本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及一種從d-乳酸鈉發(fā)酵液分離提取獲得高品質d-乳酸的方法。

背景技術：

乳酸是世界三大有機酸之一，它可以廣泛的用于食品、醫(yī)藥、化工和農業(yè)等領域。特別的d-乳酸可以廣泛的應用于醫(yī)藥、化工和農業(yè)領域。以d-乳酸為單體合成的聚乳酸以其良好的生物可降解性能及其他優(yōu)良的使用特性(如透明性、熱塑性、產物安全性等)已成為21世紀最具發(fā)展前景的綠色環(huán)保材料。此外以高純的d-乳酸制造的生物農藥“驃馬”和“威霸”等除草劑，作為新型的低毒性農藥，能夠有效的除草殺蟲既經濟又可靠。市場上，同等級的d-乳酸價格比l-乳酸貴5～10倍。因此d-乳酸的生產和純化逐漸受到重視。

乳酸的制備方法有發(fā)酵法、化學合成法和酶法。其中，發(fā)酵法和化學合成法得到工業(yè)上的應用，而我國主要采用發(fā)酵法。

中國專利cn201110457464.1公開了一種從發(fā)酵液中提取d-乳酸的方法，該方法將經酸化處理的發(fā)酵液，通過一步大孔吸附樹脂吸附飽和，接著用60℃以上的熱水洗脫樹脂床層，得到純度高的d-乳酸洗脫液。該方法選用的大孔吸附樹脂能夠有效地分離d-乳酸和雜酸，其中，d-乳酸的純度高于98％，硫酸根去除率大于92％，乳酸的熱水洗脫收率大于98％。

傳統(tǒng)的乳酸提取工藝為乳酸鈣結晶-酸解工藝，該工藝成熟易于控制，但是存在工藝路線長，單元操作多，廢液污染嚴重，能耗較高，整個分離過程自動化程度較低等缺點，乳酸回收率也一般在40％～50％之間，且獲得的產品品質較低。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有乳酸分離純化工藝中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從d-乳酸鈉發(fā)酵液中分離純化d-乳酸的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種從d-乳酸鈉發(fā)酵液中分離純化d-乳酸的方法，包括以下步驟：

(1)將d-乳酸鈉發(fā)酵液進行固液分離及部分蛋白和色素的去除，得到澄清的發(fā)酵液；

(2)將發(fā)酵液濃縮、酸化、冷卻結晶得到的固液混合物進行過濾，將過濾后的發(fā)酵液進行離子交換；

(3)離子交換后的發(fā)酵液進行納濾脫色，最后濃縮獲得d-乳酸。

d-乳酸鈉發(fā)酵液的制備包括以下步驟：

(1)將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30～45℃，培養(yǎng)時間20～48h；

(2)將經步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30～45℃，培養(yǎng)時間12～24h；

(3)將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產酸，接種量為1％～15％，發(fā)酵溫度30～45℃，通入氮氣保持其厭氧的環(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在4.5～7.0。

所述平板培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖10～30g/l，酵母膏1～3g/l，無水乙酸鈉1～4g/l，無水硫酸鎂0.1～0.4g/l，磷酸二氫鉀1～3g/l，瓊脂15～25g/l。

所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖10～40g/l，酵母膏1～3g/l，蛋白胨1～3g/l，無水硫酸鎂0.1～0.4g/l，碳酸鈣10～30g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖150～180g/l，酵母膏4～8g/l，玉米漿干粉4～6g/l，硫酸鎂0.4～0.6g/l，麩皮8～12g/l。

所述步驟1中發(fā)酵液的固液分離采用離心或者微濾的方式。

所述步驟1中部分蛋白和色素的去除采用超濾膜去除，所采用超濾膜的截留分子量為2000～5000d。

所述步驟2中酸化采用濃硫酸進行酸化，所述冷卻結晶的溫度控制范圍0～10℃。

所述步驟2中離子交換采用陽離子樹脂和陰離子樹脂相結合的方法進行，發(fā)酵液先過陽離子柱再過陰離子柱，陽離子交換樹脂為732陽離子樹脂，陰離子樹脂為717陰離子樹脂。

所述步驟3中脫色步驟采用納濾膜進行脫色，所采用納濾膜的截留分子量為300～500。

本發(fā)明所使用的發(fā)酵菌種為一株高生長產酸速率的d-乳酸生產菌，已于2012年12月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢，武漢大學)，其分類命名為芽孢乳桿菌(sporolactobacillussp.)bs1-5，保藏登記號為cctccno.m2012516，其更具體分類為菊糖芽孢乳桿菌(sporolactobacillussp.inulinus)。

本發(fā)明通過固液分離，可以能夠實現(xiàn)發(fā)酵液的澄清；通過超濾可以去除大部分大分子的蛋白和一些小分子的蛋白，同時可以起到部分脫色的作用；通過真空濃縮，可在較低溫 度下實現(xiàn)對澄清后發(fā)酵液的濃縮，便于后續(xù)的結晶操作；通過離子交換可以除去未結晶的硫酸鈉和發(fā)酵液中的一些其他雜質離子。

與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明工藝中，分離的是乳酸鈉發(fā)酵液，可以直接在常溫下進行固液分離和膜分離操作，連續(xù)性強，而傳統(tǒng)的處理乳酸鈣發(fā)酵液的固液分離是需要在高溫下采用板框過濾的手段，此操作能耗較高，且自動化程度較低。

(2)本發(fā)明工藝中不需要在高溫下進行時間較長的酸解工藝，在此只需在常溫下進行酸化，且酸化時間短，避免了在高溫下色素的產生給后續(xù)處理帶來麻煩，并且可以大大減少能源的消耗。

(3)本發(fā)明通過微濾、超濾的步驟可以有效降低發(fā)酵液中的蛋白的含量，從而大大降低產品中的氮含量的指標。

(4)本發(fā)明工藝中產生了附加值較高的副產物硫酸鈉，一方面可以降低分離成本，另一面也大大降低了廢水中的鹽離子的濃度，降低了廢水處理的難度和成本。

(5)本發(fā)明工藝中采用納濾操作對發(fā)酵液進行脫色，保證了d-乳酸產品的色度。

(6)本發(fā)明工藝中，整個的工藝流程在能實現(xiàn)高品質的d-乳酸分離基礎上，做到了操作最優(yōu)化，降低了發(fā)酵法生產d-乳酸中分離純化的費用。

具體實施方式

用以下的實施例對本發(fā)明作進一步說明，但有必要指出以下實施例只用于對發(fā)明內容的進一步說明，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。

實施例1

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間48h；

(2)種子培養(yǎng)：將經步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間24h；

(3)發(fā)酵產酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產酸，接種量為15％，發(fā)酵溫度30℃，通入氮氣保持其厭氧的環(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.0。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖10，酵母膏1，無水乙酸鈉1，無水硫酸鎂0.1，磷酸二氫鉀1，瓊脂15。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖10，酵母膏1，蛋白胨1，無水硫酸鎂0.1，碳酸 鈣10。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏4，玉米漿干粉4，硫酸鎂0.4，麩皮8。

發(fā)酵產酸階段采用氫氧化鈉作為ph調節(jié)劑，以芽孢桿菌生產菌株的d-乳酸鈉發(fā)酵液，其中d-乳酸濃度90g/l，無殘?zhí)?。取發(fā)酵結束后的d-乳酸鈉發(fā)酵液經微濾進行固液分離，隨后采用截留分子量為5000的超濾膜進行超濾，分離出大分子蛋白、色素后進行減壓蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)溫度控制在70℃、真空度控制在200mbar，待發(fā)酵液濃縮1倍，將濃縮后的發(fā)酵液送到結晶器中進行酸化，酸化采用濃硫酸、冷卻結晶，冷卻結晶溫度為10℃；將副產物硫酸鈉析出然后進行過濾；將過濾后的發(fā)酵液進行離子交換，離子交換選用732陽離子樹脂與717陰離子交換樹脂；將離子交換后的發(fā)酵液進行納濾脫色，納濾膜的截留分子量為500，最后送入多效蒸發(fā)器進行減壓蒸發(fā)即得到高品質d-乳酸，得到的d-乳酸含量為89％，光學純度為98％。

實施例2

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度45℃，培養(yǎng)時間20h；

(2)種子培養(yǎng)：將經步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度45℃，培養(yǎng)時間12h；

(3)發(fā)酵產酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產酸，接種量為3％，發(fā)酵溫度45℃，通入氮氣保持其厭氧的環(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在7.0。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖30，酵母膏3，無水乙酸鈉4，無水硫酸鎂0.4，磷酸二氫鉀3，瓊脂25。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖40，酵母膏3，蛋白胨3，無水硫酸鎂0.4，碳酸鈣30.

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏8，玉米漿干粉6，硫酸鎂0.6，麩皮12。

發(fā)酵產酸階段采用氫氧化鈉作為ph調節(jié)劑，以芽孢桿菌生產菌株的d-乳酸鈉發(fā)酵液，其中d-乳酸濃度85g/l，無殘?zhí)?。取發(fā)酵結束后的d-乳酸鈉發(fā)酵液經微濾進行固液分離，隨后采用截留分子量為2000的超濾膜進行超濾，分離出大分子蛋白、色素后進行減壓蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)溫度控制在50℃、真空度控制在80mbar，待發(fā)酵液濃縮2倍，將濃縮后的發(fā)酵液送到結晶器中進行酸化，酸化采用濃硫酸、冷卻結晶，冷卻結晶溫度為4℃；將副 產物硫酸鈉析出然后進行過濾；將過濾后的發(fā)酵液進行離子交換，離子交換選用732陽離子樹脂與717陰離子交換樹脂；將離子交換后的發(fā)酵液進行納濾脫色，納濾膜的截留分子量為500，最后送入多效蒸發(fā)器進行減壓蒸發(fā)即得到高品質d-乳酸，得到的d-乳酸產品含量為88％，光學純度為98.5％。

實施例3

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24h；

(2)種子培養(yǎng)：將經步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間20h；

(3)發(fā)酵產酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產酸，接種量為10％，發(fā)酵溫度37℃，通入氮氣保持其厭氧的環(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.5。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，無水乙酸鈉2，無水硫酸鎂0.3，磷酸二氫鉀2，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.3，碳酸鈣20。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏6，玉米漿干粉5，硫酸鎂0.5，麩皮10。

發(fā)酵產酸階段采用氫氧化鈉作為ph調節(jié)劑，以芽孢桿菌生產菌株的d-乳酸鈉發(fā)酵液，其中d-乳酸濃度110g/l，無殘?zhí)恰Ｈ“l(fā)酵結束后的d-乳酸鈉發(fā)酵液經微濾進行固液分離，隨后采用截留分子量為3000的超濾膜進行超濾，分離出大分子蛋白、色素后進行減壓蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)溫度控制在55℃、真空度控制在100mbar，待發(fā)酵液濃縮3倍，將濃縮后的發(fā)酵液送到結晶器中進行酸化，酸化采用濃硫酸、冷卻結晶，冷卻結晶溫度為0℃；將副產物硫酸鈉析出然后進行過濾；將過濾后的發(fā)酵液進行離子交換，離子交換選用732陽離子樹脂與717陰離子交換樹脂；將離子交換后的發(fā)酵液進行納濾脫色，納濾膜的截留分子量為300，最后送入多效蒸發(fā)器進行減壓蒸發(fā)即得到高品質d-乳酸，得到的d-乳酸產品含量為90％，光學純度為99％。

實施例4

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24h；

(2)種子培養(yǎng)：將經步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間20h；

(3)發(fā)酵產酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產酸，接種量為10％，發(fā)酵溫度37℃，通入氮氣保持其厭氧的環(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.5。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，無水乙酸鈉2，無水硫酸鎂0.3，磷酸二氫鉀2，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.3，碳酸鈣20。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏6，玉米漿干粉5，硫酸鎂0.5，麩皮10。

發(fā)酵產酸階段采用氫氧化鈉作為ph調節(jié)劑，以芽孢桿菌生產菌株的d-乳酸鈉發(fā)酵液，其中d-乳酸濃度110g/l，無殘?zhí)恰Ｒ?l發(fā)酵液，濃度為110g/l，約有550g質量的d-乳酸。

取5l，含550gd-乳酸的發(fā)酵液經微濾進行固液分離，微濾d-乳酸收率為99％，微濾后得到d-乳酸的質量為544.5g，

隨后采用截留分子量為3000的超濾膜進行超濾，分離出大分子蛋白、色素，超濾的d-乳酸得率為99％經超濾后d-乳酸的總質量為539.055g。

隨后進行減壓蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)溫度控制在55℃、真空度控制在100mbar，待發(fā)酵液濃縮3倍，將濃縮后的發(fā)酵液送到結晶器中進行酸化，酸化采用濃硫酸、冷卻結晶，冷卻結晶溫度為0℃；將副產物硫酸鈉析出然后進行過濾；共獲得硫酸鈉產品312g，硫酸鈉的得率為72％，獲得的濾液含d-乳酸為506.7g。

將過濾后的發(fā)酵液進行離子交換，離子交換選用732陽離子樹脂與717陰離子交換樹脂；先進行陽離子交換后進行陰離子交換，獲得的離子交換后的發(fā)酵液含d-乳酸質量為405.36g。

將離子交換后的發(fā)酵液進行納濾脫色，納濾膜的截留分子量為300，納濾后的發(fā)酵液含d-乳酸質量為397.26。

最后送入多效蒸發(fā)器進行減壓蒸發(fā)即得到高品質d-乳酸，得到的d-乳酸產品含量為90％，光學純度為99％，共得到d-乳酸產品為441.4g。

最終從含有d-乳酸鈉發(fā)酵液中分離提取d-乳酸產品的總收率為80.2％。