所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肝門(mén)靜脈癌栓奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌栓世界上腫瘤引起病人死亡的主要原因之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第六，死亡率中排名第三。大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)時(shí)機(jī)。晚期肝癌患者容易在門(mén)靜脈主干或主要分支內(nèi)形成癌栓，堵塞門(mén)靜脈，引起門(mén)靜脈高壓以及肝功能障礙等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，因此，這部分病人仍需及時(shí)有效的藥物治療。

藥物治療是晚期肝癌伴門(mén)靜脈癌栓患者的主要手段之一，但治療過(guò)程中患者經(jīng)常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，它是藥物治療失敗的主要原因。因此，研究肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞耐藥機(jī)制及其預(yù)防或逆轉(zhuǎn)肝門(mén)靜脈癌栓耐藥的發(fā)生，對(duì)于提高患者治療效果十分重要；建立肝門(mén)靜脈癌栓耐藥細(xì)胞株對(duì)于研究肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞耐藥性和指導(dǎo)病人用藥方面都具有重要的應(yīng)用價(jià)值.

奧沙利鉑(oxaliplatin，oxa)是第三代鉑類(lèi)抗腫瘤藥物，與其他鉑類(lèi)藥物相比其具有更少的副作用，以?shī)W沙利鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥對(duì)原發(fā)性肝癌患者中展現(xiàn)出具有前景的抗腫瘤活性.其可以在dna內(nèi)形成連間和連內(nèi)的交叉連接，從而阻止dna復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。但是患者群中有相當(dāng)一部分人對(duì)奧沙利鉑不敏感，敏感的病人經(jīng)奧沙利鉑長(zhǎng)期治療后也常有耐藥現(xiàn)象發(fā)生。但是，目前尚缺乏對(duì)奧沙利鉑耐藥的肝癌細(xì)胞株，腫瘤耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建方法也亟需改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種肝門(mén)靜脈癌栓奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株，本發(fā)明的另一目的是提供該耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的主要技術(shù)方案是利用不同濃度的奧沙利鉑處理人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2細(xì)胞，從中找到csqt-2細(xì)胞的最高耐受濃度(細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活并緩慢生長(zhǎng))，并以此濃度作為篩選濃度繼續(xù)長(zhǎng)期刺激細(xì)胞4個(gè)月，最終獲得人肝門(mén)靜脈癌栓奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株csqt-2-oxa。

本發(fā)明提供了一種肝門(mén)靜脈癌栓奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建方法如下：

①、取人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞csqt-2細(xì)胞復(fù)蘇后用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；為找尋最適宜奧沙利鉑刺激濃度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期csqt-2細(xì)胞接種于12孔板中，在各培養(yǎng)孔中分別加入0.5μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、8μmol/l、16μmol/l、24μmol/l、32μmol/l奧沙利鉑，適時(shí)傳代或換液。

②、當(dāng)奧沙利鉑的濃度為24μmol/l時(shí)csqt-2細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活但生長(zhǎng)緩慢；濃度小于24μmol/l時(shí)csqt-2細(xì)胞不但可以大量存活，還能較快生長(zhǎng)；濃度大于24μmol/l時(shí)csqt-2細(xì)胞全部死亡。因此，我們確實(shí)篩選濃度為24μmol/l。然后依次用不同濃度梯度的奧沙利鉑處理細(xì)胞，最后達(dá)到篩選濃度：0.5 μmol/l處理一周，1μmol/l處理一周，2μmol/l處理一周，4μmol/l處理一周，8μmol/l處理一周，16μmol/l處理一周，24μmol/l連續(xù)處理6個(gè)月，最后篩選到能在24μmol/l奧沙利鉑刺激下快速生長(zhǎng)的csqt-2耐藥細(xì)胞，其最大耐藥濃度可達(dá)32μmol/l。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述構(gòu)建方法獲得的肝門(mén)靜脈癌栓奧沙利鉑細(xì)胞株；

本發(fā)明提供了一種肝門(mén)靜脈癌栓奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株，該細(xì)胞株的構(gòu)建方法如下：

復(fù)蘇人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2細(xì)胞后，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中；在培養(yǎng)皿中加入奧沙利鉑至終濃度24μmol/l，適時(shí)傳代或換液；每次傳代或換液之后，均加入奧沙利鉑至終濃度24μmol/l，連續(xù)培養(yǎng)4個(gè)月以上；篩選到仍能快速生長(zhǎng)的人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2細(xì)胞即為耐藥細(xì)胞株。

本發(fā)明所述的耐藥細(xì)胞株是在24μmol/l奧沙利鉑刺激6個(gè)月后，仍能快速生長(zhǎng)的人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2細(xì)胞.

本發(fā)明所述的耐藥細(xì)胞株最大耐藥濃度為32μmol/l.

本發(fā)明所述的耐藥細(xì)胞株命名為csqt-2-oxa.

本發(fā)明通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定、細(xì)胞周期的測(cè)定和凋亡實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)肝門(mén)靜脈癌栓耐藥株csqt-2-oxa的生物學(xué)特性，成功建立csqt-2-oxa耐藥株。

在本發(fā)明中，人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2細(xì)胞、人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2、人肝門(mén)靜脈癌栓門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞株csqt-2、csqt-2細(xì)胞同義。

本發(fā)明還提供了肝門(mén)靜脈癌栓耐藥細(xì)胞株csqt-2-oxa在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了肝門(mén)靜脈癌栓耐藥細(xì)胞株csqt-2-oxa在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明可用于分析肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞奧沙利鉑耐藥后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)表型的變化；研究腫瘤對(duì)奧沙利鉑耐藥的分子機(jī)制和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的方法及篩選其他抗腫瘤藥物；發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥標(biāo)志物以及篩選和評(píng)估新型抗腫瘤藥物等，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值

附圖說(shuō)明

圖1是肝門(mén)靜脈癌栓耐藥株csqt-2-oxa細(xì)胞的誘導(dǎo)建立驗(yàn)證圖；

圖2是光學(xué)顯微鏡下csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)；

其中a是csqt-2，b是csqt-2-oxa；

圖3是csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；

圖4是csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞細(xì)胞周期；

圖5是csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；

圖6是csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞細(xì)胞凋亡；

圖7是csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞中p-gpmrna含量圖，*p＜0.05；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。

實(shí)施例所用的人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞csqt-2細(xì)胞來(lái)自中科院；實(shí)施例所用的奧沙利鉑為市售的sigma公司的5mg規(guī)格的產(chǎn)品。

實(shí)施例1：肝門(mén)靜脈癌栓耐藥株csqt-2-oxa細(xì)胞的誘導(dǎo)建立驗(yàn)證

①、取人肝門(mén)靜脈癌栓細(xì)胞csqt-2細(xì)胞復(fù)蘇后用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；為找尋最適宜奧沙利鉑刺激濃度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期csqt-2細(xì)胞接種于12孔板中，為找尋細(xì)胞能夠耐受奧沙利鉑的最大耐藥濃度(細(xì)胞能夠存活并緩慢生長(zhǎng)的濃度)，在各培養(yǎng)孔中分別加入0.5μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、8μmol/l、16μmol/l、24μmol/l、32μmol/l奧沙利鉑，適時(shí)傳代或換液。

②、上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)奧沙利鉑的濃度為24μmol/l時(shí)csqt-2細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活但生長(zhǎng)緩慢；濃度小于24μmol/l時(shí)csqt-2細(xì)胞不但可以大量存活，還能較快生長(zhǎng)；濃度大于24μmol/l時(shí)csqt-2細(xì)胞全部死亡。因此，我們確實(shí)篩選濃度為24μmol/l.然后依次用不同濃度梯度的奧沙利鉑處理細(xì)胞，最后達(dá)到篩選濃度：0.5μmol/l處理一周，1μmol/l處理一周，2μmol/l處理一周，4μmol/l處理一周，8μmol/l處理一周，16μmol/l處理一周，24μmol/l連續(xù)處理6個(gè)月，最后篩選到能在24μmol/l奧沙利鉑刺激下快速生長(zhǎng)的csqt-2耐藥細(xì)胞。

將上述細(xì)胞與csqt-2對(duì)照細(xì)胞接種12孔板(沒(méi)空1x10⁵個(gè)細(xì)胞)，24小時(shí)后加入不同濃度的奧沙利鉑(24-64μmol/l)，96小時(shí)后拍照。拍照結(jié)果如圖1所示，csqt-2對(duì)照細(xì)胞在24μmol/l及以上濃度刺激時(shí)，培養(yǎng)上清全部為粉紅色；而csqt-2-oxa細(xì)胞在32μmol/l濃度時(shí)仍能生長(zhǎng)代謝，培養(yǎng)基顏色變黃，說(shuō)明csqt-2-oxa細(xì)胞具有較好的耐藥性(各數(shù)字表示所用奧沙利鉑濃度，單位μmol/l)。

實(shí)施例2：肝門(mén)靜脈癌栓耐藥株csqt-2-oxa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

①、倒置相差顯微鏡觀(guān)察活細(xì)胞形態(tài)：分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的csqt-2對(duì)照細(xì)胞和csqt-2-oxa耐藥細(xì)胞，pbs清洗換液后，在倒置顯微鏡(x200)下觀(guān)察活細(xì)胞形態(tài)。通過(guò)光鏡可以觀(guān)察到csqt-2細(xì)胞的大小基本一致，邊緣欠光滑(如圖2a所示)；而csqt-2-oxa細(xì)胞大小形態(tài)各異，并且伸出長(zhǎng)偽足(如圖2b所示).

實(shí)施例3：肝門(mén)靜脈癌栓耐藥株csqt-2-oxa細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期csqt-2、csqt-2-oxa細(xì)胞，用0.5％胰酶消化，2倍體積的含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中止消化，1000rpm離心5分鐘，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，按每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板并設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再各家150μl培養(yǎng)基，放置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)0h，24h，48h，72h，96h；于各時(shí)間點(diǎn)吸棄培養(yǎng)基，每孔各加100μlcck8工作液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，放入酶標(biāo)儀以450nm波長(zhǎng)檢測(cè)，讀出每孔的od值并計(jì)算平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、od值平均 值為縱坐標(biāo)，繪制成生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

連續(xù)檢測(cè)兩細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)后發(fā)現(xiàn)：耐藥細(xì)胞株csqt-2-oxa較正常腫瘤細(xì)胞株csqt-2的增殖速度更快，顯示耐藥細(xì)胞株csqt-2-oxa具有更強(qiáng)的增殖能力(如圖3所示)。

實(shí)施例4：csqt-2-oxa細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析

將csqt-2和csqt-2-oxa分別接種于6孔板中，加2ml10％fbsdmem，24h后收集細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，0.25％胰酶(無(wú)edta)消化，將細(xì)胞消化成單個(gè)，離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞兩次(加3ml，吹懸，離心，棄上清算洗一次)，加入2ml預(yù)冷(-20度)70％乙醇到細(xì)胞沉淀中，于4度固定過(guò)夜。第二天，離心收集細(xì)胞，以3ml的pbs洗細(xì)胞兩次，加入500ulpbs，使用碘化丙啶(pi，50μg/ml)染色，rnasea(20μg/ml)消化，室溫避光孵育30分鐘。上流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞周期軟件flowjo分析結(jié)果.

分析結(jié)果顯示：csqt-2-oxa耐藥細(xì)胞較csqt-2對(duì)照的細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變，其主要改變?yōu)槟退幖?xì)胞株csqt-2-oxag1期細(xì)胞增多，g2期細(xì)胞減少(結(jié)果如圖4所示，數(shù)據(jù)如表1所示)。

實(shí)施例5：csqt-2-oxa細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞消化成單個(gè)，離心收集細(xì)胞，棄上清，用無(wú)血清的dmem重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1x10⁵個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入上室，下室加入400μl含1％fbsdmem。12小時(shí)后，用棉簽擦拭上室，將上室細(xì)胞擦凈，4％多聚甲醛固定小室底部細(xì)胞20分鐘，2mlpbs洗3分鐘，1ml0.1％結(jié)晶紫染色15分鐘，1mlpbs洗2次，通風(fēng)處晾干，于倒置相差顯微鏡下拍照，并計(jì)數(shù)(結(jié)果如圖5所示)。

實(shí)施例6：csqt-2-oxa細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將csqt-2和csqt-2-oxa分別接種于6孔板中，加入24μmol/l奧沙利鉑處理72h，離心收集細(xì)胞，棄上清，用冰冷的pbs洗3次，用1xbindingbuffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，吸取100μl(1x10⁵)于1.5mlep管中，加入5μlfitc和5μlpi，輕輕振蕩，25℃室溫避光孵育15min，加入400μl1xbindingbuffer，1小時(shí)之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。(結(jié)果如圖6所示)

分析結(jié)果顯示：用濃度為50μmol的奧沙利鉑處理csqt-2-oxa耐藥細(xì)胞和csqt-2對(duì)照細(xì)胞顯示，對(duì)照組細(xì)胞(19.55％)凋亡的比例較耐藥細(xì)胞株(10.49％)明顯的增多。

實(shí)施例7：csqt-2-oxa細(xì)胞p-gp基因表達(dá)分析

p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)是一種能量依賴(lài)性藥物排出泵，通過(guò)atp供應(yīng)能量，它可將抗腫瘤藥物由細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，使其細(xì)胞毒作用減弱或消失出現(xiàn)耐藥性，從而導(dǎo)致化療失敗.腫瘤細(xì)胞中p-gp高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一。

細(xì)胞總rna的提?。?/p>

①將csqt-2和csqt-2-oxa細(xì)胞分別種于6孔板中，培養(yǎng)至密度70-80％；

②吸去培養(yǎng)基，加入trizol1ml，室溫孵育30min；

③加入200μl氯仿劇烈振蕩30s，室溫靜置5min；

④4℃，12000rpm，離心15min；

⑤吸取上層含有rna的水相層于新的無(wú)rna酶的ep管中，加入500μl異丙醇沉淀rna，劇烈振蕩30s，室溫靜置10min；

⑥4℃，12000rpm，離心15min；

⑦棄上清，加入500μl75％的乙醇洗滌rna沉淀，4℃，12000rpm，離心5min；

⑧去除乙醇，在超凈臺(tái)中，室溫晾干rna，待出現(xiàn)透明沉淀時(shí)用50μlrnaase-free的水溶解rna，獲得總rna；

⑨測(cè)rna的濃度，-80℃保存；

⑩逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈：

1)反應(yīng)液的配制

在冰上配制如下反應(yīng)

2)將反應(yīng)液輕輕地?cái)嚢杈鶆蚝?，按以下溫度進(jìn)行反應(yīng)。

3)所獲得的cdna放在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量pcr步驟

①反應(yīng)體系如下(25μl)：

引物序列(此引物序列由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成)

p-gp-forward：tgattttggccatcagtcctg

p-gp-forward：cctcttcagctactgctccagc

②反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，40個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10min。用bio-radreal-timepcrsystem軟件分析結(jié)果。

如圖7所示，csqt-2-oxa細(xì)胞p-gp基因的mrna含量較csqt-2對(duì)照細(xì)胞表達(dá)多，即csqt-2-oxa細(xì)胞中p-gp基因表達(dá)上調(diào)，有更強(qiáng)的耐藥性。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。