中分別轉(zhuǎn)染19種抑制性trna和pcdna3.1-gfp質(zhì)粒驗證抑制性trna通讀效率將實施例2的步驟1獲得的pcdna3.1-gfp-39txx，以及實施例1的步驟3的19種抑制性trna質(zhì)粒按表6的分組按照實施例2步驟2所述轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染至293t細胞，48小時后后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光，結(jié)果如圖2c所示。最終進一步驗證通讀uag、uaa、uga效率最高的抑制性trna分別為amber抑制性trna(gln)；ocher抑制性trna(gln)；opal抑制性trna(arg)。表6gfp報告基因轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分組實例3：293t細胞系中通讀疾病蛋白dystrophin(1)構(gòu)建含有提前終止密碼子uag、uaa、uga的dp71b突變質(zhì)粒dystrophin蛋白的同源異構(gòu)體dp71b序列如seqidno：23所示，發(fā)明人根據(jù)杜氏肌營養(yǎng)不良病人無義突變的位點，對野生型dp71b序列進行點突變，在不同位置引入提前終止密碼子，構(gòu)建含有提前終止密碼子uag的dp71b3115tag，突變?yōu)閏.9346c＞t，含有提前終止密碼子uaa的dp71b3216taa，突變?yōu)閏.9651c＞a；含有提前終止密碼子uga的dp71b3112tga，突變?yōu)閏.9337c＞t，經(jīng)測序驗證突變成功。(2)293t細胞系中通讀疾病蛋白dystrophin將實施例3的步驟1獲得的dp71b3115tag，dp71b3216taa，dp71b3112tga質(zhì)粒與對應的抑制性trna按照實施例2步驟2所述轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染至293t細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后提取蛋白，westernblot檢測(一抗為anti-dystrophin，為抗dystrophin蛋白c末端抗體，貨號12715-1-ap)到全長dystrophin蛋白的產(chǎn)生，如圖3a。證明抑制性trna能夠通讀不同類型提前終止密碼子，恢復疾病蛋白的表達。實施例4：抑制性trna通讀腫瘤細胞系基因組上的提前終止密碼子經(jīng)查閱文獻，人肺癌細胞a549基因組上stk11發(fā)生無義突變c.109c＞t，p.q37x，為琥珀型終止密碼子uag；人前列腺癌細胞du145基因組上ephb2基因發(fā)生無義突變c.2167c＞t，p.q723x，為琥珀型終止密碼子uag。將bjmu-strnagln-uag質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑megatrans1.0按1∶3比例混合，分別轉(zhuǎn)染a549和du145細胞，6小時后換液，置細胞于37℃，5％co2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后提取蛋白，westernblot檢測(一抗分別為anti-stk11和anti-ephb2)到全長蛋白的stk11和ephb2產(chǎn)生，如圖3b和3c。驗證抑制性能夠通讀內(nèi)源性基因組上的提前終止密碼子，恢復抑癌基因蛋白表達。以上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12