本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物樣品中病毒基因組核酸提取。
背景技術(shù)：
在臨床病毒核酸定量檢測(cè)中，病毒基因組核酸提取是首先進(jìn)行的第一步。目前，國(guó)內(nèi)pcr試劑生產(chǎn)廠家很多，對(duì)于核酸提取方法各異，在檢測(cè)靈敏度、特異性、定量準(zhǔn)確性及檢測(cè)范圍等方面存在一定的差異。因此，導(dǎo)致不同醫(yī)院之間的檢測(cè)結(jié)果難以進(jìn)行比較，其中核酸提取量多少與純度直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇良好的提取方法和試劑是提高檢測(cè)靈敏度的有效途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種病毒基因組核酸快速提取試劑，該體系試劑能快速?gòu)难?、血漿、淋巴液、無(wú)細(xì)胞體液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液或各種病毒基因組核酸快速釋放提取，獲得的核酸適用于熒光pcr等下游檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、使用安全、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，適合在臨床基因檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種核酸基因組快速提取試劑，包括裂解液和洗滌液，其中裂解液成分含有異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、tritonx-100、edta-2na；洗滌液成分含有氯化鋰和無(wú)水乙醇。
其中裂解液的配制方法為：稱(chēng)取47.2g異硫氰酸胍、0.6gtris、1.5g檸檬酸鈉，0.83g十二烷基肌氨酸鈉、用去離子水溶解后，調(diào)整ph值至6.0-6.5，加入8mltritonx-100、2ml0.5medta-2na混勻后，用去離子水定容至100ml。
洗滌液配制方法為：氯化鋰12.6g、無(wú)水乙醇80ml，混勻后，用去離子水定容至100ml。
本發(fā)明的核酸基因組快速提取試劑可在室溫保存。
本發(fā)明的核酸基因組快速提取試劑使用方法為：取上述配制的病毒裂解液，按照緩沖液和樣品的比例3∶1混合，用移液器反復(fù)吹打5-10次混勻，室溫放置5-10分鐘后，取混合物過(guò)吸附柱離心或者硅基磁珠吸附，通過(guò)洗滌液漂洗后直接洗脫病毒核酸基因組，獲得的核酸可直接作為模板用于熒光pcr下游檢測(cè)。
本發(fā)明的核酸基因組快速提取試劑具有操作簡(jiǎn)便、使用安全的特點(diǎn)，優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法，無(wú)需用到較多有揮發(fā)性的化學(xué)試劑、也無(wú)需蛋白酶k消化。該體系試劑能快速破壞病毒顆粒外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放核酸基因組，獲得的核酸可適用于各種常規(guī)操作，包括rt-pcr、熒光定量pcr等各種下游實(shí)驗(yàn)。整個(gè)過(guò)程安全、便捷，提取的病毒dna/rna得率高、純度高、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，也可適合高通量工作站的自動(dòng)化提取。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，并結(jié)合陽(yáng)性樣品進(jìn)行不同方法的提取，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
(1)hbv陽(yáng)性血清核酸提取
選取5例hbv陽(yáng)性血清樣品，采用本發(fā)明內(nèi)容中的提取試劑分別用兩種方法進(jìn)行提取。
吸附離心柱法提取步驟：
(a)吸取300ul的病毒裂解液和100ul樣品混合，振蕩混勻、室溫放置5分鐘。
(b)吸取混合物至離心柱，12000rpm離心1分鐘，棄廢液。
(c)吸取500ul病毒洗滌液至離心柱，離心3分鐘，棄廢液。
(d)取出ct2號(hào)柱(帶蓋)，放入一個(gè)無(wú)rnase的離心管中，在吸附膜的中間部位加30μl無(wú)dnase和rnase的水，室溫放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
(e)洗脫的dna/rna備用或者儲(chǔ)存-70℃保存。
硅基磁珠法提取步驟：
(a)加入磁珠裂解樣品吸取300ul的病毒裂解液和100ul樣品，分別加入有磁珠的離心管中，蓋緊上蓋，顛倒混勻，裂解5分鐘，期間重復(fù)顛倒離心管幾次，使其完全裂解。
(b)磁分離把ep管放到磁架上，靜置半分鐘，磁珠自動(dòng)被吸附在管壁上，吸棄上清。(磁分離操作要在磁架上完成，以避免吸掉磁珠)
(c)洗滌從磁架上取下ep管，加人病毒洗滌液0.5ml，吸10s使磁珠與洗滌液混合均勻，磁分離，吸棄上清。重復(fù)洗滌一次，開(kāi)蓋放置3min，使磁珠干燥，管內(nèi)及管蓋上殘液要抽凈。注意：乙醇?xì)埩魰?huì)抑制后續(xù)的酶反應(yīng)，所以晾干時(shí)要確保乙醇揮發(fā)干凈。但也不要干燥太長(zhǎng)時(shí)間，以免難以洗脫核酸。
(d)洗脫加人無(wú)dnase和rnase的水30ul，抽吸10s混勻，蓋緊上蓋，室溫放置，取出ep管后立即放到磁架上10s，吸取上清至新的ep管中。
(e)將提取好的核酸溶液適當(dāng)條件保存。
本提取試劑方法同堿裂解法提取熒光pcr檢測(cè)結(jié)果，熒光定量pcr儀(bio-radcxf96)
(2)hiv陽(yáng)性血清核酸提取
本提取試劑方法同酚氯仿抽提方法提取熒光pcr檢測(cè)結(jié)果，熒光定量pcr儀(bio-radcxf96)