技術領域：

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種凝乳酶ys-1的應用及其制備方法。該凝乳酶ys-1是由枯草芽孢桿菌yb-3菌株(bacillussubtilisyb-3)分泌而成，該菌已于2009年4月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072，電話：(027)68754052，傳真：(027)68754833，e-mail：cctcc@whu.edu.cn，其保藏號為cctccno：m209075。

背景技術：
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功能性消化不良(fd)是一種在世界范圍內(nèi)非常普遍的胃腸疾病。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)fd在西方國家的發(fā)病率約為20-25％，在我國城市人口中消化不良的發(fā)病率也高達20％～54％。功能性消化不良是由胃和十二指腸功能紊亂引起的一組臨床癥狀并經(jīng)檢查排除同樣會出現(xiàn)上述癥狀的器質(zhì)性疾病，其癥狀主要以持續(xù)性或反復發(fā)作的上腹疼痛、餐后飽脹、上腹灼熱感或早飽之一種或多種并可能伴有食欲不振、噯氣、惡心、嘔吐等，在中醫(yī)學上屬于“痞滿”、“胃脘痛”、“積滯”。fd會使患者的生活質(zhì)量明顯下降且產(chǎn)生巨大的醫(yī)藥費用。fd的確切的病理生理機制至今尚不明確，許多研究表明其可能與胃腸道動力障礙、內(nèi)臟高敏感性、精神因素、神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂、幽門螺桿菌感染等多種因素有關。

目前對fd的治療藥物有化藥、中藥及生物酶類藥三類。化藥治療常以促胃腸動力藥物為主，多潘立酮等促胃腸動力藥雖然對fd的治療效果較好，然而其使用時會出現(xiàn)嚴重的副作用如多潘立酮有出現(xiàn)嚴重室性心律失常和增加心源性猝死的風險、西沙比利會導致罕見的嚴重的心率失常。中藥對fd的治療常會根據(jù)患者的病因機制不同，辯證服用不同治療藥物。生物酶類藥的主要成分是消化酶，多在人體內(nèi)就生理存在，一般對患者安全無毒副作用，在臨床上廣泛用于fd的治療。有文獻報道多種消化酶制劑較安慰劑對fd有更好的治療效果。

凝乳酶是一種能夠水解酪蛋白的酶，其與胃蛋白酶合用可以提高胃蛋白水解蛋白的能力。嬰兒體內(nèi)凝乳酶含量較多，它可使進入嬰兒胃內(nèi)的母乳變成半固體，增加在胃內(nèi)的存留時間，使母乳可以得到充分的吸收，此外還可以防止嬰兒吐奶。另外凝乳酶與胃蛋白酶結(jié)合能加快蛋白質(zhì)分解，促進黏蛋白生成，緩解胃炎產(chǎn)生的消化不良癥狀。

復合凝乳酶膠囊，它是一種由羔綿羊胃提取物制成的生物酶類藥物，其藥效成分主要是羔綿羊凝乳酶和胃蛋白酶。許多研究表明其可以治療功能性消化不良，然而其存在原料藥羔羊胃來源有限、蛋白水解譜窄、療效緩慢、成本高等缺點，亟須尋找一種成本低、原料來源廣泛及治療效果更好的蛋白消化酶酶類藥物。

本發(fā)明專利研究發(fā)現(xiàn)了一株高產(chǎn)凝乳酶的bacillussubtilisyb-3菌株，其分泌的凝乳酶ys-1不僅對α-casein具有較強的蛋白水解活性外，對β-casein和κ-casein也有較強的蛋白水解活性，相比之下，動物源的凝乳酶對β-casein幾乎無水解作用。因此該凝乳酶不僅水解譜寬而且生產(chǎn)成本低，很有可能成為復合凝乳酶膠囊中動物源凝乳酶的替代品。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一種凝乳酶ys-1，該凝乳酶ys-1是由枯草芽孢桿菌yb-3菌株(bacillussubtilisyb-3)分泌而成，枯草芽孢桿菌yb-3菌株現(xiàn)已于2009年4月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號是cctcc：m209075，該菌能分泌凝乳酶ys-1。

本方法公開一種凝乳酶ys-1的應用，該酶可用于治療功能性消化不良。

本發(fā)明還提供凝乳酶ys-1的制備方法：

(1)將枯草芽孢桿菌yb-3菌株在搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基；種子接種量為1.67％v/v、搖瓶裝液量為6％v/v；種子培養(yǎng)基主要是由牛肉浸膏6.37g/l，酪蛋白11.07g/l，硫酸鎂1.14g/l，氯化鈉1.0g/l，磷酸氫二鈉1.0g/l，酵母浸膏0.2g/l組成，ph7.0轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為37℃、培養(yǎng)12h；

(2)將培養(yǎng)液離心去除菌體，取上清液，濃縮后得到濃縮液，備用；上清液的濃縮使用0.22μm和10kda的中空纖維柱；

(3)對上述濃縮液進行乙醇分級沉淀，離心收集沉淀，復溶，干燥，研磨后得到凝乳酶ys-1；分級沉淀時選取20-60％乙醇濃度；干燥時采用40℃常壓干燥。

實驗結(jié)果顯示，與市售復合凝乳酶膠囊相比，本發(fā)明公開的凝乳酶ys-1不僅對功能性消化不良具有相同的治療效果，而且具有更低的生產(chǎn)成本，和更簡單的制備流程，可用于制備治療功能性消化不良的藥物。

具體實施方式

實施例1凝乳酶ys-1的制備方法

(1)將枯草芽孢桿菌yb-3菌株在搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基；種子接種量為1.67％v/v、搖瓶裝液量為6％v/v；種子培養(yǎng)基主要是由牛肉浸膏6.37g/l，酪蛋白11.07g/l，硫酸鎂1.14g/l，氯化鈉1.0g/l，磷酸氫二鈉1.0g/l，酵母浸膏0.2g/l組成，ph7.0轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為37℃、培養(yǎng)12h；

(2)將培養(yǎng)液離心去除菌體，取上清液，濃縮后得到濃縮液，備用；上清液的濃縮使用0.22μm和10kda的中空纖維柱；

(3)對上述濃縮液進行乙醇分級沉淀，離心收集沉淀，復溶，干燥，研磨后得到凝乳酶ys-1；分級沉淀時選取20-60％乙醇濃度；干燥時采用40℃常壓干燥。

實施例2：凝乳酶ys-1對功能性消化不良(fd)大鼠的治療效果

取48只wistar大鼠，雌雄各半，按照方式參考文獻“功能性消化不良的動物模型研究”方法(郭海軍，2001)上的方法進行功能性消化不良模型構(gòu)建。造模成功后，將48只fd大鼠隨機分為4組：模型組、凝乳酶ys-1組、復合凝乳酶膠囊組、多潘立酮組，每組12只，雌雄各半。取12只wistar大鼠，雌雄各半，正常喂水喂食，不進行尾部刺激處理。

開始灌胃給藥，持續(xù)12天。給藥劑量及方式如下：

凝乳酶ys-1組：給予凝乳酶ys-1(45.36mg凝乳酶/kg/d)1次/1d；

復合凝乳酶組：給予復合凝乳酶(45.36mg凝乳酶/kg/d)1次/1d，產(chǎn)品商品名為復合凝乳酶膠囊由葵花藥業(yè)集團(唐山)生物制藥有限公司生產(chǎn)；

多潘立酮組：給予多潘立酮(2.7mg/kg/d)1次/1d，產(chǎn)品由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)；

模型組和空白組則給予等體積的生理鹽水，1次/1d。

在造模和給藥期間，每天都觀察每組大鼠的外觀行為，稱量大鼠的體重及飲水進食量，評估凝乳酶ys-1對功能性消化不良(fd)大鼠的治療效果。具體操作步驟和結(jié)果如下：

(1)凝乳酶ys-1對fd大鼠進食量的影響

上午8:00分別稱量一定量的鼠糧，置于每組大鼠的鼠籠中，到次日上午8:00稱量剩余鼠糧，兩者差值比上大鼠數(shù)目即為每組每只大鼠的平均進食量。實驗結(jié)果如表1所示。實驗結(jié)果表明，與空白對照組比較：模型組、凝乳酶ys-1組、復合凝乳酶組、多潘立酮組的體增率低于空白組(p﹤0.05)。與模型組比較：凝乳酶ys-1組、復合凝乳酶組、多潘立酮組的體增率高于模型組(p﹤0.05)，這說明三種藥物能治療fd大鼠食欲不振的癥狀。雌雄大鼠的凝乳酶ys-1組和復合凝乳酶組的體增率無顯著性差異(p﹥0.05)，且均低于多潘立酮組。這說明凝乳酶ys-1與市售復合凝乳酶對大鼠fd模型治療效果相同，且性別對復方凝乳酶對fd的治療效果無影響。

表1藥物對大鼠體增率的影響

注：與空白組比較^●代表p﹤0.05；與模型組比較^＊代表p﹤0.05

(2)凝乳酶ys-1對fd大鼠胃排空率的影響

在末次給藥后，禁食禁水24h后每只大鼠灌入2ml的半固體營養(yǎng)糊劑(取10g羧甲基纖維素鈉,溶于250ml蒸餾水中,然后加入奶粉16g,糖8g,淀粉8g,活性炭3g,攪拌均勻,最后制成300ml的半固體糊狀物,放入冰箱冷藏,用前2h取出,恢復至室溫。)；

灌入糊劑0.5h后，斷頭處死大鼠，取出完整的胃，濾紙擦干后用電子天平稱量胃的重量；沿胃大彎剪開胃體，洗去內(nèi)容物后用濾紙將胃粘膜表層拭干，稱取胃的凈重。

根據(jù)下列公式計算胃排空率

胃排空率＝[灌胃量-(胃重-胃凈重)]/灌胃量*100％

實驗結(jié)果如表2所示，模型組的胃排空率較明顯低于空白組(p﹤0.05)，凝乳酶ys-1組、復合凝乳酶組、多潘立酮組的胃排空率與空白組無顯著性差異，這說明經(jīng)過藥物治療后，凝乳酶ys-1組、復合凝乳酶組、多潘立酮組的胃動力回復到正常水平。雌雄大鼠的凝乳酶ys-1組和復合凝乳酶組的胃排空率差別不大，表明凝乳酶ys-1和市售復合凝乳酶對大鼠fd模型治療效果相同。

表2藥物對胃排空率的影響

注：與空白組比較^●p﹤0.05；與模型組比較^＊p﹤0.05；與多潘立酮組相比^◆p﹤0.05

與市售復合凝乳酶相比，凝乳酶ys-1對于功能性消化不良具有相似的治療作用，且成本更低，制備方法更簡單，可用于制備治療功能性消化不良藥物。