本發(fā)明提供一種雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法，特別是一種用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法。

背景技術：

人體的基因體包含各種遺傳變異，其中單一核苷酸多型性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是常被發(fā)現(xiàn)的遺傳變異。單一核苷酸多型性上不同的核苷酸，可能會改變蛋白質(zhì)的形狀，影響基因的調(diào)控反應，進而造成各種遺傳性疾病。

近年來，高通量的微數(shù)組芯片技術已被廣泛的應用于個體差異性檢測、比較基因體相關分析、連鎖不平衡或藥物代謝基因相關等研究中。然而，高通量的微數(shù)組芯片技術在進行芯片雜交的前處理步驟相當耗時，且芯片掃描后要得到上萬個snp數(shù)據(jù)的判讀過程復雜，同時，該技術的儀器及耗材購置成本相當昂貴。而實時聚合酶鏈鎖反應(real-timepolymerasechainreaction)具有較高的專一性、敏感度及準確度，但該技術需要針對個別snp位點訂制的特殊修飾探針的制作成本昂貴，導致整體檢測技術的成本較高，不利用于大規(guī)模的snp位點檢測。因此，目前現(xiàn)有技術缺乏一種有效、快速、較大規(guī)模的檢測單一核苷酸變異的技術。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的一目的在于提供一種用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應的方法，包含：(a)利用一對以上的引物組并藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(multiplexsnppcr)擴增(amplify)待測核酸樣本以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，其中該聚合酶鏈鎖反應中加入核酸螯合染劑，且該核酸螯合染劑為sybrgreen核苷酸染料；以及(b)以表面固定有辨識該等位基因特異性的探針(probe)的基因型鑒定芯片鑒定該擴增產(chǎn)物，其中該引物組包含至少四條等位基因特異性引物，至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的正股(sensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于辨識核苷酸基因多型性的的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應的方法，包含：(a)利用一對以上的引物組并藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(multiplexsnppcr)擴增(amplify)待測核酸樣本以產(chǎn)生第一階段擴增產(chǎn)物，其中該聚合酶鏈鎖反應中加入核酸螯合染劑，且該核酸螯合染劑為sybrgreen核苷酸染料；(b)利用5’端具有修飾標記的通用聚合酶鏈鎖反應引物(universalpcrprimer)擴增該第一階段擴增產(chǎn)物以產(chǎn)生第二階段擴增產(chǎn)物；以及(c)以表面固定有辨識該等位基因特異性的探針(probe)的基因型鑒定芯片鑒定該擴增產(chǎn)物，其中該引物組序列包含兩區(qū)域，5’端區(qū)域為一通用聚合酶鏈鎖反應引物序列區(qū)域，3’端區(qū)域為等位基因特異性引物區(qū)域；其中引物組包含至少四條等位基因特異性引物，至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的正股(sensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種與核酸染料搭配使用的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應的引物對，包含：該引物對包含四條等位基因特異性引物，其中兩條等位基因特異性引物與核酸樣本的正股(sensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補。在本發(fā)明的一實施例中，該引物對是應用于基因型鑒定芯片。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種與核酸螯合染劑搭配的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的引物對，包含：所述引物對包含四條等位基因特異性引物，其中兩條等位基因特異性引物與核酸樣本的正股結(jié)合，且所述等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且所述等位基因特異性引物3’端終點與等位基因特異性位點互補，引物對的5’端區(qū)域為一通用聚合酶鏈鎖反應引物序列區(qū)域。

在本發(fā)明的一實施例中，所述核酸螯合染劑為sybrgreen核酸染料。

在本發(fā)明的一實施例中，其中該引物對具有接近的熔解溫度(meltingtemperature，tm)值。

在本發(fā)明的一實施例中，其中該修飾標記是為熒光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，dig)或寡核酸序列。

在本發(fā)明的一實施例中，其中該基因型鑒定芯片是以芯片熒光掃描儀進行檢測。

在本發(fā)明的一實施例中，其中該核酸樣本是存在于選自于由血液、血清、血漿、體液及組織所組成群組。

在本發(fā)明的一實施例中，其中該引物組的通用聚合酶鏈鎖反應引物序列區(qū)域與等位基因特異性引物區(qū)域之間可進一步加上密碼(barcode)序列，且該探針包含該密碼序列的互補序列。

因此，本發(fā)明提供一種用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應的方法，結(jié)合sybrgreen核酸染料進行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(multiplexsnppcr)，再以基因型鑒定芯片檢測放大產(chǎn)物。本發(fā)明方法所使用的正向(forward)與反向引物(reverse)皆以等位基因特異性位點為引物的3’端終點，不須使用特殊堿基的引物，并能容易的直接依等位基因特異性位點兩旁的序列進行設計，故本發(fā)明的方法是不須使用特殊合成引物且引物設計簡單的應用于基因型鑒定芯片檢測的方法，并具有同時檢測多個等位基因特異性位點的優(yōu)點。

以下將配合圖式進一步說明本發(fā)明的實施方式，下述所列舉的實施例是用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當可做些許更動與潤飾，因此本發(fā)明的保護范圍當視后附的申請專利范圍所界定者為準。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的雙重等位基因特異性引物(doubleallelespecificprimer)設計的示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應的方法，其是使用的正向(forward)與反向引物(reverse)皆以等位基因特異性位點為引物的3’端終點，不須使用特殊堿基的引物，并能容易的直接依等位基因特異性位點兩旁的序列進行設計，并且結(jié)合螯合試劑(interchelatingagent)進行多重(multiplex)聚合酶鏈鎖反應，再以單一核苷酸(singlenucleotidepolymorphism，snp)芯片進行檢測。

定義

本文中所述的核酸為dna或rna分子。

本文中所述的核苷酸為核酸的基本組成單位。

實施例1本發(fā)明的引物設計

本發(fā)明的用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法，分別進行等位基因特異性位點的第一階段擴增反應以及通用引物(universalprimer)的第二階段擴增反應；再以一表面固定有辨識探針(probe)的微數(shù)組芯片區(qū)別該等位基因特異性位點的放大產(chǎn)物。

本發(fā)明的方法主要的技術特征在于雙重等位基因特異性引物的設計，相較于傳統(tǒng)聚合酶鏈鎖反應是利用正向引物與變異性位點一端的一條dna模板鏈互補，反向引物與變異性位點另一端的另一條dna模板鏈互補。本發(fā)明的方法所使用正向與反向引物皆以變異性位點為引物的3’端終點，不須使用特殊堿基的引物，直接依等位基因特異性位點兩側(cè)的序列進行設計。在本實施例中，本發(fā)明以5個snp位點作為舉例，包含rs29232、rs401681、rs667282、rs2072590以及rs2131877，但不限于此。需注意的是，一起進行多重(multiplex)snp聚合酶鏈鎖反應的引物需接近的熔解溫度(meltingtemperature，tm)值，tm公式＝4(g+c)+2(a+t)。

以rs29232為例，如圖1及表一所示，rs29232為a/g基因型變異，直接依該基因型變異的位點兩側(cè)的序列進行設計，正向引物(seqidno:1及seqidno:2)分別以變異性位點a或g為引物的3’端終點設計二條正向引物；反向引物(seqidno:3及seqidno:4)分別以變異性位點c或t為引物的3’端終點設計二條反向引物，分別使用二組引物對進行擴增反應(at引物組及gc引物組)，不須使用特殊堿基的引物。其余snp變異性位點引物對，rs401681以seqidno:5至seqidno:8表示；rs667282以seqidno:9至seqidno:12表示；rs2072590以seqidno:13至seqidno:16表示；rs2131877以seqidno:17至seqidno:20。

關于第二階段擴增反應的通用引物，如表一所示，以5’端分別標記不同熒光(cy3及cy5)的at通用引物(seqidno:21)及gc通用引物(seqidno:22)。

關于芯片上區(qū)別該snp變異性位點的放大產(chǎn)物的辨識探針，本發(fā)明以5’端具有氨基(amine)修飾的辨識rs29232探針(seqidno:23)、rs401681探針(seqidno:24)、rs667282探針(seqidno:25)、rs2072590探針(seqidno:26)以及rs2131877探針(seqidno:27)固定于芯片上進行雜交(hybridization)反應，但不限于此。

表一引物序列

關于用于芯片的擴增反應產(chǎn)物的標記方式，包含特殊修飾堿基、特殊修飾引物以及化學修飾等方法，其中特殊修飾堿基是在擴增反應時，加入各種特殊修飾堿基，例如：biotin-dctp、cy5-dctp、aminoallyl-dctp等，或使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)將特殊堿基加在擴增反應產(chǎn)物的3’端，例如直接使用以熒光修飾的dctp進行第一階段的pcr擴增反應，便不需再進行第二階段的pcr擴增反應。特殊引物修飾是在擴增反應時，加入各種特殊修飾引物進行擴增反應，例如在引物的5’端加上熒光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，dig)或寡核酸序列修飾；化學修飾是在純化擴增反應產(chǎn)物之后，以化學熒光(如kreatech公司的uls^tm技術)將熒光分子直接加在擴增反應產(chǎn)物的堿基上。

實施例2sybrgreen對等位基因特異性的辨識度的影響

本發(fā)明的以雙重等位基因特異性引物(doubleallelespecificprimers)的方法，結(jié)合螯合試劑(interchelatingagent)進行第一階段擴增反應，可提升等位基因特異性的辨識度。

在本實施例中，本發(fā)明以sybrgreeni(sybrgreeni核酸染料，產(chǎn)品編號1988131，羅氏)作為螯合試劑，并且分別將sybrgreeni進行：(1)25倍稀釋、(2)50倍稀釋、(3)100倍稀釋、(4)200倍稀釋、(5)400倍稀釋、(6)800倍稀釋、(7)1600倍稀釋、(8)3200倍稀釋、(9)6400倍稀釋。

在本實施例中，使用購自美國coriell細胞存儲中心的dna樣本，分別為na12891及na18526；以rs29232進行實驗，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫已知na12891樣本的rs29232基因型為cc及na18526樣本的rs29232基因型為tt。rs29232分別包含：含有各5μmseqidno:1及seqidno:4的at引物對混合液，以及含有各5μmseqidno:2及seqidno:3的gc引物對混合液。

此外，本發(fā)明分別使用不同廠牌的sybrgreen擴增反應混合試劑包含：美國應用生命系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，abi)快速sybrgreen擴增反應混合試劑(fastsybrgreenmastermix，產(chǎn)品編號4385612)；以及美商伯瑞股份有限公司(bio-rad)iq^tmgreen擴增反應超級混合試劑(iq^tmgreensupermix，產(chǎn)品編號1708880)。

進行實時(real-time)聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10μl，包含5μlsybrgreen擴增反應混合試劑、2μlsybr稀釋液、1μl引物對混合液、1.8μl水及0.2μl的gdna(50ng/μl)樣本。實時(real-time)聚合酶鏈鎖反應器(cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem，bio-rad)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復此循環(huán)50次結(jié)束反應。

實驗結(jié)果所得的ct值，經(jīng)由公式δct＝(at引物對的ct)-(gc引物對的ct)計算，使用abi快速sybrgreen擴增反應混合試劑的結(jié)果如表二所示。因所使用的兩個樣本基因型為cc(na12891)與tt(na18526)，cc基因型樣本的qpcr結(jié)果的gc引物對的ct會比at引物對的ct小，因此在公式計算結(jié)果會是正值，反之在tt基因型樣本的qpcr計算結(jié)果會是負值。數(shù)值絕對值越大，表示分辨效果越佳，在abisybrgreen的100倍稀釋的兩個數(shù)值的絕對值都很大，表示在兩種基因型的分辨效果都很好，但在50倍稀釋只有cc基因型樣本(na12891)絕對值數(shù)值很大，但tt基因型樣本(na18526)的絕對值很小，表示在此配方中只有cc基因型的分辨效果較佳，但tt基因型的分辨效果不佳，故100倍稀釋濃度的sybrgreen在abi快速sybrgreen擴增反應混合試劑的搭配效果最佳。使用bio-radiq^tmgreen擴增反應超級混合試劑的結(jié)果如表三所示，800-1600倍稀釋濃度的sybrgreen在bio-radiq^tmgreen擴增反應超級混合試劑的搭配效果最佳。其結(jié)果顯示雖不同擴增反應試劑所使用的最佳sybrgreen濃度不同，但使用sybrgreen確實可有效提升等位基因特異性的辨識度。

表二、使用abi快速sybrgreen擴增反應混合試劑的δct值

表三、使用bio-radiq^tmgreen擴增反應超級混合試劑的δct值

實施例3其他螯合試劑對等位基因特異性的辨識度的影響

申請人以其他螯合試劑gelred(gelred^tm核酸染料，產(chǎn)品編號89139-138，biotium)作為螯合試劑，并且分別將gelred進行：(1)100倍稀釋、(2)200倍稀釋、(3)400倍稀釋、(4)800倍稀釋、(5)1600倍稀釋、(6)3200倍稀釋、(7)6400倍稀釋、(8)水。

在本實施例中，使用購自美國coriell細胞存儲中心的dna樣本，分別為na12891及na18526；以rs29232進行實驗，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫已知na12891樣本的rs29232基因型為cc及na18526樣本的rs29232基因型為tt。rs29232分別包含：含有各5μmseqidno:1及seqidno:4的at引物對混合液，以及含有各5μmseqidno:2及seqidno:3的gc引物對混合液。

進行實時(real-time)聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10μl，包含5μlabi快速sybrgreen擴增反應混合試劑、2μlgelred稀釋液、1μl引物對混合液、1.8μl水及0.2μl的gdna(50ng/μl)樣本。實時(real-time)聚合酶鏈鎖反應器(cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem，bio-rad)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復此循環(huán)50次結(jié)束反應。

實驗結(jié)果所得的ct值，經(jīng)由公式δct＝(at引物對的ct)-(gc引物對pair的ct)計算，結(jié)果如表四所示，如同實施例2的判斷方式，且gelred所有的測試結(jié)果都跟水差異不大，故gelred對等位基因特異性的辨識度效果不佳，顯示非所有的螯合試劑都能提高snp的辨識效果。

表四、使用gelred及abi快速sybrgreen擴增反應混合試劑的δct值

實施例4多重(multiplex)snp的辨識度

本發(fā)明確認使用sybrgreen能有效提升等位基因特異性的辨識度后，進行多重(multiplex)snp聚合酶鏈鎖反應以進一步確認本發(fā)明的方法對多重snp的辨識效果。

在本實施例中，使用rs29232、rs401681、rs667582三種snp進行檢測。其中at引物對混合物包含：各2.5μm的seqidno:1及seqidno:4(rs29232)、seqidno:6及seqidno:7(rs401681)、seqidno:10及seqidno:11(rs667582)。gc引物對混合液包含：各2.5μm的seqidno:2及seqidno:3(rs29232)、seqidno:5及8(rs401681)、seqidno:9及seqidno:12(rs667582)。

在本實施例中，使用購自美國coriell細胞存儲中心的dna樣本，分別為na12891、na18526、na18526以及na18558，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫已知各樣本的基因型如表五所示。

表五、各樣本的基因型

進行實時(real-time)聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10μl，包含5μlbio-radiq^tmgreen、0.67μlsybrgreen320倍稀釋液、2μl引物對混合液、2.83μl水及0.5μl的gdna(50ng/μl)樣本。實時(real-time)聚合酶鏈鎖反應器(cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem，bio-rad)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復此循環(huán)50次結(jié)束反應。

各樣本的實驗結(jié)果皆與已知基因型結(jié)果一致，證實本發(fā)明用于基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法應用于多重snp亦具有極高的準確率。此外，實驗結(jié)果所得的ct值，經(jīng)由公式δct＝(at引物對的ct)-(gc引物對的ct)計算，結(jié)果如表六所示，sybrgreen確實可有效提升等位基因特異性的辨識度，且使用多重snp的辨識度效果佳。

表六、各樣本的δct值

實施例5基因型鑒定芯片測試

本發(fā)明的用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法，在本實施例中使用rs29232、rs401681、rs667582、rs2072590、rs2131877五種snp進行進行檢測，分別進行snp變異性位點的第一階段擴增反應(使用seqidno:1至seqidno:20)以及通用引物的第二階段擴增反應(使用seqidno:21及seqidno:22)；再以表面固定有辨識探針(seqidno:23至seqidno:27)的微數(shù)組芯片區(qū)別該snp變異性位點的放大產(chǎn)物。

其中，at引物對混合物包含：各1.5μm的seqidno:1及seqidno:4(rs29232)、seqidno:6及seqidno:7(rs401681)、seqidno:10及seqidno:11(rs667582)、seqidno:14及seqidno:15(rs2072590)、seqidno:18及seqidno:19(rs2131877)。gc引物對混合液包含：各1.5μm的seqidno:2及seqidno:3(rs29232)、seqidno:5及seqidno:8(rs401681)、seqidno:9及seqidno:12(rs667582)、seqidno:13及seqidno:16(rs2072590)、seqidno:17及seqidno:20(rs2131877)。

在本實施例中，使用購自美國coriell細胞存儲中心的dna樣本，分別為na12891、na18526、na18526以及na18559，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫已知各樣本的基因型如表七所示。

表七、各樣本的基因型

首先，進行第一階段擴增反應，反應總體積為10μl，包含5μlabi快速sybrgreen擴增反應混合試劑、1.5μlsybrgreen100倍稀釋液、1.5μl引物對混合液及2μl的gdna(50ng/μl)樣本。聚合酶連鎖反應使用熱循環(huán)反應器(pcrsystem9700，abi)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復此循環(huán)16次，最后降至4℃結(jié)束反應。

接著，進行第二階段擴增反應，反應總體積為30μl，包含10μl第一階段擴增反應產(chǎn)物、10μlabi快速sybrgreen擴增反應混合試劑、1μl通用引物(10μm)、9μl水；其中at通用引物(seqidno:21)及gc通用引物(seqidno:22)分別于兩個反應中進行，代號分別為a及b。聚合酶連鎖反應使用熱循環(huán)反應器(pcrsystem9700，abi)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、70℃，30秒為一循環(huán)，并重復此循環(huán)30次，最后降至4℃結(jié)束反應。將相同樣本的a及b反應產(chǎn)物混合后進行以下芯片雜交步驟。

將第二階段反應物加入100μl雜交緩沖液(4.27m四甲基氯化銨溶液(tetramethylammoniumchloridesolution)、0.9％empigenbb洗滌液、100mmtris緩沖液(ph8.0))及50μl甲酰胺(formamide)混合均勻，以80℃加熱5分鐘，在于4℃冷卻5分種。將冷卻后的產(chǎn)物注入至表面固定有辨識探針(seqidno:23至seqidno:27)的芯片，將該芯片以2rpm轉(zhuǎn)速于45℃烘箱反應至隔夜。之后進行芯片清洗步驟，再以42℃洗滌液i(2xsspe緩沖液，含0.1％sds)于80rpm轉(zhuǎn)速的震蕩器上震蕩清洗3分鐘；以42℃洗滌液ii(0.1xsspe緩沖液，含0.1％sds)于80rpm轉(zhuǎn)速的震蕩器上震蕩清洗3分鐘；以室溫洗滌液iii(0.1xsspe緩沖液)于80rpm轉(zhuǎn)速的震蕩器上震蕩清洗5分鐘；將芯片以離心機旋干。最后以一芯片熒光掃描儀進行芯片掃描步驟，本發(fā)明使用具有兩支固態(tài)激光雷射波長635nm(pmt750v)及532nm(pmt600v)的luxscan^tm10k/a芯片掃描儀(capitalbio)進行掃描。再以genepix4.0(axonlaboratory)進行芯片影像分析。

經(jīng)由at(訊號強度-背景強度)/gc(訊號強度-背景強度)計算出log2比率(ratio)值，如果為g或c同型合子(homozygote)基因型，數(shù)值會是負值；如果為a或t同型合子(homozygote)基因型數(shù)值會是正值；如果是異形合子(heterozygote)數(shù)值會界于兩種同型合子中間。如表八所示，各樣本的實驗結(jié)果皆與已知基因型結(jié)果一致，證實本發(fā)明用于基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法應用于多重snp亦具有極高的準確率。顯示本發(fā)明的用于基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法能有效分辨單管擴增反應中的多種snp產(chǎn)物。

表八、各樣本的計算出log2比率(ratio)值

此外，本發(fā)明亦可在snp變異性位點引物組的5’端加上一修飾標記直接進行第一階段擴增反應，不需再進行第二階段擴增反應，或者在產(chǎn)物無任何修飾的情況下，也可以類似表面電漿共振(surfaceplasmonresonance，spr)方法偵測是否有產(chǎn)物雜交在芯片表面。

更進一步地，當單一snp的基因型超過兩種基因型時，如表九所示，可將等位基因特異性引物的5’端再加上密碼(barcode)序列，以及表面固定包含密碼(barcode)互補序列的辨識探針，擴增反應依實施例五的方法進行，最后芯片的雜交結(jié)果可看見該snp會有兩種訊號結(jié)果(如表九a類及b類)，a類辨識探針可辨識第一密碼序列，b類辨識探針可辨識第二密碼序列。計算a類訊號的紅綠熒光強度log2比率(ratio)，判斷樣本是否含有a或g，或是計算b類訊號的紅綠熒光強度log2比率，判斷檢體是否含有t或c。

表九、基因特異性引物的5’端密碼(barcode)序列辨識方式

綜上所述，本發(fā)明提供一種用于辨識核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性引物(doubleallelespecificprimers)的方法，該方法使用的正向(forward)與反向引物(reverse)皆以等位基因特異性位點為引物的3’端終點，不須使用特殊堿基的引物，并能容易的直接依等位基因特異性位點兩旁的序列進行設計，并且結(jié)合螯合試劑(interchelatingagent)進行多重(multiplex)聚合酶鏈鎖反應。該方法能有效將目前市面上snp芯片將擴增產(chǎn)物注入芯片進行雜交的前處理步驟的時間減少至5小時，并能減少合成特殊堿基引物所需的昂貴成本，且具有同時檢測多個等位基因特異性位點的優(yōu)點，故本發(fā)明的方法是一種有效、快速、低成本、較大規(guī)模的檢測snp變異的技術。