本發(fā)明涉及一種接枝型生物醫(yī)用復(fù)合材料，尤其是一種葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，屬于高分子化學(xué)和生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

葡萄糖酸鈣是一種重要的葡萄糖酸衍生物，具有優(yōu)良的溶解性、易吸收性和生理相容性，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域。葡萄糖酸鈣常用作補(bǔ)鈣制劑和消炎制劑。早有文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄糖酸鈣可用作聚乙烯吡咯烷酮和甲基丙烯酸甲酯共聚物的增強(qiáng)劑。結(jié)果表明，該種復(fù)合材料具有良好的生物相容性，并且能夠使得骨骼得以重建。目前，葡萄糖酸鈣常用作海藻酸鹽的交聯(lián)劑和蛋白的螯合劑。此外，葡萄糖酸鈣在治療心動(dòng)過(guò)速、氫氟酸灼傷、新生兒缺鈣等領(lǐng)域也有著廣泛的研究。

脂肪族聚酯，是廣泛應(yīng)用的生物可降解材料，主要包括聚丙交酯(pla)、聚ε-己內(nèi)酯(pcl)和聚丙交酯乙交酯共聚物(plga)。此外，脂肪族聚酯分子量可控，具有生物相容性和低免疫性，因此廣泛用作組織工程支架材料、藥物緩釋載體材料等生物醫(yī)用材料。然而，脂肪族聚酯缺乏生物活性，其在體內(nèi)降解產(chǎn)物具有一定酸性。為改善這一問(wèn)題，對(duì)脂肪族聚酯一般進(jìn)行生物活性物質(zhì)的復(fù)合。文獻(xiàn)報(bào)道的復(fù)合物主要有羥基磷灰石、膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖等，復(fù)合方法主要有化學(xué)復(fù)合與物理復(fù)合。所述復(fù)合物通過(guò)相應(yīng)組分的功能，雖然改善了脂肪族聚酯與細(xì)胞的相互作用及降解性能，但仍有待改善。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用工業(yè)化的簡(jiǎn)單原料，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)便可控的制備工藝，提供了一種新型的生物可降解復(fù)合材料——葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種可生物降解的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供所述葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物制備的微球及其制備方法和其在制備組織工程用支架和藥物傳遞的載體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的制備方法，所述方法以葡萄糖酸鈣為接枝主鏈，脂肪族聚酯單體為接枝單體，在催化劑作用下，通過(guò)非均相接枝共聚反應(yīng)制得所述的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。

根據(jù)本發(fā)明，所述脂肪族聚酯單體為脂肪族環(huán)酯單體，優(yōu)選地為乙交酯、丙交酯、ε-己內(nèi)酯中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明，所述非均相接枝共聚反應(yīng)具體是：將所述葡萄糖酸鈣分散在有機(jī)溶劑中，然后加入所述脂肪族聚酯單體和催化劑，在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明，所述葡萄糖酸鈣優(yōu)選進(jìn)行如下預(yù)處理：無(wú)水葡萄糖酸鈣經(jīng)球磨機(jī)加工至10nm-100μm，真空干燥,在惰性氣體(如氬氣)保護(hù)下保存?zhèn)溆谩?yōu)選地，真空干燥的溫度為50-100℃(優(yōu)選60-80℃，更優(yōu)選70℃)，時(shí)間為24-96h(優(yōu)選36-60h，更優(yōu)選48h)。

根據(jù)本發(fā)明，所述有機(jī)溶劑是甲苯、四氫呋喃、二甲苯和二氧六環(huán)中的一種。優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑是經(jīng)過(guò)精制的。

根據(jù)本發(fā)明，所述催化劑為適用于脂肪族環(huán)酯單體開(kāi)環(huán)聚合的催化劑。例如所述催化劑為金屬烷氧基化合物，具體為金屬鋁化合物或錫鹽類(lèi)化合物。所述金屬鋁化合物例如是al(oct)3、al(oipr)3、al(acac)3等，所述錫鹽類(lèi)化合物例如是bu2sn(ome)2、bu2snome、辛酸亞錫、乙酸亞錫等。優(yōu)選地，所述催化劑為辛酸亞錫(sn(oct)2)。

根據(jù)本發(fā)明，所述催化劑與所述脂肪族聚酯單體的摩爾比為(0.05～2.5):100。

根據(jù)本發(fā)明，所述有機(jī)溶劑的體積為脂肪族聚酯單體和葡萄糖酸鈣重量之和的1.5～3倍(例如2倍)。

根據(jù)本發(fā)明，所述葡萄糖酸鈣與所述脂肪族聚酯單體的重量比為(0.01-50):100。

根據(jù)本發(fā)明，所述反應(yīng)的溫度為70℃～140℃；所述反應(yīng)的時(shí)間為12-96h。

根據(jù)本發(fā)明，非均相接枝共聚反應(yīng)結(jié)束后，還包括后處理步驟：非均相接枝共聚反應(yīng)的產(chǎn)物用溶劑溶解，然后加入沉降劑中沉降，過(guò)濾、洗滌、干燥，得到純化的產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述后處理步驟可以重復(fù)多次，例如重復(fù)3-5次。

根據(jù)本發(fā)明，后處理步驟中溶解所述產(chǎn)物的溶劑為三氯甲烷、二氯甲烷、四氫呋喃或n，n-二甲基丙基酰胺，例如為二氯甲烷、四氫呋喃等。

根據(jù)本發(fā)明，所述沉降劑為甲醇、乙醚、環(huán)己烷、異丙醇、丙酮中的一種。

根據(jù)本發(fā)明，后處理步驟中的干燥為真空干燥。優(yōu)選地，所述真空干燥的溫度為30-60℃，例如40℃；所述真空干燥的時(shí)間為72-96h。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物，所述復(fù)合物由上述制備方法制得。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種微球，其由上述的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物制得。

根據(jù)本發(fā)明，所述微球由上述的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物通過(guò)溶劑揮發(fā)法制得。具體而言，本發(fā)明所提供的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物，具有葡萄糖酸鈣這一藥物組分，同時(shí)具有分子量可控的高分子聚合物組分(脂肪族聚酯)，可以利用溶劑揮發(fā)法制備微球。

根據(jù)本發(fā)明，所述微球?yàn)榍蛐晤w粒，其粒徑為100-400μm。

根據(jù)本發(fā)明，所述微球具有封閉孔結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種上述微球的制備方法，其包括如下步驟：

(1)制備復(fù)合物溶液：將所述的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物溶解 于5～40倍重量的有機(jī)溶劑中，制得復(fù)合物溶液；

(2)制備內(nèi)水相：將第一表面活性劑與水(如蒸餾水或去離子水)按照(0-1):40(g:ml)的重量體積比混合均勻；

(3)制備外水相：將第二表面活性劑與水(如蒸餾水或去離子水)按照(0-1):40(g:ml)的重量體積比混合均勻；

(4)制備初次乳化溶液：將所述復(fù)合物溶液與所述內(nèi)水相通過(guò)高速剪切方式混合制得初次乳化溶液；

(5)制備二次乳化溶液和微球：將初次乳化溶液加入所述外水相中，得到二次乳化溶液，室溫?cái)嚢?如機(jī)械攪拌)，得到本發(fā)明的微球。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)和步驟(3)中，所述第一表面活性劑和所述第二表面活性劑相同或不同，彼此獨(dú)立地選自?xún)捎H性大分子或者小分子，例如為pva、span60、span80，tween80中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)中，內(nèi)水相中還可以加入致孔劑。所述致孔劑選自nh4hco3等。所述致孔劑在內(nèi)水相中的濃度為0.05～0.2g/ml。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)具體為：將所述內(nèi)水相加入所述復(fù)合物溶液中，超聲乳化，制得初次乳化溶液。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)中，所述復(fù)合物溶液與內(nèi)水相的體積比(ml:ml)為1:1-20:1。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(5)中，所述初次乳化溶液與外水相的體積比(ml:ml)為1:10-1:60。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(5)中，所述室溫?cái)嚢璧臅r(shí)間為2h-8h。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述復(fù)合物或所述微球的應(yīng)用，其可以作為組織工程用支架或藥物傳遞的載體。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明以葡萄糖酸鈣為接枝主鏈，脂肪族聚酯單體為接枝單體，在催化 劑作用下，通過(guò)非均相接枝共聚反應(yīng)成功制備出葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。通過(guò)調(diào)控葡萄糖酸鈣和脂肪族聚酯單體的比例，可以對(duì)復(fù)合物的成分組成及分子量進(jìn)行調(diào)控，是一種富含有機(jī)藥物組分(即所述葡萄糖酸鈣)的新型生物可降解復(fù)合材料。

2、利用溶劑揮發(fā)法中的一次乳化法、二次乳化法，能夠由所述復(fù)合物制備出一種微球，其粒徑為100-400μm，具有優(yōu)良的成球性。所述復(fù)合物或所述微球在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和生物模擬礦化實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞相容性和促進(jìn)磷灰石富集的能力。

3、所獲得的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物，完全由生物相容性和生物可降解的材料組成，適用于生物醫(yī)用領(lǐng)域。所制備的微球可以作為組織工程用支架和藥物傳遞的載體，具有極佳的修復(fù)能力和適宜的降解性能。

4、本發(fā)明的復(fù)合物或微球的制備方法，具有制備工藝簡(jiǎn)單可控，操作性強(qiáng)，可以廣泛的大規(guī)模生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1-3所得葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的紅外光譜圖。

圖2為實(shí)施例1的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的分子量分布圖。

圖3為實(shí)施例2的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的分子量分布圖。

圖4為實(shí)施例3的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的分子量分布圖。

圖5為葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的微球的掃描電鏡圖；其中，a1為低倍數(shù)，a2為高倍數(shù)。

圖6為葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的微球上培養(yǎng)細(xì)胞后的掃描電鏡圖；其中，a1為低倍數(shù)，a2為高倍數(shù)。

圖7為葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的微球進(jìn)行生物礦化后的掃描電鏡圖；其中，a1為低倍數(shù)，a2為高倍數(shù)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明在有機(jī)溶劑(優(yōu)選精制有機(jī)溶劑)中非均相合成葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物，以溶劑揮發(fā)法由所述復(fù)合物制得一種微球，并將該微球應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和生物礦化。具體而言，本發(fā)明以葡萄糖酸鈣為接枝主鏈，脂肪族聚酯單體為接枝單體，在催化劑作用下，通過(guò)非均相接枝共聚反應(yīng)制得所述的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。所述反應(yīng)中，以葡萄糖酸鈣為接枝主鏈，脂肪族聚酯單體為接枝單體，在辛酸亞錫催化作用下，于精制甲苯為代表的有機(jī)溶劑中非均相接枝共聚，脂肪族聚酯單體開(kāi)環(huán)聚合形成脂肪族聚酯，接枝到葡萄糖酸鈣上，制備了葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。通過(guò)控制接枝單體用量、葡萄糖酸鈣用量等實(shí)驗(yàn)條件，可有效控制葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的共聚物(即所述復(fù)合物)的分子量。

所述精制可以采用本領(lǐng)域公知的有機(jī)溶劑的精制方法。不限定地，所述有機(jī)溶劑采用如下所述的方法進(jìn)行精制：首先將金屬鈉從煤油保護(hù)中取出，擦凈表面的煤油，放入盛有有機(jī)溶劑的燒杯內(nèi)，用剪刀或其他刀具切割成小塊，在氬氣保護(hù)下倒入蒸餾裝置，加入顯色指示劑二苯甲酮，打開(kāi)蒸餾裝置的加熱及循環(huán)水回流有機(jī)溶劑，當(dāng)整個(gè)體系由無(wú)色轉(zhuǎn)為綠、墨綠、紫黑色，說(shuō)明有機(jī)溶劑已不含水。每次取用前需重新回流1-2小時(shí)，且體系為紫黑色。取用時(shí)需要?dú)鍤獗Ｗo(hù)。

本發(fā)明中，經(jīng)降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所述復(fù)合物在堿降解和酶降解中具有不同的降解規(guī)律。

本發(fā)明中，以所述葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物為原料，采用溶劑揮發(fā)法可制備出微米級(jí)微球。經(jīng)掃描電子顯微鏡、熱重分析儀、細(xì)胞培養(yǎng)及礦化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所制備微球?yàn)榍蛐晤w粒，粒徑在100-400μm，能夠作為細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)良載體，并且能夠在其表面引起磷灰石的富集。

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但并不用于限制本發(fā)明，凡在本 發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充和等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

無(wú)水葡萄糖酸鈣經(jīng)球磨機(jī)加工至80μm，70℃真空干燥48h,在氬氣保護(hù)下保存?zhèn)溆谩?/p>

在無(wú)水無(wú)氧的反應(yīng)條件下，順序?qū)⑵咸烟撬徕}、丙交酯單體、辛酸亞錫sn(oct)2和甲苯(精制)加入反應(yīng)管，封閉反應(yīng)管，在100℃下反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物使用溶劑如二氯甲烷溶解，異丙醇沉降，之后在45℃真空干燥箱內(nèi)干燥72小時(shí)。得到本發(fā)明的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。其中辛酸亞錫與丙交酯單體的比例為2:100(摩爾比)，葡萄糖酸鈣與丙交酯單體的重量比為0.5:100，所述甲苯的體積為丙交酯單體和葡萄糖酸鈣重量之和的2倍。

實(shí)施例2

無(wú)水葡萄糖酸鈣經(jīng)球磨機(jī)加工至100nm，70℃真空干燥48h,在氬氣保護(hù)下保存?zhèn)溆谩?/p>

在無(wú)水無(wú)氧的反應(yīng)條件下，順序?qū)⑵咸烟撬徕}、丙交酯單體、辛酸亞錫sn(oct)2和甲苯(精制)加入反應(yīng)管，封閉反應(yīng)管，在100℃下反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物使用溶劑如二氯甲烷溶解，異丙醇沉降，之后在45℃真空干燥箱內(nèi)干燥72小時(shí)。得到本發(fā)明的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。其中辛酸亞錫與丙交酯單體的比例為2:100(摩爾比)，葡萄糖酸鈣與丙交酯單體的重量比為2:100，所述甲苯的體積為丙交酯單體和葡萄糖酸鈣重量之和的2倍。

實(shí)施例3

無(wú)水葡萄糖酸鈣經(jīng)球磨機(jī)加工至100μm，70℃真空干燥48h,在氬氣保護(hù)下保存?zhèn)溆谩?/p>

在無(wú)水無(wú)氧的反應(yīng)條件下，順序?qū)⑵咸烟撬徕}、丙交酯單體、辛酸亞錫 sn(oct)2和甲苯(精制)加入反應(yīng)管，封閉反應(yīng)管，在100℃下反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物使用溶劑如二氯甲烷溶解，異丙醇沉降，之后在45℃真空干燥箱內(nèi)干燥72小時(shí)。得到本發(fā)明的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物。其中辛酸亞錫與丙交酯單體的比例為2:100(摩爾比)，葡萄糖酸鈣與丙交酯單體的重量比為10:100，所述甲苯的體積為丙交酯單體和葡萄糖酸鈣重量之和的2倍。

圖1為實(shí)施例1-3所得葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的紅外光譜圖。圖中可見(jiàn)，實(shí)施例1-3的復(fù)合物中除了具有酯基特征峰外，均存在波數(shù)1000cm^-1左右的葡萄糖酸鈣的羥基特征峰。

圖2-圖4為實(shí)施例1-3的葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的分子量分布圖?？梢?jiàn)，在實(shí)施例范圍內(nèi)，隨著葡萄糖酸鈣在復(fù)合物中百分比的增加，復(fù)合物的留出時(shí)間在延長(zhǎng)，即復(fù)合物的分子量在減小。

應(yīng)用實(shí)施例1

將實(shí)施例2得到的復(fù)合物產(chǎn)品溶于二氯甲烷中，得到復(fù)合物溶液；其中，所述復(fù)合物用量0.3g，二氯甲烷用量5ml。之后將1.25ml添加有nh4hco3(濃度為0.1g/ml)的pva水溶液(pva的濃度為0.2g/ml)(即內(nèi)水相)加入到上述制備的復(fù)合物溶液中，超聲乳化，得到初次乳化溶液。迅速將所得初次乳化溶液倒入200ml濃度為0.001g/ml的表面活性劑pva水溶液(即外水相)中，室溫下機(jī)械攪拌5小時(shí)，最終得到葡萄糖酸鈣接枝脂肪族聚酯的復(fù)合物的微球。該微球具有封閉孔結(jié)構(gòu)，如圖5的a1和a2所示?？梢钥闯?，其具有封閉孔洞，孔表面或空間由薄膜覆蓋。所述微球的粒徑介于100-400μm之間。

應(yīng)用實(shí)施例2

將應(yīng)用實(shí)施例1中的微球，采用30kgy劑量的⁶⁰co滅菌。之后將密度為4×10⁴/ml的人成骨肉瘤細(xì)胞mg-63接種到微球上，每12小時(shí)更換培養(yǎng)基，培 養(yǎng)48h后。使用磷酸鹽緩沖液輕輕充分的洗滌微球，之后通過(guò)2.5％含量的戊二醛固定30min。使用10％、20％、40％、60％、80％和100％的乙醇磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)行細(xì)胞脫水，最后采用叔丁醇置換。將叔丁醇置換的細(xì)胞培養(yǎng)微球于-20℃冷凍過(guò)夜、凍干之后于掃描電子顯微鏡上觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明(如圖6的a1和a2所示)，細(xì)胞能夠在微球上很好的鋪展、生長(zhǎng)。

應(yīng)用實(shí)施例3

將應(yīng)用實(shí)施例1中的微球，置于預(yù)先配置好的模擬體液1.5sbf中，于搖床中孵育7天。搖床參數(shù)設(shè)定為100rpm和37℃。1.5sbf配置為1l，其配方的加料順序?yàn)椋撼兯?50ml，nacl11.994g，nahco30.525g，kcl0.336g，k2hpo4·3h2o0.342g，mgcl2·6h2o0.458g，1kmol/m³hcl60cm³，cacl20.417g，na2so40.107g，(ch2oh)3cnh29.086g，最后使用1kmol/m³hcl調(diào)節(jié)其至容量為1l、ph為7.4。孵育結(jié)束后，使用大量清水將微球表面的模擬體液1.5sbf清潔干凈。然后凍干，使用掃描電子顯微鏡觀察微球的形貌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(如圖7的a1和a2所示)，微球表面覆蓋了片狀磷灰石，在高倍數(shù)下顯示磷灰石為簇狀結(jié)構(gòu)。