本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種能高效耐受和利用甲醇的酵母菌株及應用。

背景技術：

甲醇作為一種古老的有機原料，是僅次于乙烯、丙烯和苯的基本有機原料，其需求與國民經濟的增長密切相關，近年來隨著中國經濟的持續(xù)增長，甲醇的需求也出現大幅增長，年均增長率保持在10％～15％，與此同時，甲醇的生產能力也在穩(wěn)步提升，據權威統(tǒng)計，2012年中國甲醇行業(yè)共有企業(yè)近300家，產能達到5149.1萬t，產量為3129萬t。由于中國是缺油少氣、煤炭資源相對豐富的國家，隨著國家產業(yè)政策調整和技術進步，目前中國甲醇產能中以煤為原料約占66％，以天然氣為原料約占23％，以焦爐氣為原料約占11％。甲醇作為重要的基礎化工原料，在傳統(tǒng)下游應用，包括塑料、合成纖維、合成橡膠、膠粘劑、染料、涂料、香料、醫(yī)藥和農藥等方面有著重要的作用，近年來隨著煤化工國產化工藝技術及裝備大型化取得突破，醇醚燃料、甲醇制烯烴/芳烴等新興煤化工產業(yè)發(fā)展前景樂觀。另外，基于國際石油價格上漲和中國汽油消費量大幅增加的發(fā)展趨勢，甲醇汽油、甲醇燃料和二甲醚等新型燃料也將隨著標準的完善和銷售網絡的建設，成為甲醇新的消費增長點。隨著生產工藝的改進與社會需求的變大，甲醇的生產成本也在初步降低，2006年，中國國內均價甲醇是2936元/噸，而到2012年，已經變成了2650元/噸，目前的生產成本已經低于傳統(tǒng)的工業(yè)原料葡萄糖和甘油，可以預知，未來若干年，甲醇將成為十分重要的原料。

1969年，kiochiogata首次報道，發(fā)現一種特別的能夠以甲醇作為唯一的碳源和能源的酵母菌，這種嗜甲醇酵母立刻引起人們極大關注。由于甲醇的經濟性，這種生物體可作為一種單細胞蛋白(singlecellprotein，scp)推向市場，成為高蛋白的動物飼料。70年代，philipspetroleum公司發(fā)展了該菌株適應在甲醇中高密度連續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基和方法，使細胞產量高達130g干細胞/升。不幸的是，隨之而來的石油危機導致甲醇價格急劇上升，使得人們不再重視利用甲醇生產單細胞蛋白。這種酵母即為巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)，由于其細胞內含有甲醇代謝途徑所必需的酶，如乙醇氧化酶(alcoholoxidase，aox)、二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynzyme，dhas)和過氧化氫酶(catalase，cts)等，其中aox是甲醇代謝途徑中的十分重要的酶，也是催化甲醇代謝第一步反應的酶，它能使甲醇被氧化成甲醛和過氧化氫，過氧化氫酶又降解過氧化氫為氧氣和水，過氧化氫又進一步氧化甲醛為甲酸和co2，這樣通過兩種脫氫酶的作用使細胞以甲醇為唯一碳源。由于aox與氧的親合力低，所以p.pastoris在以甲醇為唯一碳源時，會代償性產生大量的aox，約占全部可溶性蛋白質的30％，而在以葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源的培養(yǎng)細胞中則檢測不到aox，這說明aox基因啟動子具有明顯的調控功能,可用于調控外源基因的表達。此調控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導雙重機制控制的：外源基因在甲醇以外的碳源中處于非表達狀態(tài)，而在培養(yǎng)液中加入甲醇后，外源基因即被誘導表達。一般來說，畢赤酵母在表達外源蛋白的大規(guī)模高密度發(fā)酵過程中，主要分為兩個階段，即菌體生長增殖階段和誘導外源蛋白表達階段。在菌體增殖階段，細胞通常以甘油或葡萄糖為碳源進行擴大培養(yǎng)，在獲得所需要的菌體密度后，再進入外源蛋白誘導表達階段。外源蛋白表達階段是以甲醇作為唯一碳源并且誘導目的蛋白表達。在這個過程中，甲醇的精確流加是確定外源蛋白表達的關鍵，流加速率過高超過了畢赤酵母對于甲醇的利用速率，就會在過程中積累高濃度的甲醇。過量的甲醇會嚴重抑制細胞活力和產物的表達，甚至可導致菌體死亡。因此，在應用上往往通過溶氧控制、甲醇離線/在線控制或甘油/甲醇混合補料等工藝來避免甲醇可能對于酵母宿主帶來的毒害。但上述工藝調控，操作復雜并會增加生產成本。因此提高菌株對甲醇的耐受性，增加甲醇的利用速率，將是解決畢赤酵母甲醇毒性的有效策略，同時也會顯著縮短酵母培養(yǎng)的周期，提高生產強度，降低生產成本。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一種高效耐受和利用甲醇的酵母菌株，通過將出發(fā)菌株巴斯德畢赤酵母在含甲醇的培養(yǎng)基中經過馴化得到，獲得的馴化后的菌株可高效耐受和利用甲醇。

以上所述的酵母菌株，其中，所述馴化所用培養(yǎng)基是以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基。

以上所述的酵母菌株，其中，所述馴化是通過菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式進行。

以上所述的酵母菌株，其中，所述馴化包括以下步驟：

1)活化：在ypd固體培養(yǎng)基平板上挑取單克隆接種至ypd液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h；

2)馴化：取1ml活化后的菌液，離心收集菌體沉淀，并用無菌生理鹽水洗滌一次，離心，將沉淀重懸于25ml含0.5％(v/v)甲醇的bmmy液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待菌株進入穩(wěn)定期后，再取1ml培養(yǎng)液接種至另一新鮮的25ml的bmmy液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，如此重復進行多次傳代，將最后一次傳代培養(yǎng)的菌株進行稀釋涂布含0.5％(v/v)甲醇的bmmy平板，選擇長勢最快、個體最大的1個優(yōu)良菌落進行保存，用同樣的方法依次在含1.0％(v/v)、1.5％(v/v)、2.0％(v/v)、2.5％(v/v)甲醇的bmmy培養(yǎng)基中進行馴化，優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)次數為10代或10代以上；

3)篩選：選擇長勢較好、個體較大的菌落接種至含有較高濃度的甲醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶/平板發(fā)酵驗證，篩選出能高效利用甲醇的優(yōu)良菌株。

以上所述的酵母菌株，其中，所述ypd固體培養(yǎng)基成分包括20g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母粉、15g/l瓊脂，ph自然；所述ypd液體培養(yǎng)基包括20g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母粉，ph自然；所述bmmy培養(yǎng)基成分包括10g/l酵母精提物、20g/l蛋白胨、13.4g/lynb和4×10^-4g/l生物素，所述ynb和生物素在其他成分滅菌后溫度降至室溫時再加入。

以上所述的酵母菌株，其中，所述步驟1)及步驟2)的培養(yǎng)條件為30℃，搖床轉速200r/m。

以上所述的酵母菌株，其中，所述出發(fā)菌株為巴斯德畢赤酵母gs115。

以上任一項所述的酵母菌株，獲得的馴化后的菌株命名為pichiapastorisgsm5-01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12174，保藏日期為2016年3月3日，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。

本發(fā)明的另一個方面，提供了以上所述的酵母菌株在耐受高濃度甲醇或高效利用甲醇方面的應用。

本發(fā)明的再一個方面，提供了以上所述的酵母菌株在表達外源蛋白和高值化學品方面的應用。

本發(fā)明獲得的巴斯德畢赤酵母菌在固體培養(yǎng)基中可耐受50g/l以上的甲醇，而出發(fā)菌株僅能耐受至多20g/l的甲醇。本發(fā)明獲得的巴斯德畢赤酵母菌在甲醇為唯一碳源時比生長速率比出發(fā)菌株顯著提升。在復合培養(yǎng)基bmmy中的生長速率比出發(fā)菌株提高1.38倍，在鹽培養(yǎng)基bsm中的生長速率比出發(fā)菌提高1.95倍。本發(fā)明馴化獲得的巴斯德畢赤酵母可以應用于表達外源蛋白和高值化學品，經試驗證明經過甲醇馴化獲得的菌株作為宿主表達乳糖酶基因獲得的乳糖酶的酶活顯著高于未經過甲醇馴化的菌株作為宿主菌表達乳糖酶基因獲得的乳糖酶的酶活。

附圖說明

圖1各菌株在含不同濃度甲醇的固體培養(yǎng)基上的生長情況對比；

圖2各菌株在液體復合培養(yǎng)基bmmy中的生長情況(od600隨時間變化)對比；

圖3各菌株在液體鹽培養(yǎng)基bsm中的生長情況(od600隨時間變化)對比。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發(fā)明的具體實施方式進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。然而，以下描述的具體實施方式和實施例僅是說明的目的，而不是對本發(fā)明的限制。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明中所述“馴化”指傳代培養(yǎng)，即在相同的培養(yǎng)基中，通過多次轉接培養(yǎng)液而實施。

所述“工程菌”為用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。

實施例1、巴斯德畢赤酵母菌的馴化

一、原始菌株的活化

將-80℃保存的巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)gs115(購自invitrogen公司，ca.18100)菌液采用ypd固體平板(20g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母粉，ph自然，15g/l瓊脂)進行培養(yǎng)，分離獲得單菌落，然后挑取一個單克隆接種至5mlypd培養(yǎng)基中，30℃，200r/m震蕩培養(yǎng)48h。

二、馴化流程

取1ml步驟一活化后的菌液，離心(5000r/min，5min)收集菌體沉淀，并用無菌生理鹽水洗滌一次，離心(5000r/min，5min)，將沉淀重懸于25ml含0.5％(v/v)甲醇的bmmy培養(yǎng)基(10g/l酵母精提物、20g/l蛋白胨，121℃滅菌20min后，溫度降至室溫時加入13.4g/lynb，4×10^-4g/l生物素，0.5％(v/v)甲醇)中進行培養(yǎng)(30℃，200r/m)，待菌株進入穩(wěn)定期(大約需要4～6d)后，再取1ml培養(yǎng)液接種至另一新鮮的25ml的bmmy培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，如此重復進行多次傳代，將最后一次傳代培養(yǎng)的菌株進行稀釋涂布0.5％(v/v)甲醇的bmmy固體平板，選擇長勢最快、個體最大的1個優(yōu)良菌落進行保存，命名為gsm1-01。

用同樣的方法在含1.0％(v/v)、1.5％(v/v)以及2.0％(v/v)甲醇的bmmy培養(yǎng)基中進行馴化，每個濃度的甲醇馴化均重復操作多次，將最后一次傳代培養(yǎng)經過平板分離的最優(yōu)良的一個菌株進行保存，相應的菌株分別命名為gsm2-01，gsm3-01，gsm4-01。將gsm4-01活化后接入含2.5％(v/v)甲醇的bmmy培養(yǎng)基中進行再次馴化，將馴化多次后的菌株進行稀釋涂布含2.5％(v/v)甲醇的bmmy平板，選擇相比于其他菌落長勢較好、個體較大的20個菌落進行保存分析，分別命名為gsm5-01～20。

三、篩選

選擇長勢較好、個體較大的菌落(gsm5-01～20)接種至含有較高濃度的甲醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶/平板發(fā)酵驗證，篩選出能高效利用和耐受甲醇的優(yōu)良菌株。

實施例2、巴斯德畢赤酵母菌利用甲醇的能力評價

一、菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

將實施例1馴化得到的能高效利用和耐受甲醇的優(yōu)良菌株分別接種于25mlbmgy液體培養(yǎng)基中(10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨，121℃滅菌20min后，溫度降至室溫時加入13.4g/lynb、4×10^-4g/l生物素、20g/l甘油)，于30℃，200r/min搖床培養(yǎng)，5000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌菌體1～2次。調整菌株的od600＝8，接入復合培養(yǎng)基bmmy或者鹽培養(yǎng)基bsm(硫酸銨5g/l，硫酸鈣0.46g/l，硫酸鉀9.1g/l，七水硫酸鎂14.9g/l，磷酸二氫鉀6.8g/l，甘油40g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，ptm(五水硫酸銅6g/l，碘化鉀0.08g/l，硫酸錳2.68g/l，硼酸0.02g/l，二水鉬酸鈉0.2g/l，七水硫酸鋅20g/l，七水硫酸亞鐵65g/l，六水氯化鈷0.916g/l，硫酸5ml/l，生物素0.2g/l)14ml/l)中進行培養(yǎng)，每隔12h加入終濃度為1.2％甲醇，30℃，200r/min搖床培養(yǎng)，以巴斯德畢赤酵母gs115為對照。

二、檢測指標

1、od600

在菌株培養(yǎng)的過程中，每隔一段時間取樣檢測菌株的生長情況即od600。采用比色法進行，取1ml發(fā)酵液于1.5ml離心管中，離心(5000r/min，5min)，去上清液，用生理鹽水洗滌后，重懸酵母細胞，稀釋適當的倍數后，采用紫外分光光度計在600nm下用0.5cm光徑的比色皿測定吸光度，再乘以相應的稀釋倍數即為酵母的od600。

2、菌株耐受甲醇能力的平板檢測

取培養(yǎng)后的各菌株發(fā)酵液，調整各菌株的od600為同一值，經梯度稀釋不同的倍數后，各取10μl分別點樣于含有不同甲醇濃度(10g/l，20g/l，30g/l以及50g/l)的bmmy固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h后，比較各菌株的生長情況，以巴斯德畢赤酵母gs115作為對照。

3、甲醇含量的測定

每隔一段時間取樣檢測發(fā)酵液中的甲醇含量，檢測的方法為氣相色譜法，色譜柱為hp-624(30m×0.3m×21.8m)石英毛細管柱，柱溫為50℃保持5min，進樣口壓力為44.28kpa，進樣口溫度為200℃，檢測器溫度為220℃，采用高純氮氣為載氣，柱流量為1.3ml/min，進樣量為60μl，分流比為10：1。將待測樣品置于40℃恒溫平衡15min后，取60μl氣液平衡液進行色譜分析，以標準系列含量對峰面積繪制標準曲線，以保留時間定性，峰面積定量。

三、菌株評價結果

馴化后菌株耐受甲醇的能力評價結果如圖1所示。隨著甲醇濃度的提高(依次為10g/l，20g/l，30g/l以及50g/l)，對照菌株gs115的生長越來越緩慢，在含50g/l甲醇濃度的bmmy平板上幾乎看不到菌落生長。其他經過甲醇馴化的gsm5-01，gsm5-05以及gsm5-12均長勢良好，說明這些菌株均獲得了在較高甲醇濃度下生長的能力。

馴化后菌株在復合培養(yǎng)基bmmy中發(fā)酵的實驗結果如圖2所示。菌株在bmmy培養(yǎng)基中開始誘導，所有菌株起始od600均為8，每12h加入相當終濃度1.2％(v/v)的100％甲醇。結果顯示經過甲醇馴化的gsm5-01，gsm5-05以及gsm5-12的生長比出發(fā)菌株gs115顯著提高，特別是gsm5-01的最終菌濃度比gs115提高了1.38倍。馴化后菌株隨后在以甲醇為唯一碳源的鹽培養(yǎng)基bsm中進行生長評價(見圖3)。結果顯示經甲醇馴化的菌株在鹽培養(yǎng)基中的生長優(yōu)勢更加明顯，對照菌株gs115在高強度的甲醇流加條件下，生長受到了抑制，在整個發(fā)酵過程中生長十分緩慢，而經過馴化的菌株仍然可以照常生長，gsm5-01菌株在生長速率方面優(yōu)勢特別顯著，其最終菌濃度比gs115提高了1.95倍，這些結果說明了，經過較高濃度甲醇的馴化之后，這些菌株獲得了對甲醇高效耐受性，并且利用甲醇的能力也得到了大幅度的提升。

實施例3、巴斯德畢赤酵母在表達外源蛋白方面的應用

一、重組菌株的獲得

將來源于米曲霉(aspergillusoryzae，保藏編號為cgmcc3.05232，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)的乳糖酶(β-galactosidase)基因(序列如序列表中seqidno.2所示)通過插入表達載體paoαmh(序列如序列表中seqidno.1所示)的xhoi和noti位點，再分別轉入gs115以及gsm5-01，獲得重組菌株gs-aor以及gsm-aor。

二、重組菌株的培養(yǎng)

將菌株gs-aor以及gsm-aor接種于25mlbmgy液體培養(yǎng)基(具體成分即含量同實施例2中所述)中，于30℃、200r/min培養(yǎng)，5000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。調整菌株的od600＝8，接入復合培養(yǎng)基bmmy(具體成分即含量同實施例2中所述)中進行培養(yǎng)，每12h加入相當終濃度1.2％(v/v)的100％甲醇，以菌株gs115作為空白對照進行同樣的操作。

三、胞外乳糖酶酶活的測定

標準曲線的繪制：

分別移取鄰硝基苯酚儲備液(onp，稱取139.0mg的onp，用10ml96％的乙醇溶解后，轉移至1000ml的容量瓶中，用水定容并搖勻)2、4、6、8、10、12ml和14ml到100ml的容量瓶中，分別加入25ml的1mol/l的碳酸鈉溶液(稱取10.6gna2co3，用水定容至100ml)，再用醋酸緩沖液(稱取0.82g的醋酸鈉，溶解在100ml的水中，用醋酸調節(jié)溶液的ph為5.2)定容至刻度，搖勻，使鄰硝基苯酚的濃度分別是0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mmol/l和0.14mmol/l。采用酶標儀，在420nm處測定每個稀釋液的吸光度。

樣品的測定：

取25μl經過適當稀釋的發(fā)酵液(需采用0.1mol/lph5.2的醋酸緩沖液進行稀釋)，加入100μl0.25％的鄰硝基苯-β-d-半乳糖苷(onpg)底物(稱取250.0mgonpg，用0.1mol/lph5.2的醋酸緩沖液定容至100ml)，在60℃水浴中精確反應10min后，迅速加入125μl1mol/l碳酸鈉溶液終止反應。

空白的制備：

將添加onpg底物和碳酸鈉溶液的順序顛倒，其余步驟與樣品處理方式相同。

酶活的定義：

在ph5.2、60℃下，每分鐘分解onpg生成1μmolonp所需的酶量為一個酶活力單位(u)。

發(fā)酵72h后，各菌株搖瓶發(fā)酵液酶活見表1。

表1不同菌株的酶活

由表可知，空白菌株在誘導發(fā)酵72h后，沒有檢測到乳糖酶酶活，而重組菌株均能檢測到明顯的酶活，說明乳糖酶基因在畢赤酵母中成功實現了表達，且以經過甲醇馴化獲得的菌株作為宿主表達乳糖酶的重組菌株gsm-aor(113u/ml)，其酶活顯著高于對照菌株gs-aor(42u/ml)。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。