本發(fā)明涉及生物工程領域的一種蛋白酶水解腸粘膜工藝。

背景技術：

肝素鈉是一種富含陰離子的粘多糖硫酸酯，由動物體內(nèi)的肥大細胞和嗜堿性粒細胞產(chǎn)生，因最初從肝臟中提取，故名肝素。臨床使用的肝素是從動物腸、肺粘膜、血管壁等處提取獲得的鈉(鋰)鹽，肝素鈉(鋰)具有抗凝血、抗炎、抗癌等多種生物學功能，但長期使用會有諸如出血、骨折等負作用。20世紀80年代初期發(fā)現(xiàn)低分子肝素鈉(lmwh，(8000da)具有更強的活性和較小負作用，成為主要的臨床抗凝血藥。

目前國外已有10多種lmwh相繼問世，全球四大制藥企業(yè)均有該類產(chǎn)品的銷售，我國是主要的肝素原料國，產(chǎn)量約占全球的一半。應用于臨床的lmwh是由普通肝素為原料制備獲得，制備方法主要有生物酶法、化學裂解法兩種。它們各有優(yōu)勢，肝素酶降解反應條件溫和、專一性高、副產(chǎn)物少而且引入一個紫外生色團，檢測方便，但酶的價格昂貴，難以跨越工業(yè)生產(chǎn)的界線?；瘜W裂解法不可避免的會改變肝素鈉的結構、影響活性等。中國專利(授權號cnl096034)公開了一種純化的肝素裂分其制備方法和含有它們的藥物組合物。純化的肝素裂分通過如下步驟制備：向肝素鈉中加入亞硝酸鹽，phl—5處理20—50分鐘，再在堿介質(zhì)中以硼氫化鈉還原，用hcl破壞過量硼氫化鈉并用乙醇沉淀分級，將得到的溶液暴露在紫外照射系統(tǒng)下，溫度為5℃一50℃，ph為3—8，色譜純化，最后用氯化鈉和乙醇沉淀分離得降解肝素鈉。美國專利(公開號3099600)公開了一種色譜技術分離純化肝素鈉的方法：將肝素鈉粗品溶于緩沖溶液中，加入5—12倍肝素鈉重量的離子交換樹脂team-c01lulose或deae-c01lulose，后用緩沖液洗滌，鹽洗脫，乙醇沉淀、干燥得產(chǎn)品。上述方法為工業(yè)上典型的制備及純化肝素鈉的過程，生產(chǎn)工藝復雜、成本高，而且沒有提及對肝素鈉的結構類似物多硫酸軟骨素這一主要雜質(zhì)的去除方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為了改進現(xiàn)有技術的不足而提供一種蛋白酶水解腸粘膜工藝；

該發(fā)明提供一種簡便的低分子肝素鈉制備、純化技術，制得的低分子肝素鈉平均分子質(zhì)量在4．5kda左右，效價不低于180u／mg，高于中國藥典要求的170u／mg，且依據(jù)中國藥典肝素鈉檢測標準檢測合格。

本發(fā)明的技術方案為：一種蛋白酶水解腸粘膜工藝，其具體步驟如下：

(1)將粗品肝素鈉溶于nacl溶液中，機械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入堿液直至產(chǎn)生沉淀，靜置，過濾除去不溶物，得濾液。

(2)將步驟(1)中濾液以堿液調(diào)ph至9．5—11，加入h202溶液，在10—30℃

下反應2．5—3．5小時，得反應液。

(3)將步驟(2)得到的反應液升溫至30—50℃，此后每隔2．5—3．5小時補加h20。

(4)向步驟(3)得到的反應液中加入吸附劑，磁力攪拌，過濾除不溶物，得濾液；

(5)將步驟(4)中的濾液通過平衡好的凝膠色譜柱，收集低分子量的肝素鈉洗脫液。

(6)將步驟(5)中的低分子量的肝素鈉洗脫液用弱堿性離子交換樹脂吸附，分別以三種濃度的nacl溶液洗脫，收集第一種(最低)、第三種(最高)濃度的nacl洗脫液并混合。

(7)將步驟(6)中的混合洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一5—8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。

步驟(1)中nacl溶液的質(zhì)量百分濃度為1．2—1．8％；nacl溶液的用量為2—3ml／g肝素鈉粗品量；靜置時間1—2小時。

步驟(1)和(2)的堿液均為naoh或koh溶液；堿液的濃度為1—1．5mol/l。

步驟(2)和(3)中所加入的h202溶液和nacl溶液的體積比為3—5：100；步驟(2)中h202溶液的濃度為1—5mol/l，步驟(3)中h202溶液的濃度為1—3mol/l。

步驟(3)中每次補加完h20：溶液后測定ph，使ph在6．8—7．5之間。步驟(4)中所述的吸附劑為活性碳、皂土或硅酸鹽；吸附劑的加入量為3—5g／100mlnacl溶液量。

步驟(5)中所述的凝膠色譜柱為sephadex6-25，樣品層為15—25％柱床體積，柱的徑／高為1：5—7；以質(zhì)量百分濃度4—6％nacl溶液平衡并洗脫，流速為一個柱床體積／1．5—2小時，收集60—90mim時的洗脫液。

步驟(6)中三種濃度的nacl溶液分別為0．1—0．3g/l、0．4—0．6g/l、0．7—0．9g/l；其洗脫時間均為1．8—2．5小時，樣品層為15—25％柱床體積。

步驟(6)中所用的弱堿性離子交換樹脂是d301、d315、d318或330，柱的高／徑比為6—8：1。

三種濃度的nacl溶液洗脫，收集第一種(最低)、第三種(最高)濃度的nacl洗脫液并混合。

(7)將步驟(6)中的混合洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一5—8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。

優(yōu)選步驟(1)中nacl溶液的質(zhì)量百分濃度為1．2—1．8％；nacl溶液的用量為2—3ml／g肝素鈉粗品量；靜置時間1—2小時；優(yōu)選步驟(1)和(2)的堿液均為naoh或koh溶液；堿液的濃度為1—1．5m0ol/l。

優(yōu)選步驟(2)和(3)中所加入的h202溶液和nacl溶液的體積比為3—5：100；步驟(2)中h202溶液的濃度為1—5m0ol/l，步驟(3)中h202溶液的濃度為1—3m0ol/l。步驟(3)中每次補加完h202溶液后測定ph，使ph在6．8—7．5之間。

優(yōu)選步驟(4)中所述的吸附劑為活性碳、皂土或硅酸鹽；吸附劑的加入量為3—5g／100mlnacl溶液量。

優(yōu)選步驟(5)中所述的凝膠色譜柱為sephadex6-25，樣品層為15—25％柱床體積，柱的徑／高為1：5—7；以質(zhì)量百分濃度4—6％nacl溶液平衡并洗脫，流速為一個柱床體積／1．5—2小時，收集60—90mim時的洗脫液。

優(yōu)選步驟(6)中三種濃度的nacl溶液分別為0．1—0．3g/l、0．4—0．6g/l、0．7—0．9g/l；其洗脫時間均為1．8—2．5小時，樣品層為15—25％柱床體積。

優(yōu)選步驟(6)中所用的弱堿性離子交換樹脂是d301、d315、d318或330，柱的高／徑比為6—8：1。

有益效果：

(1)本發(fā)明采用補料升溫氧化結合離子交換樹脂法制備并純化得到平均分子量4．5kda低分子肝素鈉，其效價不低于180u／mg，回收率不低于75％。(2)通過升溫補加h202可以有效的控制肝素鈉氧化失活，并且實現(xiàn)了氧化與脫色同步進行。(3)依據(jù)肝素鈉及其結構類似物多硫酸軟骨素所含陰離子強度的差異，采用弱堿性陰離子交換樹脂吸附所有的多硫酸軟骨素和少量的肝素鈉，最后用低濃度鹽分步洗脫，得到肝素鈉產(chǎn)品。實驗采用的弱堿性陰離子交換樹脂，使得多硫酸軟骨素雜質(zhì)被吸附，而肝素鈉產(chǎn)品直接流出，并用分步鹽法洗脫吸附的少量肝素鈉，極大的提高了其回收率。最終得到的低分子肝素鈉產(chǎn)品達到中國藥典標準，并且經(jīng)檢測不含多硫酸軟骨素成分。

具體實施方式

以下結合實例來進一步解釋本發(fā)明，但實施案例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。

實施例1

將50g粗品肝素鈉溶于100ml質(zhì)量百分濃度1．2％nacl溶液中，機械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入1m01／lnaoh直至產(chǎn)生沉淀，靜置1小時，過濾除去不溶物，得濾lm01/lnaoh調(diào)ph至9．5，加入3mllm01/l的h202，10℃，反應2．5小時。將反應液升溫至30℃，此后每隔3．5小時補加3mllm01/lh202，維持ph6．8，補料后共反應21h。向反應液中加入5g活性碳，磁力攪拌，過濾除不溶物，得濾液；以質(zhì)量百分濃度為4％nacl溶液平衡sephadexg—25柱，樣品層為15％柱床體積，柱徑／高為1：5，將濾液通過該柱，以質(zhì)量百分濃度4％nacl洗脫，流速為一個柱床體積／2小時，收集70—90min洗脫液；把洗脫液流經(jīng)d301色譜柱，樣品層為15％柱床體積，柱高／徑為6：1，分別以0．1、0．4、0．7(g/l)nacl洗脫1．8h，收集0．1、0．7g/lnacl洗脫液并合并；將該洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一5℃，此后用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。經(jīng)檢測，其效價為182u／mg，回收率79．1％，硫酸軟骨素0．0lmg／ml，硫酸皮膚素0．0lmg／ml，各項指標均符合中國藥典要求。