本發(fā)明涉及新型截短型人乳頭瘤病毒(hpv)58型l1蛋白、含有該蛋白的病毒樣顆粒和疫苗，以及其在預(yù)防hpv感染及感染相關(guān)病變中的用途。
背景技術(shù)：
：目前已分離鑒定了200多型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)，分為嗜黏膜組和嗜皮膚組。黏膜組的hpv主要感染泌尿生殖道、肛門肛周及口咽部的黏膜及周圍皮膚，誘發(fā)各種良惡性病變。根據(jù)誘發(fā)病變的性質(zhì)不同，可分為誘發(fā)惡性腫瘤的高危型(包括hpv16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等)、可疑高危型(hpv26,30,53,66,67,69,70,73,82,85等)、尚未確定型(hpv34,42,43,54,71,81,83,97,102,114等)，及誘發(fā)疣狀增生等良性病變的低危型(hpv6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,90,91,106等)。嗜皮膚組主要感染上述部位之外的皮膚組織，誘發(fā)皮膚疣狀增生，并與某些皮膚癌的發(fā)生密切相關(guān)。高危型hpv感染相關(guān)的惡性腫瘤目前已確定的有：宮頸癌、陰道癌、陰唇癌、陰莖癌、肛門肛周癌、口咽癌、扁桃體癌、口腔癌，其中以宮頸癌的危害最大。宮頸癌是世界范圍第三高發(fā)的婦女惡性腫瘤，年發(fā)病率約52.7萬，其中亞洲地區(qū)28.5萬；中國的年發(fā)病數(shù)7.5萬。研究發(fā)現(xiàn)病毒的主要外殼蛋白l1體外表達(dá)后可組裝成l1病毒樣顆粒(vlp)，l1vlp的結(jié)構(gòu)及形態(tài)與病毒顆粒的天然結(jié)構(gòu)類似，具有很強(qiáng)的免疫原性。目前國外上市的三種hpv預(yù)防性疫苗均為hpvl1vlp疫苗，包括葛蘭素史克的hpv16/18雙價(jià)疫苗、默沙東的hpv16/18/6/11四價(jià)疫苗及hpv16/18/58/52/31/33/45/6/11九價(jià)疫苗，人群免疫后，免疫活性好、預(yù)防感染及感染相關(guān)疾病的保護(hù)效率高。在世界范圍內(nèi)，hpv58在宮頸癌中的檢出率為3.3％，但不同地區(qū)的hpv型別分布存在差異。在中國，hpv58在宮頸癌標(biāo)本中的檢出率達(dá)7.1％，僅次于hpv16和18型；且在癌前病變標(biāo)本中的檢出率達(dá)13％以上，僅次于hpv16型。因此深入研究hpv58l1vlp疫苗具有意義。目前多種不同的表達(dá)體系，包括昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、大腸桿菌表達(dá)體系等，均可用于hpv58l1vlp的表達(dá)生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)hpv58l1全長蛋白(專利cn101857870b)、n端截短的突變體(專利cn102336822b)、c端截短的突變體(專利cn104418942a)、及聯(lián)合n端截短5個(gè)氨基酸及c端截短23個(gè)氨基酸的gst融合突變體蛋白(專利cn105039358a)，采用特定的技術(shù)均可以組裝成hpv58l1vlp(全長hpv58l1蛋白序列為ncbi數(shù)據(jù)庫cax48979.1序列，n端截短從n端第一個(gè)氨基酸m開始)。但c端截短32或33個(gè)氨基酸的hpv58l1蛋白組裝的vlp結(jié)構(gòu)松散(李文生等，華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，24(6):537-539，2004；劉景會(huì)等，中國生物制品學(xué)雜志，28(3):233-238)。在hpv16l1的研究中發(fā)現(xiàn)，hpv16l1蛋白中即使出現(xiàn)1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的差異，均可影響其表達(dá)水平(touzea,mehdaouise,etal.j.clin.micr.1998；36(7):2046-2051)，且n端或c端截短不同長度的l1突變體表達(dá)水平有差異(cn104418942a，cn101293918b)。此外，在hpv58l1的研究中也發(fā)現(xiàn)，c端截短7個(gè)或19個(gè)氨基酸可提高l1蛋白的表達(dá)水平(cn104418942a)；不同的n端截短突變體之間表達(dá)水平亦存在差異(cn102336822b)，且截短蛋白的表達(dá)水平是難以預(yù)測(cè)的。目前有關(guān)n端截短2、3、4、7、8、10、11、12或13個(gè)氨基酸的突變體是否能形成vlp，以及n端截短2-13個(gè)氨基酸聯(lián)合c端截短24-29個(gè)氨基酸的hpv58l1突變體是否能形成vlp，尚未見有報(bào)道，上述方法獲得的截短型突變體的表達(dá)量的分析也不明確。由于本發(fā)明采用的n端和/或c端截短策略與目前已報(bào)道的截短方式差異大，相應(yīng)的截短型hpv58l1突變體蛋白表達(dá)水平如何及是否能組裝成vlp亦是無法預(yù)測(cè)的，需依靠具體的實(shí)驗(yàn)研究才能確定。因此，本發(fā)明涉及多種hpv58l1突變體在hpv58l1vlp疫苗研究中具有探索價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是獲得一種新的截短型hpv58l1蛋白、由其組成的病毒樣顆粒及含該病毒樣顆粒的疫苗，并研究該疫苗在預(yù)防hpv感染和感染相關(guān)疾病中的用途。本發(fā)明人經(jīng)研究出人意料地發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)貙?duì)hpv58l1蛋白的n端和/或c端進(jìn)行截短，可有效提高h(yuǎn)pv58l1蛋白在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量，該截短蛋白可組裝成vlp，并可誘發(fā)針對(duì)hpv58的保護(hù)性免疫反應(yīng)。本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已完成，在本文實(shí)施例中提供數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種與野生型hpv58l1蛋白(例如起始atg同ncbi數(shù)據(jù)庫cax48979.1序列)相比n端截短了2、3、4、7、8、10、11、12或13個(gè)氨基酸，c端保留完整讀碼框編碼的氨基酸或截短了24-29個(gè)氨基酸的hpv58l1蛋白。具體地，本發(fā)明涉及一種截短型hpv58l1蛋白，其中所述截短型hpv58l1蛋白與野生型hpv58l1蛋白相比，n端截短了2、3、4、7、8、10、11、12或13個(gè)氨基酸和/或c端截短了24、25、26、27、28或29個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明所述的截短型hpv58l1蛋白，其中所述截短型hpv58l1蛋白選自hpv58l1δn2、hpv58l1δn3、hpv58l1δn4、hpv58l1δn7、hpv58l1δn8、hpv58l1δn10、hpv58l1δn11、hpv58l1δn12、hpv58l1δn13、hpv58l1δn2c25、hpv58l1δn3c25、hpv58l1δn4c25、hpv58l1δn7c25、hpv58l1δn8c25、hpv58l1δn10c25、hpv58l1δn11c25、hpv58l1δn12c25、hpv58l1δn13c25、hpv58l1δn2c26、hpv58l1δn3c26、hpv58l1δn4c26、hpv58l1δn7c26、hpv58l1δn8c26、hpv58l1δn10c26、hpv58l1δn11c26、hpv58l1δn12c26和hpv58l1δn13c26。優(yōu)選地，本發(fā)明所述截短型hpv58l1蛋白在ncbi數(shù)據(jù)庫cax48979.1序列基礎(chǔ)上進(jìn)行截短；特別優(yōu)選地，所述截短型hpv58l1蛋白選自hpv58l1δn4c25(seqidno.1)及hpv58l1δn8c26(seqidno.2)。野生型hpv58l1蛋白也可選自但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫adk78678.1、adk78686.1、agq21863.1、adk78679.1、adk78323.1、adk78683.1等來自hpv58變異株的l1蛋白，相應(yīng)變異株的截短型l1蛋白為在上述截短型hpv58l1蛋白等同位置截短，如通過序列比較來評(píng)價(jià)。本發(fā)明第二方面涉及編碼本發(fā)明所述截短型hpv58l1蛋白的多核苷酸。本發(fā)明第三方面涉及含有上述第二方面所述多核苷酸的載體，所述載體選自重組bacmid和重組桿狀病毒。本發(fā)明第四方面涉及包含上述載體的昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明第五方面涉及一種hpv58l1病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒含有上述第一方面所述的hpv58l1蛋白，或由上述第一方面所述的hpv58l1蛋白組成。本發(fā)明第六方面涉及一種預(yù)防hpv感染或hpv感染相關(guān)病變的疫苗，該疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒，其中hpv58l1病毒樣顆粒的含量為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。優(yōu)選地，該疫苗還可包含至少1種選自其他嗜黏膜組和/或嗜皮膚組的hpv的病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。上述疫苗通常還包含疫苗用賦形劑或載體。優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒以及至少1種選自hpv2、5、6、7、11、16、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、51、52、53、56、57、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒以及hpv16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、59、68及73的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒以及hpv16、18、31、33、35、39、45及52的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒以及hpv16、18、及52的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒以及hpv16及18的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。特別優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv58l1病毒樣顆粒以及hpv16的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。本發(fā)明第七方面涉及一種包含第六方面所述疫苗及佐劑的可進(jìn)一步提高免疫反應(yīng)的新型疫苗。優(yōu)選地，所使用的佐劑為包含鋁佐劑、水包油乳劑或油包水乳劑及tlr刺激劑的佐劑組合物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所使用的佐劑為包含氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩(wěn)定劑的組合物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所使用的佐劑為包含mf59佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩(wěn)定劑的組合物。特別地，本發(fā)明涉及的復(fù)合佐劑為實(shí)施方案中所述的聚肌苷酸-聚胞苷酸及穩(wěn)定劑(pika)聯(lián)合氫氧化鋁佐劑組成的復(fù)合物，或聚肌苷酸-聚胞苷酸及穩(wěn)定劑(pika)聯(lián)合mf59佐劑組成的復(fù)合物，兩種復(fù)合佐劑與hpvvlp疫苗聯(lián)合使用均可有效提高疫苗的免疫活性。本發(fā)明第八方面涉及第七方面所述的疫苗在預(yù)防hpv感染或hpv感染相關(guān)疾病中的用途。相關(guān)術(shù)語的說明及解釋根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)”包括昆蟲細(xì)胞、重組桿狀病毒、重組bacmid及表達(dá)載體。其中昆蟲細(xì)胞來源于市場(chǎng)上可得到的細(xì)胞，在此舉例但不限于：sf9，sf21，highfive。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“野生型hpv58l1蛋白”的例子包括但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫中編號(hào)為cax48979.1的蛋白等長的全長l1蛋白。“截短型hpv58l1蛋白”或“截短型人乳頭瘤病毒58l1蛋白”的基因片段指的是其與野生型hpv58l1蛋白基因相比，在其5’端和/或3’端缺失編碼1個(gè)或多個(gè)氨基酸的核苷酸，其中“野生型hpv58l1蛋白”的全長序列例如但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫中的如下序列:adk78678.1、adk78686.1、agq21863.1等。根據(jù)本發(fā)明，表述“δnx”代表“n端截短x個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”，是指以起始甲硫氨酸為第1位氨基酸來計(jì)數(shù)，從n末端截去x個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸作為起始位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。例如“hpv58l1δn4”代表n端截短了4個(gè)氨基酸的hpv58l1蛋白，即刪除從起始甲硫氨酸開始的4個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸所獲得的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，表述“δcy”代表“c端截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”，是指從hpv58l1第498位氨基酸開始計(jì)數(shù)，截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。例如“hpv58l1δc1”代表c端截短第498位1個(gè)氨基酸所獲得的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，表述“δnxcy”代表“n端截短x個(gè)氨基酸同時(shí)c端截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”，是指以起始甲硫氨酸為第1位氨基酸來計(jì)數(shù)，從n末端截去x個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸作為起始位點(diǎn)，同時(shí)從hpv58l1第498位氨基酸開始計(jì)數(shù)，截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。例如“hpv58l1δn4c25”代表n端截短了4個(gè)氨基酸同時(shí)c端截短25個(gè)氨基酸的hpv58l1蛋白，即刪除從起始甲硫氨酸開始的4個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸，并且同時(shí)刪除c端第474-498位共計(jì)25個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疫苗用賦形劑或載體”是指選自一種或多種，包括但不限于：ph調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，ph調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽離子、陰離子或非離子型表面活性劑，舉例但不限于：tween80，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑舉例但不限于氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“人用佐劑”是指在臨床上可應(yīng)用于人體的佐劑，包括當(dāng)前已獲得批準(zhǔn)的和將來可能獲得批準(zhǔn)的各種佐劑，例如但不限于鋁佐劑、mf59及各種形式的佐劑組合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“乳劑”是指由水相成分、油相成分及乳化劑按適當(dāng)比例混合，經(jīng)乳化后形成的非均相液體分散體系。其中水相成分包括但不限于磷酸鹽緩沖液、hepes緩沖液等緩沖系統(tǒng)；油相成分為可代謝脂類，包括但不限于植物油、魚油、動(dòng)物油、合成油及其他脂類成分(例如但不限于角鯊烯、生育酚)；乳化劑為適宜的表面活性劑，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(span-85)、聚山梨酯80(tween-80)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“穩(wěn)定劑”是指可與佐劑中的聚肌苷酸-聚胞苷酸結(jié)合并起到穩(wěn)定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、慶大霉素)、無機(jī)鹽(例如但不限于氯化鈣、氯化鎂、磷酸鈣)、陽離子的有機(jī)復(fù)合物(例如但不限于硬脂酸鈣、葡萄糖酸鈣)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，優(yōu)選注射。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明疫苗優(yōu)選單位劑型使用，其中單位劑型中截短型hpv58l1蛋白病毒樣顆粒的劑量為5μg-80μg，優(yōu)選20μ-40μg。附圖說明圖1a-1c顯示了本發(fā)明實(shí)施例4中截短型hpv58l1在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)鑒定結(jié)果。結(jié)果顯示，27種截短型hpv58l1均可在昆蟲細(xì)胞中高水平表達(dá)。圖1a：1至9分別代表hpv58l1δn2、hpv58l1δn3、hpv58l1δn4、hpv58l1δn7、hpv58l1δn8、hpv58l1δn10、hpv58l1δn11、hpv58l1δn12和hpv58l1δn13重組蛋白；圖1b：1至9分別代表hpv58l1δn2c25、hpv58l1δn3c25、hpv58l1δn4c25、hpv58l1δn7c25、hpv58l1δn8c25、hpv58l1δn10c25、hpv58l1δn11c25、hpv58l1δn12c25和hpv58l1δn13c25重組蛋白；圖1c：1至9分別代表hpv58l1δn2c26、hpv58l1δn3c26、hpv58l1δn4c26、hpv58l1δn7c26、hpv58l1δn8c26、hpv58l1δn10c26、hpv58l1δn11c26、hpv58l1δn12c26和hpv58l1δn13c26重組蛋白。圖2a至2c顯示了本發(fā)明實(shí)施例6中純化后獲得的hpv58l1δn4、hpv58l1δn4c25及hpv58l1δn4c26突變體蛋白的動(dòng)態(tài)光散射分析結(jié)果。結(jié)果顯示hpv58l1δn4、hpv58l1δn4c25及hpv58l1δn4c26重組蛋白形成的病毒樣顆粒水化動(dòng)力學(xué)直徑分別為94.74nm，95.44nm和98.76nm，顆粒組裝的百分比均為100％。圖2a代表hpv58l1δn4；圖2b代表hpv58l1δn4c25；圖2c代表hpv58l1δn4c26。圖3a至3i顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中純化后獲得的截短型hpv58l1vlp的透射電鏡觀察結(jié)果。視野中可見大量的直徑為55nm左右的病毒樣顆粒，顆粒的大小與理論值相符，均一度好。bar＝200nm。圖3a至3i分別表示hpv58l1δn4vlp、hpv58l1δn8vlp、hpv58l1δn10vlp、hpv58l1δn4c25vlp、hpv58l1δn8c25vlp、hpv58l1δn10c25vlp、hpv58l1δn4c26vlp、hpv58l1δn8c26vlp和hpv58l1δn10c26vlp。圖4顯示了本發(fā)明實(shí)施例8中的hpv58l1δn4vlp、hpv58l1δn4c25vlp及hpv58l1δn4c26vlp接種小鼠后免疫血清hpv58中和抗體滴度的分析。圖5顯示了本發(fā)明實(shí)施例9中的hpv58l1δn4c25vlp蛋白聯(lián)合含pika的復(fù)合佐劑接種小鼠后免疫血清中和抗體滴度的分析，**：與無佐劑組相比，p<0.01；***：與無佐劑組相比，p<0.001；#：與單純pika組相比，p<0.05；##：與單純pika組相比，p<0.01；###：與單純pika組相比，p<0.001；&&：與單純alum組相比，p<0.01；&&&：與單純alum組相比，p<0.001。具體實(shí)施方式下面將通過非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍，因?yàn)閷?shí)施方案必然是多樣的。本說明書中使用的用語僅是為了闡述特定的實(shí)施方案，而非作為限制，本發(fā)明的范圍已界定在所附的權(quán)利要求中。除非特別說明，本說明書中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語均和本案所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所普遍明了的意義相同。下面就本發(fā)明的優(yōu)選方法和材料加以敘述，但是與本說明書中所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料均可用以實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法或產(chǎn)品說明書所描述的方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。本說明書中所提到的所有公開文獻(xiàn)均被并入于此作為參考，以揭示并說明所述公開文獻(xiàn)中的方法和/或材料。實(shí)施例1：截短型hpv58l1基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建用做模版的全長hpv58l1基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司全基因合成(seqidno：3)，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為ncbi數(shù)據(jù)庫中編號(hào)為cax48979.1的序列。用于構(gòu)建截短型hpv58l1基因的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體如下：58n2f：5’-gaattcgccgccaccatggtctggagaccctccgaagc-3’；58n3f：5’-gaattcgccgccaccatgtggagaccctccgaagcaacc-3’；58n4f：5’-gaattcgccgccaccatgagaccctccgaagcaaccg-3’；58n7f：5’-gaattcgccgccaccatggaagcaaccgtctatctcc-3’；58n8f：5’-gaattcgccgccaccatggcaaccgtctatctcccacc-3’；58n10f：5’-gaattcgccgccaccatggtctatctcccacccgtcc-3’；58n11f：5’-gaattcgccgccaccatgtatctcccacccgtccccg-3’；58n12f：5’-gaattcgccgccaccatgctcccacccgtccccgtcagc-3’；58n13f：5’-gaattcgccgccaccatgccacccgtccccgtcagcaaag-3’；58cr：5’-tctagaattattttttaacctttttgcgtttg-3’；58c25r：5’-tctagaattacaagccgctctgcagcagg-3’；58c26r：5’-tctagaattagccgctctgcagcaggaacttc-3’。上述引物的序列表示為序列表中的seqidno：6-17。以序列28為模版，使用58n2f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn2基因；使用58n3f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn3基因；使用58n4f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn4基因；使用58n7f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn7基因；使用58n8f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn8基因；使用58n10f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn10基因；使用58n11f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn11基因；使用58n12f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn12基因；使用58n13f/58cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn13基因；使用58n2f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn2c25基因；使用58n3f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn3c25基因；使用58n4f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn4c25基因(seqidno：4)；使用58n7f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn7c25基因；使用58n8f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn8c25基因；使用58n10f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn10c25基因；使用58n11f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn11c25基因；使用58n12f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn12c25基因；使用58n13f/58c25r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn13c25基因；使用58n2f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn2c26基因；使用58n3f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn3c26基因；使用58n4f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn4c26基因；使用58n7f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn7c26基因；使用58n8f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn8c26基因(seqidno：5)；使用58n10f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn10c26基因；使用58n11f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn11c26基因；使用58n12f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn12c26基因；使用58n13f/58c26r為引物，pcr擴(kuò)增hpv58l1δn13c26基因。pcr擴(kuò)增的方法都是公知的，例如專利cn101293918b。采用ecori/xbai酶切位點(diǎn)，分別對(duì)上述pcr擴(kuò)增得到的基因進(jìn)行酶切，并分別插入商業(yè)化表達(dá)載體pfastbac1(invitrogen公司生產(chǎn))中，得到包含截短型hpv58l1基因的重組表達(dá)載體：pfastbac1-58l1δn2、pfastbac1-58l1δn3、pfastbac1-58l1δn4、pfastbac1-58l1δn7、pfastbac1-58l1δn8、pfastbac1-58l1δn10、pfastbac1-58l1δn11、pfastbac1-58l1δn12、pfastbac1-58l1δn13、pfastbac1-58l1δn2c25、pfastbac1-58l1δn3c25、pfastbac1-58l1δn4c25、pfastbac1-58l1δn7c25、pfastbac1-58l1δn8c25、pfastbac1-58l1δn10c25、pfastbac1-58l1δn11c25、pfastbac1-58l1δn12c25、pfastbac1-58l1δn13c25、pfastbac1-58l1δn2c26、pfastbac1-58l1δn3c26、pfastbac1-58l1δn4c26、pfastbac1-58l1δn7c26、pfastbac1-58l1δn8c26、pfastbac1-58l1δn10c26、pfastbac1-58l1δn11c26、pfastbac1-58l1δn12c26、pfastbac1-58l1δn13c26。上述酶切、連接及克隆構(gòu)建的方法都是公知的，例如專利cn101293918b。實(shí)施例2：截短型hpv58l1基因的重組bacmid及重組桿狀病毒的構(gòu)建分別使用包含截短型hpv58l1基因的重組表達(dá)載體pfastbac1-58l1δn2、pfastbac1-58l1δn3、pfastbac1-58l1δn4、pfastbac1-58l1δn7、pfastbac1-58l1δn8、pfastbac1-58l1δn10、pfastbac1-58l1δn11、pfastbac1-58l1δn12、pfastbac1-58l1δn13、pfastbac1-58l1δn2c25、pfastbac1-58l1δn3c25、pfastbac1-58l1δn4c25、pfastbac1-58l1δn7c25、pfastbac1-58l1δn8c25、pfastbac1-58l1δn10c25、pfastbac1-58l1δn11c25、pfastbac1-58l1δn12c25、pfastbac1-58l1δn13c25、pfastbac1-58l1δn2c26、pfastbac1-58l1δn3c26、pfastbac1-58l1δn4c26、pfastbac1-58l1δn7c26、pfastbac1-58l1δn8c26、pfastbac1-58l1δn10c26、pfastbac1-58l1δn11c26、pfastbac1-58l1δn12c26、pfastbac1-58l1δn13c26轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)，篩選獲得重組bacmid，然后用重組bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，在sf9內(nèi)擴(kuò)增重組桿狀病毒。重組bacmid的篩選及重組桿狀病毒的擴(kuò)增方法都是公知的，例如專利cn101148661b。實(shí)施例3：截短型hpv58l1基因在sf9細(xì)胞中的表達(dá)sf9細(xì)胞分別接種上述27種截短型hpv58l1基因的重組桿狀病毒，進(jìn)行截短型hpv58l1蛋白的表達(dá)，27℃培養(yǎng)約88h后收發(fā)酵液，3000rpm離心15min，棄上清，用pbs洗滌細(xì)胞后，用于表達(dá)鑒定及純化。感染表達(dá)的方法是公開的，例如專利cn101148661b。實(shí)施例4：截短型hpv58l1蛋白的表達(dá)鑒定取實(shí)施例3中所述表達(dá)不同截短型hpv58l1的細(xì)胞各1×106個(gè)，重懸于200μlpbs溶液中，加入6×loadingbuffer50μl，75℃變性8min，分別取10μl進(jìn)行sds-page電泳及westernblot鑒定。結(jié)果如圖1所示，27種截短型hpv58l1蛋白均可在昆蟲細(xì)胞中高水平表達(dá)，截短型hpv58l1蛋白大小在50-55kda。sds-page電泳及westernblot鑒定的方法是公開的，例如專利cn101148661b。實(shí)施例5：截短型hpv58l1蛋白與野生型hpv58l1蛋白的表達(dá)量比較取實(shí)施例3中所述表達(dá)截短型hpv58l1蛋白及野生型hpv58l1的細(xì)胞各1×106個(gè)，重懸于200μlpbs溶液中，采用超聲破碎法(寧波新芝超聲破碎儀，2#探頭，100w，超聲5s，間隔7s，總時(shí)間3min)破碎細(xì)胞，12000rpm高速離心10分鐘。收取裂解上清，采用夾心elisa法檢測(cè)上清中的l1含量，該方法是公知的，例如專利cn104513826a。使用本發(fā)明人制備的hpv58l1單克隆抗體包被酶標(biāo)板，80ng/孔，4℃孵育過夜；使用5％bsa-pbst室溫封閉2h，再用pbst洗板3次。用pbs將裂解上清進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋，并且將hpv58l1vlp標(biāo)準(zhǔn)品也進(jìn)行梯度稀釋，濃度從2μg/ml-0.0625μg/ml，分別加入酶標(biāo)板，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀釋的hpv58l1兔多抗，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀釋的hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg(1：3000稀釋，中杉金橋公司)，37℃孵育45分鐘。用pbst洗板5次，每孔加入100μlopd底物(sigma公司)，37℃顯色5分鐘，用50μl2m硫酸終止反應(yīng)，在490nm處測(cè)定吸光值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算裂解上清中截短型hpv58l1蛋白及野生型hpv58l1蛋白的濃度。結(jié)果如表1所示，本發(fā)明的截短型hpv58l1蛋白的表達(dá)量均高于野生型hpv58l1蛋白，且高于專利cn104418942a中的c端截短突變體hpv58l1-491(hpv58l1δc7)及hpv58l1-479(hpv58l1δc19)。表1hpv58l1蛋白表達(dá)量分析實(shí)施例6：截短型hpv58l1蛋白的純化及動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析取截短型hpv58l1的細(xì)胞發(fā)酵液50ml，使用10mlpbs重懸細(xì)胞，加pmsf至終濃度1mg/ml，超聲破碎(寧波新芝超聲破碎儀，6#探頭，100w，超聲5s，間隔7s，總時(shí)間5min)，取破碎上清進(jìn)行純化，純化步驟在室溫進(jìn)行。在裂解液中加入4％β-巰基乙醇(w/w)對(duì)vlp進(jìn)行解聚，然后使用0.22μm濾器過濾樣品，依次使用dmae陰離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)、tmae陰離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)及羥基磷灰石層析(100mmnah2po4，30mmnacl，4％β-me，ph6.0洗脫)純化。純化產(chǎn)物采用planova超濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，并更換緩沖液(20mmnah2po4，500mmnacl，ph6.0)促使vlp組裝。以上純化方法均是公開的，例如專利cn101293918b、cn1976718a等。取純化后的截短型hpv58l1蛋白溶液進(jìn)行dls粒徑分析(zetasizernanozs90動(dòng)態(tài)光散射儀，malvern公司)，結(jié)果如表2所示，其中hpv58l1δn4、hpv58l1δn4c25及hpv58l1δn4c26的dls分析圖如圖2所示。表2截短型hpv58l1蛋白dls分析蛋白名稱水力學(xué)直徑(nm)pdihpv58l1δn295.020.233hpv58l1δn394.980.265hpv58l1δn494.740.251hpv58l1δn794.680.212hpv58l1δn894.880.207hpv58l1δn1095.080.263hpv58l1δn1195.120.276hpv58l1δn1294.760.238hpv58l1δn1394.580.255hpv58l1δn2c2596.060.222hpv58l1δn3c2595.380.252hpv58l1δn4c2595.440.277hpv58l1δn7c2595.880.226hpv58l1δn8c2595.340.270hpv58l1δn10c2595.800.278hpv58l1δn11c2595.220.224hpv58l1δn12c2596.480.216hpv58l1δn13c2597.260.236hpv58l1δn2c2697.440.208hpv58l1δn3c2697.920.202hpv58l1δn4c2698.760.188hpv58l1δn7c2698.330.198hpv58l1δn8c2697.280.225hpv58l1δn10c2696.360.261hpv58l1δn11c2698.020.218hpv58l1δn12c2697.180.258hpv58l1δn13c2696.560.196實(shí)施例7：截短型hpv58l1vlp的透射電鏡觀察按實(shí)施例6所述的層析純化方法，對(duì)截短型hpv58l1vlp分別進(jìn)行純化，使用透析后的vlp制備銅網(wǎng)，并用1％醋酸鈾進(jìn)行染色，充分干燥后使用jem-1400電鏡(奧林巴斯)進(jìn)行觀察。不同截短型hpv58l1vlp的平均直徑如表3所示，其中hpv58l1δn4vlp、hpv58l1δn8vlp、hpv58l1δn10vlp、hpv58l1δn4c25vlp、hpv58l1δn8c25vlp、hpv58l1δn10c25vlp、hpv58l1δn4c26vlp、hpv58l1δn8c26vlp、及hpv58l1δn10c26vlp的電鏡圖如圖3所示，其余截短型hpv58l1vlp電鏡圖也與圖3類似，所有截短型hpv58l1vlp均與野生型無差異，且大小均勻，形狀規(guī)則。銅網(wǎng)制備及電鏡觀察的方法均是公開的，例如專利cn101148661b。實(shí)施例8：hpv58l1δn4vlp、hpv58l1δn4c25vlp及hpv58l1δn4c26vlp的小鼠免疫及中和抗體滴度測(cè)定取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組4只，分別用pbs、截短型hpv58l1vlp及hpv58l1wtvlp免疫小鼠。肌肉注射，l1vlp的免疫劑量為0.1μg，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。使用hpv58假病毒對(duì)免疫血清的hpv58中和抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，hpv58l1δn4vlp(58l1δn4)、hpv58l1δn4c25vlp(58l1δn4c25)、hpv58l1δn4c26vlp(58l1δn4c26)及hpv58l1wtvlp(58l1wt)免疫小鼠后均可有效誘發(fā)中和抗體，且中和抗體滴度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本發(fā)明所述其他截短型hpv58l1vlp誘發(fā)的中和抗體滴度也與hpv58l1wtvlp無差異。假病毒制備及假病毒中和實(shí)驗(yàn)的方法均是公開的，例如專利cn104418942a。實(shí)施例9：hpv58l1δn4c25vlp聯(lián)合佐劑免疫小鼠及中和抗體滴度測(cè)定取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組4只，分別用hpv58l1δn4c25vlp聯(lián)合聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(pika，南國藥業(yè))及氫氧化鋁佐劑或mf59佐劑(4.3％角鯊烯，0.5％tween-80，0.5％span-85)免疫小鼠，具體分組及免疫劑量如表3所示。皮下注射，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。表3佐劑實(shí)驗(yàn)小鼠分組及劑量使用hpv58假病毒對(duì)免疫血清的hpv58中和抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，單獨(dú)使用氫氧化鋁佐劑或聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑(pika佐劑)對(duì)hpv58l1vlp誘發(fā)的中和抗體水平無明顯增強(qiáng)效果，但使用氫氧化鋁或mf59聯(lián)合pika佐劑可顯著提高vlp誘發(fā)的中和抗體水平，且與單獨(dú)使用氫氧化鋁或pika佐劑相比，中和抗體水平亦有明顯提高。表明alum/pika復(fù)合佐劑或mf59/pika復(fù)合佐劑可顯著提高疫苗的免疫活性，具有應(yīng)用前景(使用spss軟件，one-wayanova分析)。當(dāng)前第1頁12