本發(fā)明涉及一種用于培育抗氧化微生物的基因。
背景技術(shù)：
：耐輻射異常球菌(deinococcusradioduransr1,dr)具有對電離輻射、uv輻射、dna損傷試劑等抗性，是研究微生物非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制的理想菌株。曾有人對耐輻射異常球菌中大量功能未知基因(如irre、csp等蛋白)進(jìn)行研究，比如，將d.radioduransr1中4個(gè)與植物抗旱相關(guān)的基因在原核宿主細(xì)胞和植物中表達(dá)后，能夠增強(qiáng)宿主的耐鹽抗性等。然而，對本研究發(fā)現(xiàn)的來源于d.radioduransr1新基因dwh，并未見其在提高細(xì)胞抗氧化能力方面的研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是從d.radioduransr1中發(fā)現(xiàn)一種用于培育抗氧化微生物的新基因。本發(fā)明通過如下研究發(fā)現(xiàn)：1、耐輻射異常球菌r1中含有編碼why(waterstressandhypersensitiveresponse)類似蛋白的基因，命名為dwh，其核苷酸序列如seqidno.1所示，該基因編碼的蛋白(dwh蛋白)具有抗氧化的功能，可用于培育抗氧化微生物，進(jìn)而為培育具有抗氧化性狀的植物提供參考依據(jù)，其蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。2、利用http://web.expasy.org/protparam/對dwh蛋白氨基酸序列進(jìn)行在線預(yù)測，該蛋白由99個(gè)氨基酸組成，分子式c466h772n134o138，其分子量為10.46kda，理論等電點(diǎn)為9.94，不穩(wěn)定指數(shù)29.04，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)；對dwh蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白富含leu(15.15％)、val(12.12％)、ala(10.1％)、thr(10.1％)，帶負(fù)電氨基酸殘基總數(shù)(asp+glu)為7，帶正電氨基酸殘基總數(shù)(arg+lys)為9，其中疏水氨基酸殘基含量為50.5％，總平均疏水指數(shù)(gravy)為0.165，同時(shí)，采用kyte&doolittle方法對dwh蛋白進(jìn)行疏水性分析也顯示出其高度的疏水特性(圖1)。因此，推測該蛋白是一類典型的疏水蛋白。此外，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示(圖2)，dwh蛋白由6個(gè)β折疊和靠近c(diǎn)端的1個(gè)α螺旋組成。3、獲得d.radioduransr1dwh基因的缺失突變株δdwh通過pcr獲得dwh基因上下游基因片段(dwh-u和dwh-d)，同時(shí)獲得編碼卡那霉素抗性蛋白的km基因片段(k)(圖3)，采用融合pcr技術(shù)將dwh-u、k、dwh-d三片段融合，獲得dwh-ukd重組片段。然后將重組片段通過同源重組技術(shù)轉(zhuǎn)化d.radioduransr1感受態(tài)細(xì)胞，在含有km抗性的tgy平板上進(jìn)行壓力篩選，獲得dwh基因的缺失突變株δdwh，并進(jìn)行pcr及測序驗(yàn)證(圖4)(見實(shí)施例1)。4、d.radioduransr1dwh基因缺失突變株δdwh的抗氧化實(shí)驗(yàn)1)對野生型dr及突變株δdwh分別進(jìn)行氧化脅迫處理(80mmh2o2處理30min)，觀察不同菌株在氧化脅迫條件下的存活能力。結(jié)果顯示，氧化脅迫條件下試驗(yàn)菌株存活能力均有下降，缺失dwh基因的突變株δdwh與野生型dr菌株相比更加敏感，菌株存活能力下降1個(gè)數(shù)量級(見實(shí)施例2和圖5、6)。結(jié)果表明dwh基因編碼的蛋白對d.radioduransr1耐受氧化脅迫具有重要貢獻(xiàn)。2)對野生型dr及突變株δdwh分別進(jìn)行50mmh2o2處理30min，收集并洗滌菌體，用適量的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，離心獲得上清液總蛋白，并測定各樣品總蛋白濃度。測定野生型dr及突變株δdwh細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性(cat、pod、sod)。結(jié)果顯示，氧化脅迫條件下，突變株δdwh的抗氧化酶活性與野生型dr菌株相比，均有所下降，cat和pod下降更加明顯(見實(shí)施例2和圖7)。以上結(jié)果表明，dwh基因在d.radioduransr1中表達(dá)能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，可能通過保護(hù)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶避免氧自由基的損傷，從而發(fā)揮保護(hù)功能。5、獲得含有d.radioduransr1dwh基因的重組工程菌株1)通過pcr從d.radioduransr1(cgmcc1.633)菌株基因組擴(kuò)增dwh基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。核苷酸長度為297bp(圖8)，該基因編碼99個(gè)氨基酸，將其克隆于載體pjet1.2/blunt上，構(gòu)建了含有完整dwh基因的重組質(zhì)粒pjet-dwh(圖9)；2)將dwh基因連接于pet28a表達(dá)載體上，構(gòu)建含有完整dwh基因的重組質(zhì)粒pet28a-dwh；3)將導(dǎo)入dwh基因的重組質(zhì)粒pet28a-dwh轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞受體大腸桿菌bl21中，獲得重組工程菌株pet28a-dwh/bl21(見實(shí)施例3)；6、含有d.radioduransr1dwh基因工程菌株的抗氧化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)30mmh2o2處理10min后，含有d.radioduransr1dwh基因的pet28a-dwh/bl21重組菌株生長狀況良好，菌落生存能力遠(yuǎn)高于只含空質(zhì)粒的對照pet28a/bl21菌株(見實(shí)施例4及圖10、11)。結(jié)果顯示該工程菌株具有耐受高濃度h2o2 脅迫的能力。此實(shí)驗(yàn)表明：d.radioduransr1dwh基因具有提高大腸桿菌抗氧化的能力。附圖說明：圖1是d.radioduransr1dwh蛋白的親/疏水性分析圖譜(其中橫坐標(biāo)表示氨基酸序列，縱坐標(biāo)表示疏水性分值，疏水性分值越大表明該氨基酸疏水性越強(qiáng)；hydrophilic——親水，hydrophobic——疏水)；圖2是d.radioduransr1dwh蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析圖譜；圖3是dwh基因上游dwh-u(1)、下游dwh-d(2)及抗性基因k(3)片段的pcr產(chǎn)物電泳圖譜；圖4是突變株δdwh的pcr驗(yàn)證圖譜(泳道1-3:引物yzdwh-f/r分別以突變株δdwh、野生型dr、無菌水為模板擴(kuò)增dwh片段，驗(yàn)證dwh缺失完全；泳道4-6:引物yzdwh-u-f/d-r分別以突變株δdwh、野生型dr、無菌水為模板擴(kuò)增重組片段，驗(yàn)證dwh-ukd插入位置)；圖5是h2o2沖擊試驗(yàn)前的野生型dr和突變株δdwh生存能力的菌落照片，其中：a是野生型的d.radioduransr1菌株(dr)；b是缺失dwh基因的d.radioduransr1突變體菌株(δdwh)；圖6是野生型dr和突變株δdwh經(jīng)80mmh2o2處理30min后，在tgy固體培養(yǎng)基中生長情況的菌落照片，其中：a是野生型的d.radioduransr1菌株(dr)；b是缺失dwh基因的d.radioduransr1突變體菌株(δdwh)；圖7是野生型dr和突變株δdwh經(jīng)50mmh2o2處理30min后，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性的變化，其中：a是突變株δdwh在h2o2處理前后與野生型dr相比，細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶(cat)活性的變化；b是突變株δdwh在h2o2處理前后與野生型dr相比，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶(pod)活性的變化；c是突變株δdwh在h2o2處理前后與野生型dr相比，細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶(sod)活性的變化；圖8含有d.radioduransr1dwh基因的pcr產(chǎn)物的驗(yàn)證電泳圖譜；圖9是含有d.radioduransr1dwh基因的原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建驗(yàn)證電泳圖譜；圖10是在h2o2沖擊試驗(yàn)前的含有空質(zhì)粒和含有d.radioduransr1dwh基因的原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌的生長狀況的菌落照片，其中：a是含有空表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌bl21菌株；b是含有d.radioduransr1dwh基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌株；圖11是含有d.radioduransr1dwh基因的原核表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒的大腸桿菌(e.coli)經(jīng)受30mmh2o2處理10min后，在lb固體培養(yǎng)基中的生長情況的菌落照片，其中：a是含有空表達(dá)質(zhì)粒的對照大腸桿菌菌株(pet28a/bl21)；b是含有d.radioduransr1dwh基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌株(pet28a-dwh/bl21)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只是用于對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，并不對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容加以限制。凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株及試劑如下：(1)質(zhì)粒：平末端克隆載體pjet1.2/blunt(amp)購自thermoscientific公司，pkataph3(攜帶km抗性基因)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)保存，表達(dá)載體pet28a由本實(shí)驗(yàn)室保存，pjet-dwh(dwh基因片段與克隆載體pjet1.2/blunt連接)、pet28a-dwh(dwh基因片段與克隆載體pet28a通過酶切連接)重組質(zhì)粒由本研究構(gòu)建。(2)實(shí)驗(yàn)菌株：耐輻射異常球菌deinococcusradioduransrl野生型菌株(cgmcc1.633)由中國普通微生物菌種保藏中心提供；突變株δdwh(缺失dwh基因的d.radioduransrl菌株)由本研究構(gòu)建，d.radioduransrl及其突變菌株均在tgy培養(yǎng)基中生長，最適培養(yǎng)溫度為30℃；大腸桿菌escherichiacolitrans109及bl21菌株購自北京全式金生物技術(shù)公司；pet28a/bl21(空載體pet28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21菌株獲得的重組菌株)、pet28a-dwh/bl21(重組質(zhì)粒pet28a-dwh轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21菌株獲得的重組菌株)由本研究構(gòu)建，e.coli及其重組菌株均在lb培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)溫度為37℃。(3)生化試劑：限制性內(nèi)切酶購自neb公司；dntps、高保真primestarhsdnapolymerase、t4dna連接酶等購自大連寶生物公司(takara)；瓊脂糖凝膠dna回收試 劑盒、普通dna產(chǎn)物純化試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技公司(tiangen)；30％h2o2、iptg、抗生素等購自阿拉丁(aladdin)；實(shí)驗(yàn)中所用引物合成及測序均由華大基因公司完成。(4)培養(yǎng)基：lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，ph調(diào)至7.0，固體培養(yǎng)基中加入agar15g/l。高壓蒸汽(121℃,1.034×105pa)滅菌30min。tgy培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖1g/l，固體培養(yǎng)基中加入agar15g/l。高壓蒸汽(112℃,1.034×105pa)滅菌30min。(5)抗生素及主要溶液配制：氨芐青霉素(amp)(50mg/ml)：稱取0.5g氨芐青霉素粉末，溶于10ml雙蒸水中，濾膜過濾除雜后分裝，保存于-20℃冰箱；卡那霉素(km)(50mg/ml)：稱取0.5g卡那霉素粉末，溶于10ml雙蒸水中，濾膜過濾除雜后分裝，保存于-20℃冰箱；iptg(100mmol/l)：稱取0.24giptg，溶于10ml雙蒸水中，濾膜過濾除菌后分裝，保存于-20℃冰箱；cacl2(0.3mol/l)：稱取4.5gcacl2·2h2o粉末，溶解于80ml雙蒸水中，定容至100ml，高壓蒸汽(121℃)滅菌；0.1mol/lh2o2：30％的h2o2溶液5.68ml稀釋至1000ml；130mmol/l甲硫氨酸met溶液：稱1.9399gmet用磷酸緩沖液定容至100ml；750μmol/l氮藍(lán)四唑nbt溶液：稱0.06133gnbt用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存；100μmol/ledta-na2溶液：稱0.03721gedta-na2，用磷酸緩沖液定容至1000ml；20μmol/l核黃素溶液：稱0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存；0.05mol/l愈創(chuàng)木酚溶液：稱取6.2065g(124.13g/mol×0.05mol)，然后溶于1l95％乙醇中，即為1l的0.05mol/l愈創(chuàng)木酚溶液；2％h2o2：吸取20ml30％h2o2溶于280ml蒸餾水中，即為300ml的2％h2o2。所用pbs溶液按照分子克隆手冊配備。實(shí)施例1獲得d.radioduransr1dwh基因的缺失突變株δdwh從ncbi的genebank中獲得d.radioduransr1全基因組序列和質(zhì)粒pkataph3序列，根據(jù)dwh基因序列和卡那抗性基因序列設(shè)計(jì)引物(見表1)。表1基因片段擴(kuò)增所用的引物采用融合pcr方法構(gòu)建突變株δdwh。以d.radioduransr1基因組dna為模板，分別用表1中合成的引物u-f/u-r擴(kuò)增dwh基因上游片段，擴(kuò)增產(chǎn)物dwh-u長度為749bp；用d-f/d-r引物擴(kuò)增dwh基因下游片段，擴(kuò)增產(chǎn)物dwh-d長度為595bp；以pkataph3質(zhì)粒為模板，用k-f/k-r引物擴(kuò)增卡那抗性基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物k長度為1007bp。分別對各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，條帶單一(圖3)，在反應(yīng)體系中加入等摩爾的三片段產(chǎn)物，引物u-f/d-r，采用一步融合法進(jìn)行融合pcr反應(yīng)，得到三片段的融合產(chǎn)物dwh-ukd(2268bp)。pcr反應(yīng)條件為：94℃10min；94℃1min；60℃1min；72℃5min；17個(gè)循環(huán)；94℃1min；60℃1min；72℃3min；30個(gè)循環(huán)；72℃10min。對融合產(chǎn)物dwh-ukd(2268bp)進(jìn)行測序驗(yàn)證，完全與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列一致。通過同源重組轉(zhuǎn)化野生型d.radioduransr1。在含有10μg/ml的km平板上篩選缺失突變株δdwh。通過pcr方法對δdwh進(jìn)行鑒定。以突變株δdwh基因組dna為模板，用yzdwh-f/ yzdwh-r引物擴(kuò)增dwh基因片段，未獲得346bp條帶，而在陰性對照d.radioduransr1基因組dna中能夠擴(kuò)增出346bp大小條帶；用yzdwh-u-f/yzdwh-d-r引物擴(kuò)增yzdwh-ukd片段僅獲得2591bp條帶，以d.radioduransr1基因組dna為模板擴(kuò)增獲得1985bp條帶，同時(shí)以無菌水作空白對照。結(jié)果表明卡那抗性基因完全替代了dwh基因，完整的整合到dwh基因在d.radioduransr1基因組dna上所在的位置(圖4)。實(shí)施例2d.radioduransr1dwh基因缺失突變株δdwh的抗氧化實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)方法(1)菌株的抗氧化表型實(shí)驗(yàn)分別從劃線培養(yǎng)的tgy平板上挑取野生型dr與突變株δdwh單菌落接種到2mltgy液體培養(yǎng)基中(突變株培養(yǎng)基中含有10μg/mlkm抗生素)，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期，1％分別轉(zhuǎn)接到新鮮的50mltgy液體培養(yǎng)基中(突變株培養(yǎng)基中含有10μg/mlkm抗生素)，培養(yǎng)至對數(shù)初期(od600約為0.6)，各取1ml菌液，分別加入8μl30％h2o2溶液，至菌液的h2o2終濃度為80mm(10mmh2o2≈1μl30％h2o2)，并設(shè)置對照組(未加入h2o2)，30℃搖床分別溫育30min后，立即用無菌去離子水等比稀釋(10-1至10-5)。每個(gè)稀釋度各取10μl點(diǎn)在tgy固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)30℃恒溫培養(yǎng)2-3天，觀察野生型和突變株在tgy培養(yǎng)基平板上的生長情況。分別進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(2)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活測定分別從劃線培養(yǎng)的tgy平板上挑取野生型dr與突變株δdwh單菌落接種到20mltgy液體培養(yǎng)基中(突變株培養(yǎng)基中含有10μg/mlkm抗生素)，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期，1％分別轉(zhuǎn)接到200ml新鮮tgy液體培養(yǎng)基中(突變株培養(yǎng)基中含有10μg/mlkm抗生素)，30℃220rpm培養(yǎng)至對數(shù)初期(od600約為0.6)，分別用50mmh2o2處理野生型dr與突變株δdwh，并設(shè)置對照組(未加入h2o2的野生型dr與突變株δdwh)，搖床避光處理30min后，立即收菌(4℃8000rpm10min)，用無菌水洗滌菌體兩次，最后重懸于5ml50mmph7.0的pbs緩沖液中；于冰上進(jìn)行超聲破碎處理細(xì)胞(功率不超過200w，工作2s，間隔3s，處理時(shí)間45～60min，變幅桿φ3)，4℃12000rpm20min離心，于冰上分裝后測定各個(gè)樣品總蛋白濃度(bradford方法)，并保存總蛋白于-20℃。a細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(cat)活性測定①室溫條件下(25℃)，取1.5mlep管，其中一個(gè)為樣品測定管(每個(gè)樣品1個(gè))，另一個(gè)為空白對照管(ck)，按表2順序加入試劑。表2過氧化氫酶(cat)活性測定各組分配方表試劑對照管ck樣品管0.2mph7.8pbs(μl)10090～950.1mh2o2(μl)100100粗酶液(μl)05～10總體積(μl)200200用uv-3010分光光度計(jì)測定，關(guān)掉鎢燈wi(340～1200nm)，打開氘燈d2(190～340nm)，先調(diào)零，內(nèi)側(cè)比色皿加入1ml0.2mph7.8pbs，外側(cè)比色皿先加入ck溶液(200μl)，迅速調(diào)零；②樣品測定時(shí)，按表2順序加入各成分，并迅速混合，立即開始計(jì)時(shí)，240nm下測定其吸光度，分別于15s、30s、45s、1min、1.5min、2min、3min讀數(shù)。③待所有樣品全部測完后，按下列公式計(jì)算酶活性。以1min內(nèi)a240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位(unit)。cat活性(unit/μg·μl-1·min)＝δa240·v1/(0.1·v2·t·c)式中：δa240為樣品管吸光值的絕對值；v1為反應(yīng)液總體積(μl)；v2為測定用粗酶提取液體積(μl)；c為粗酶提取液總蛋白濃度(μg·μl-1)；0.1為a240每下降0.1為1個(gè)酶活單位(u)；t為過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min)。b細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶(pod)活性測定①酶活性測定顯色反應(yīng)體系如下：表3過氧化物酶(pod)活性測定各組分配方表試劑對照管ck樣品管0.05mph5.5pbs(μl)300290～2952％h2o2(μl)1001000.05mol/l愈創(chuàng)木酚100100粗酶液(μl)05～10總體積(μl)500500②首先調(diào)零：按照反應(yīng)體系設(shè)置對照組ck，34℃保溫3min后加入500μl0.05mph5.5pbs，分別于內(nèi)側(cè)石英比色皿加入1ml0.05mph5.5pbs，外側(cè)比色皿加入ck溶液 (200μl)，470nm波長下調(diào)零；③同樣，樣品測定時(shí)首先按照表1-2的樣品管加入各組分，待加入酶液后，立即于34℃保溫3min。然后立即加入500μl0.05mph5.5pbs，迅速稀釋1倍，470nm波長下測定，每隔1min記錄1次吸光度，分別測定1、2、3、4、5、6、7、8min的吸光值；④待所有樣品全部測完后，按下列公式計(jì)算酶活性。以每分鐘內(nèi)a470變化0.01為1個(gè)酶活性單位(unit)。⑤按下列公式計(jì)算出過氧化物酶活性unit/(μg·μl-1·min)。pod活性＝δa470·v1/(0.01·v2·t·c)δa470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，即所測得的a470讀數(shù)；v1為反應(yīng)液總體積(μl)；v2為測定用粗酶提取液體積(μl)；c為粗酶提取液總蛋白濃度(μg·μl-1)；0.01為a470每變化0.01為1個(gè)酶活單位(u)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)。c細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶(pod)活性測定①sod酶活性測定反應(yīng)體系，在具塞試管(10ml)中按表4依次加入以下溶液：表4超氧化物歧化酶(sod)活性測定各組分配方表試劑對照管ck樣品管0.05mol/lph7.8pbs(ml)1.51.45～1.47130mmol/l甲硫氨酸met溶液(ml)0.30.3750μmol/l氮藍(lán)四唑nbt溶液(ml)0.30.3100μmol/ledta-na2溶液(ml)0.30.320μmol/l核黃素溶液(ml)0.30.3蒸餾水(ml)0.250.25酶液(ml)00.05～0.03總體積(ml)33②混勻后將1支對照管置暗處不照光，其他各管于4000lx日光下反應(yīng)20min。③至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管設(shè)置空白，分別取樣品200μl于酶標(biāo)板中，測定各管在560nm處的吸光值。④按下列公式計(jì)算出sod活性u/(μg·μl-1)。sod活性單位以抑制nbt光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示。sod活性＝(ack-ae)·v1/(0.5·ack·c·v2)ack為照光對照管的吸光值，ae為樣品管的吸光值，v1為反應(yīng)液總體積(μl)，v2為測定用粗酶提取液體積(μl)，c為粗酶提取液總蛋白濃度(μg·μl-1)。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)氧化脅迫對菌株具有強(qiáng)烈的殺傷作用，利用過氧化氫溶液進(jìn)行氧化沖擊處理，分析高濃度h2o2對野生型dr和突變株δdwh生長的影響。圖5和圖6是h2o2沖擊試驗(yàn)前后的d.radioduransr1菌株的生長狀況的菌落照片，其中：a是野生型dr菌株；b是缺失dwh基因的d.radioduransr1突變株δdwh；從圖中可清楚看出：h2o2處理前：野生型dr菌株與缺失dwh基因的突變株δdwh生長能力基本一致(見圖5)；h2o2處理后：經(jīng)80mmh2o2處理后，野生型dr菌株與缺失dwh基因的突變株δdwh的生存能力均有所下降，而突變株δdwh對氧化脅迫更加敏感；突變株δdwh較野生型dr菌株的菌落形成相差至少一個(gè)數(shù)量級，其生存能力遠(yuǎn)低于野生型dr菌株(見圖6)。(2)分別用50mmh2o2處理野生型dr菌株與缺失dwh基因的突變株δdwh30min，測定四個(gè)不同菌株樣品(dr、dr-h2o2、δdwh、δdwh-h2o2)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(cat、pod、sod)活性(圖7)，結(jié)果顯示，未處理的δdwh細(xì)胞內(nèi)的三種抗氧化酶活性均低于野生型dr菌株，表明dwh基因缺失導(dǎo)致d.radioduransr1細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性下降；經(jīng)50mmh2o2處理的野生型(dr-h2o2)和突變株(δdwh-h2o2)與未處理的對照相比，抗氧化酶活性均有所下降(sod活性除外)(圖7c)，突變株δdwh的抗氧化酶活性下降更加顯著，尤其是h2o2處理的突變株δdwh中cat(圖7a)和pod(圖7b)的酶活性下降為野生型dr的6％-10％，表明氧化脅迫條件下，缺失dwh基因的突變株δdwh清除氧自由基的能力下降。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論野生型dr菌株對氧化脅迫的抗性高于缺失dwh基因的突變株δdwh，dwh基因的缺失減弱了d.radioduransr1清除氧自由基(ros)的能力。實(shí)施例3d.radioduransr1dwh基因在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)已公布的d.radioduransr1基因組中的dwh基因序列設(shè)計(jì)1對pcr特異性引物，從d.radioduransr1基因組dna中擴(kuò)增完整的核苷酸序列：up5′cgggatccatgctcacgagtttcagttt3′；down5′cccaagctttcacgtcagagttccgtcca3′。通過pcr方法從d.radioduransr1的基因組中擴(kuò)增出目的基因片段，反應(yīng)條件：95℃10min，[95℃30sec，62℃30sec，72℃30sec]35個(gè)循環(huán)，72℃10min，pcr產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆于平末端載體pjet1.2/blunt上，命名為pjet-dwh，并測序驗(yàn)證；然后通過bamhi/hindiii雙酶切獲得含有粘性末端的pet28a表達(dá)載體及dwh基因片段，將dwh片段連接于pet28a載體上，構(gòu)建大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a-dwh，將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)pcr、質(zhì)粒酶切、測序驗(yàn)證插入序列正確(見圖8,9)，將該重組菌株命名為pet28a-dwh/bl21。將含有pet28a空質(zhì)粒的e.colibl21命名為pet28a/bl21。實(shí)施例4含d.radioduransr1dwh基因重組菌株的抗氧化實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)方法1、將實(shí)施例3中獲得的含有d.radioduransr1dwh基因的pet28a-dwh/bl21菌株與含空質(zhì)粒的pet28a/bl21菌株分別接種于20mllb液體培養(yǎng)基(含km抗生素)中，搖瓶過夜(37℃)培養(yǎng)后，再分別轉(zhuǎn)接于100ml的lb液體培養(yǎng)基中，保持接種量的一致，培養(yǎng)30min后加入終濃度為0.1mm的iptg，繼續(xù)培養(yǎng)至od600≈0.5即可。2、取1ml的菌液，加入30％的h2o2溶液3μl使菌液終濃度為30mm，處理10min后，每個(gè)樣品立即用無菌去離子水倍比稀釋至10-5，取10μl點(diǎn)在lb固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)37℃培養(yǎng)16h，觀察菌落形成情況并照相。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖10和圖11是h2o2沖擊試驗(yàn)前后的大腸桿菌的生長狀況的菌落照片，其中：a是含有空表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌bl21菌株；b是含有d.radioduransr1dwh基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌株；從圖中可清楚看出：h2o2處理前：含有d.radioduransr1dwh基因的pet28a-dwh/bl21菌株與含空質(zhì)粒的pet28a/bl21菌株生長能力基本一致(見圖10)；h2o2處理后：經(jīng)30mmh2o2處理后，只含空質(zhì)粒的pet28a/bl21菌株幾乎不能正常生長；含有d.radioduransr1dwh基因的pet28a-dwh/bl21重組菌株生長狀況良好，其生存 能力遠(yuǎn)高于只含空質(zhì)粒的pet28a/bl21菌株，對照菌株pet28a/bl21幾乎不能正常生長(見圖11)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論含有d.radioduransr1dwh基因的重組菌株對氧化脅迫的抗性遠(yuǎn)高于只含空質(zhì)粒的菌株，該基因的表達(dá)提高了大腸桿菌的抗氧化能力。當(dāng)前第1頁12