本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及靶向人pd-1蛋白的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

免疫系統(tǒng)中存在著眾多的共刺激信號(hào)和共抑制信號(hào)精確調(diào)控t細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度和質(zhì)量，這些抑制信號(hào)被稱為免疫檢查點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞通常會(huì)過表達(dá)這些免疫檢查點(diǎn)蛋白，從而抑制t細(xì)胞的激活，逃避免疫系統(tǒng)的殺傷。通過不同的策略增強(qiáng)t細(xì)胞的活性對(duì)腫瘤免疫治療具有重要意義，其中對(duì)免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行阻斷是增強(qiáng)t細(xì)胞活性的有效策略之一。t細(xì)胞表面存在著一系列的免疫抑制性分子，如pd-1、ctla-4、tim-3、slam等，這些免疫抑制性分子可以與其相應(yīng)的配體結(jié)合從而激活免疫抑制調(diào)節(jié)通路，進(jìn)而導(dǎo)致t細(xì)胞功能的衰竭，其中，pd-1/pd-l1通路是目前的研究熱點(diǎn)。

pd-1是t細(xì)胞表面一個(gè)重要的抑制性受體，因最初在凋亡的t細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，并能促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡而得名。pd-1蛋白可誘導(dǎo)性地表達(dá)于活化的t細(xì)胞、b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及單核細(xì)胞等。其配體有兩個(gè)，分別為pd-l1(cd274，b7-h1)和pd-l2(cd273，b7-dc)。pd-l1比pd-l2的分布更加廣泛，pd-l1可以在b細(xì)胞、dc、巨噬細(xì)胞、骨髓源肥大細(xì)胞、t細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，而pd-l2僅在dc、巨噬細(xì)胞、記憶性b細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，因此，阻斷pd-1/pd-l1通路比阻斷pd-1/pd-l2通路更為有效。pd-1/pd-l1抑制免疫通路的機(jī)理如下：腫瘤細(xì)胞存在著大量的基因突變以及蛋白的異常表達(dá)，可以作為腫瘤抗原活化t細(xì)胞。腫瘤特異性細(xì)胞毒t細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位后，通過t細(xì)胞抗原受體(tcr)識(shí)別腫瘤細(xì)胞，釋放干擾素γ(ifn-γ)以及t細(xì)胞顆粒，殺傷腫瘤細(xì)胞。但ifn-γ除具有抗腫瘤作用外，還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)pd-l1。這些pd-l1與活化的t細(xì)胞中的pd-1結(jié)合后，抑制t細(xì)胞的抗腫瘤作用。

雖然目前已經(jīng)有很多阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)或者個(gè)別藥物已經(jīng)獲得美國(guó)fda的審批，例如：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab和pidilizumab，以及靶向與pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等，但是這些藥物大部分都是抗體類藥物，具有生產(chǎn)成本高、組織滲透性差、易產(chǎn)生免疫原性等缺點(diǎn)。

與抗體類藥物相比，多肽分子因具有較高的特異性和組織親和性、生產(chǎn)成本低、不易產(chǎn)生免疫原性及較好的組織滲透性等優(yōu)點(diǎn)，而成為最有吸引力的抗體替代物。因而，研究并開發(fā)出一些低分子量的有機(jī)小分子或者多肽類藥物成為阻斷pd-1/pd-l1通路的重要研究方向。

綜上所述，本領(lǐng)域急需低分子量的有機(jī)小分子或者多肽作為阻斷pd-1/pd-l1通路的候選藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供能夠阻斷pd-1/pd-l1通路的低分子量的有機(jī)小分子或者多肽類。

在第一方面，本發(fā)明提供一種式i表示的多肽：

[xaa0]-[xaa1]-asp-tyr-[xaa2]-arg-[xaa3]-tyr-[xaa4](i)

其中，

[xaa0]為glyasn、thrglu、或pheasn構(gòu)成的肽段、或無；

[xaa1]為trp、lys或met；

[xaa2]為asnsergln、arghisglyasnile、serleuglugluleu、sertrplysserglu、glnasn、cysprocys、cyshisglyprocys、cysalagluproleu、sertrpcysprocys構(gòu)成的肽段；

[xaa3]為alaglnleu、metlysleuala、glulysalalys、leulysgluala、或glulyscyslys構(gòu)成的肽段；

[xaa4]為asngln、aspleu、lys、aspleu、或arg；

并且所述多肽具有pd-1結(jié)合活性，所述多肽的長(zhǎng)度為15-18個(gè)氨基酸。

在具體的實(shí)施方式中，所述多肽選自下組：

(a)氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；

(b)將(a)所述的多肽經(jīng)過1-6個(gè)(較佳地1-4個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有pd-1結(jié)合活性的由(a)衍生的多肽。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽與pd-1的結(jié)合kd值為1-5μm，優(yōu)選1-4μm、更優(yōu)選1-3μm，最優(yōu)選與天然pd-l1與pd-1的結(jié)合kd值近似。

在具體的實(shí)施方式中，所述多肽選自氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽。

在具體的實(shí)施方式中，所述多肽是氨基酸序列如seqidno:1或6所示的多肽。

在第二方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明第一方面所述的多肽。

在第三方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸分子。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞包括但不限于：細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)菌包括但不限于：大腸桿菌、枯草桿菌；所述酵母包括但不限于：畢赤酵母、釀酒酵母。

在第四方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的藥物組合物還包含：(c)藥學(xué)上可接受的其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物包括但不限于：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab，以及靶向pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的藥物組合物還可包含其它抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括但不限于：ipilimumab、ramucirumab、trametinib、ceritini、dabrafenib等。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物組合物的劑型適用于以下給藥方式，包括但不限于：注射給藥、輸注給藥、腹膜內(nèi)給藥、瘤內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥。

在第五方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的多肽的用途，用于制備抑制pd-1與pd-l1結(jié)合或抑制腫瘤、或治療細(xì)菌、病毒或真菌引起的感染或治療炎性疾病的藥物。

在具體的實(shí)施方式中，所述腫瘤包括但不限于：黑色素瘤、肺癌(優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌)、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、小兒實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、t細(xì)胞淋巴瘤等；

所述病毒包括但不限于：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、孢疹病毒、流感病毒、腺病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、登革熱病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒等；

所述細(xì)菌包括但不限于：衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、肺炎球菌、霍亂、破傷風(fēng)等；

所述真菌包括但不限于：假絲酵母、曲霉、皮炎芽酵母等；或者

所述炎性疾病包括但不限于：強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性溶血性貧血、關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性貧血、多肌炎等。

在第六方面，本發(fā)明提供一種抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的方法，包括步驟：利用本發(fā)明第一方面所述的多肽或本發(fā)明第四方面所述的藥物組合物抑制pd-1與pd-l1結(jié)合。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的方法是體外非治療性的。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示實(shí)施例3構(gòu)建的人pd-1重組質(zhì)粒的pcr鑒定結(jié)果，其中marker代表dna分子量marker；泳道中出現(xiàn)的條帶為目的條帶(357bp)。

圖2顯示實(shí)施例4的經(jīng)純化人pd-1蛋白的sds-page電泳結(jié)果，其中m代表蛋白分子量marker；泳道1代表人的pd-1蛋白，該目的條帶大小為13kda，與理論值大小一致。

圖3a顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:1的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為1.38μm。

圖3b顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:2的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.13μm。

圖3c顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:3的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.14μm。

圖3d顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:4的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.39μm。

圖3e顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:5的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.32μm。

圖3f顯示人的pd-1蛋白與人pd-l1蛋白結(jié)合的spr圖，測(cè)得人pd-l1蛋白與pd-1蛋白的kd值為1.15μm。

圖4顯示人pd-l1蛋白與氨基酸序列為seqidno:1的多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人pd-1蛋白的spr圖。

圖5a顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:6的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為2.08μm。

圖5b顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:7的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.96μm。

圖5c顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:8的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.11μm。

圖5d顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:9的多肽結(jié)合的spr圖，測(cè)得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為4.81μm。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一組靶向人pd-1蛋白的多肽，該組多肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與人pd-1蛋白結(jié)合，從而成為研究pd-1/pd-l1免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的多肽類先導(dǎo)藥物，進(jìn)而為抗腫瘤藥物的發(fā)展提供基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與所公開的發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。為便于理解本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明涉及的相關(guān)術(shù)語(yǔ)作如下定義，但本發(fā)明的范圍并不限于這些具體的定義。

pd-1蛋白

本文所用的術(shù)語(yǔ)“pd-1蛋白”是指人體內(nèi)t細(xì)胞表面的一個(gè)重要的抑制性受體。其有兩個(gè)配體，分別為pd-l1和pd-l2。pd-l1與活化的t細(xì)胞中的pd-1結(jié)合后，起到抑制t細(xì)胞的抗腫瘤作用。因此，阻斷pd-1/pd-l1通路對(duì)于抑制或殺傷腫瘤有著積極作用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，人體內(nèi)的蛋白有可能產(chǎn)生一定突變，而仍保留其活性。因此，本發(fā)明所述的pd-1蛋白包括包含一定突變的pd-1蛋白，只要該突變的pd-1蛋白在人體內(nèi)行使與野生型pd-1相同的功能。例如，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的pd-1蛋白具有seqidno:14所示氨基酸序列(pptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterrae)，其相應(yīng)的編碼核苷酸序列如seqidno:13所示。

pd-1蛋白具有與其特異性結(jié)合的配體(pd-l1)。例如，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的pd-l1具有seqidno:12所示氨基酸序列。

本發(fā)明的多肽

本發(fā)明提供能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合人pd-1蛋白的多肽，這些多肽具有結(jié)構(gòu)上的相似性，即，在特定的位置具有特定的氨基酸殘基。

在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供式i表示的多肽：

[xaa0]-[xaa1]-asp-tyr-[xaa2]-arg-[xaa3]-tyr-[xaa4](i)

其中，[xaa0]為glyasn、thrglu、或pheasn構(gòu)成的肽段、或無；[xaa1]為trp、lys或met；[xaa2]為asnsergln、arghisglyasnile、serleuglugluleu、sertrplysserglu、glnasn、cysprocys、cyshisglyprocys、cysalagluproleu、sertrpcysprocys構(gòu)成的肽段；[xaa3]為alaglnleu、metlysleuala、glulysalalys、leulysgluala、或glulyscyslys構(gòu)成的肽段；[xaa4]為asngln、aspleu、lys、aspleu、或arg；這些多肽的長(zhǎng)度為15-18個(gè)氨基酸。

這些多肽與人pd-1蛋白具有良好的結(jié)合親和力，其中結(jié)合親和力最高的多肽與人pd-1蛋白的天然配體pd-l1相當(dāng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽為氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；或者將氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽經(jīng)過1-6個(gè)，(較佳地1-4個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有pd-1結(jié)合活性的衍生多肽。

在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽與pd-1的結(jié)合kd值為1-5μm，優(yōu)選1-4μm、更優(yōu)選1-3μm，最優(yōu)選與天然pd-l1與pd-1的結(jié)合kd值近似。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽選自氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；更優(yōu)選氨基酸序列如seqidno:1或6所示的多肽。

在本發(fā)明的多肽的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子以及宿主細(xì)胞，所述核酸分子編碼本發(fā)明的多肽，所述宿主細(xì)胞包含所述的分離的核酸分子。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何選取宿主細(xì)胞并在其中進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如，所述宿主細(xì)胞包括但不限于：細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)菌包括但不限于：大腸桿菌、枯草桿菌；所述酵母包括但不限于：畢赤酵母、釀酒酵母。

由于本發(fā)明的多肽與人pd-1蛋白具有良好的結(jié)合親和力，這些多肽能作為pd-1/pd-l1結(jié)合的抑制劑或調(diào)節(jié)pd-1/pd-l1結(jié)合程度的調(diào)節(jié)劑。因此，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的多肽以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。

本發(fā)明的多肽顯然還可以與其它機(jī)理的阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物以及其它抗腫瘤藥物聯(lián)用以增強(qiáng)彼此的作用。因此，上述藥物組合物中還可包含藥學(xué)上可接受的其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物。例如，所述其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物包括但不限于：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab，以及靶向pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的藥物組合物還可包含其它抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括但不限于：ipilimumab、ramucirumab、trametinib、ceritini、dabrafenib等。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知熟知，本發(fā)明的藥物組合物的具體劑型取決于要采用的給藥方式。例如，本發(fā)明的藥物組合物可采用的給藥方式包括但不限于：注射給藥、輸注給藥、腹膜內(nèi)給藥、瘤內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥，等等。而藥物組合物中活性成分的含量可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)，例如患者的性別、年齡、總體健康狀況等實(shí)際情況自主決定。

基于本發(fā)明的多肽的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難想到可將其制備成抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的藥物或抑制腫瘤的藥物。在具體的實(shí)施方式中，所述腫瘤包括但不限于：黑色素瘤、肺癌(優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌)、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、小兒實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)腫瘤、原發(fā)性cns淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、t細(xì)胞淋巴瘤。

在其它實(shí)施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的藥物還可用于治療細(xì)菌、病毒或真菌感染。例如，以下病毒引起的感染：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、孢疹病毒、流感病毒、腺病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、登革熱病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒等；以下細(xì)菌引起的感染：衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、肺炎球菌、霍亂、破傷風(fēng)等；或以下真菌引起的致病感染：假絲酵母、曲霉、皮炎芽酵母等。

在其它實(shí)施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的藥物還可用于治療炎性疾病，包括但不限于：強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性溶血性貧血、關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性貧血、多肌炎等。

在本發(fā)明的多肽或藥物組合物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的方法，包括利用本發(fā)明的多肽或藥物組合物抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的步驟。在具體的實(shí)施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結(jié)合的方法是體外非治療性的。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明提供了能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合人pd-1蛋白的多肽；

2.本發(fā)明的多肽能與人pd-1蛋白良好結(jié)合，其中，結(jié)合親和力最高的多肽與人pd-1蛋白的結(jié)合情況與天然pd-l1蛋白無異；

3.本發(fā)明的多肽具有較高的特異性、組織親和性、不易產(chǎn)生免疫原性以及較好的組織滲透性；和

4.本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)成本低。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(coldspringharborlaboratorypress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例

實(shí)施例1.本發(fā)明多肽的合成

(1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料

二甲基甲酰胺(dmf)、哌啶、樹脂、二氯甲烷(dcm)、茚三酮反應(yīng)試劑、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)、三異丙基硅烷(tis)、乙二硫醇(edt)、無水乙醚、三氟乙酸(tfa)、n-甲基嗎啉(nmm)、甲醇、乙醇、20種氨基酸、多肽固相合成管、質(zhì)譜儀器microtof-q11(brukerdaltonics)。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟

稱量樹脂并投入到多肽固相合成管中，加入適量的dmf溶脹半小時(shí)以上。抽掉dmf，用脫保護(hù)液(哌啶:dmf＝1:4)進(jìn)行fmoc去保護(hù)反應(yīng)，置于搖床上10分鐘。抽掉脫保護(hù)液，用dmf、dcm洗滌三次，從固相合成管中取出少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，茚三酮法檢測(cè)并記錄顏色，準(zhǔn)備投料，進(jìn)行氨基酸縮合反應(yīng)。分別按照seqidno:1-9所示的氨基酸序列取相應(yīng)氨基酸、hbtu，并用少量的dmf溶解，投入到固相合成管中，加入10倍的nmm，攪拌反應(yīng)。1-2小時(shí)后，從固相合成管中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，茚三酮法檢測(cè)。抽掉固相合成管中的液體，用dmf、甲醇、dcm各洗滌2次，得到第一個(gè)氨基酸縮合后的肽樹脂。對(duì)所得肽樹脂重復(fù)進(jìn)行以上“fmoc去保護(hù)、氨基酸縮合”反應(yīng)步驟，至最后一個(gè)氨基酸反應(yīng)完畢，得到氨基酸序列如seqidno:1-9所示的肽。反應(yīng)完畢后，dmf、甲醇、dcm各洗滌2次，繼續(xù)抽干10-15分鐘。固相合成管中取出合成完的部分肽樹脂，于室溫下在裂解液(tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％)中裂解兩小時(shí)。將樹脂過濾后，于旋蒸儀中蒸干，用無水乙醚洗滌6次，然后常溫?fù)]干。粗肽使用分析級(jí)hplc純化，使用hplc檢測(cè)純度>90％。所得的純肽使用質(zhì)譜鑒定。最后將純化后的溶液凍干，即可得到純品。表1列出了本發(fā)明多肽的分子量的理論值和質(zhì)譜測(cè)定的實(shí)際值。

實(shí)施例3.人的pd-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

目的基因?yàn)閜d-1蛋白上34-150位氨基酸的編碼核酸。利用ncoi和ndei兩個(gè)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物將目的片段克隆到pet-28a載體(novagen公司)上。正向引物為：5’-ttttccatgggtccccccaccttctccccag-3’(seqidno:10)；反向引物為：5’-gccgccgcatatgttattctgcccttctctctg-3’(seqidno:11)。以人的pd-1基因?yàn)槟０?，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr體系為：2μlpd-1質(zhì)粒，2μl正向引物，2μl反向引物，5μl10×緩沖溶液，4μldntp，1μlpfu聚合酶，34μlddh2o。pcr擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸48s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。pcr擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行核酸電泳，切下目的條帶，用pcr產(chǎn)物回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物。將所得的pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒pet-28a載體分別用ncoi和ndei兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后在t4連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr鑒定(結(jié)果見圖1)，然后取陽(yáng)性重組子測(cè)序，保留菌株和甘油菌。通過重組質(zhì)粒構(gòu)建的人的pd-1具有如seqidno:13所示的核苷酸序列。

實(shí)施例4.人的pd-1蛋白的表達(dá)與純化

本發(fā)明所用到的人的pd-1蛋白是經(jīng)原核生物表達(dá)、純化后獲得的。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.colibl21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。挑取單個(gè)菌落接種于含有卡那霉素的tb培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日將小培產(chǎn)物擴(kuò)培到1l的tb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600為0.5-0.6，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為0.5mm，37℃誘導(dǎo)5-7h。在4,000rpm下收菌，先用裂解緩沖溶液(50mmtris-hcl，ph8.0，50mmnacl,，1mmdtt，0.5mmedta，5％甘油)裂解細(xì)菌，然后再高壓破碎，在12,000rpm下離心取沉淀。用洗雜緩沖液(20mmtris-hcl，ph8.0，2m尿素，2.5％tritonx-100)洗雜兩次，取沉淀。然后再用溶解緩沖溶液(20mmtris-hcl，ph8.0，8m尿素)溶解蛋白，離心取上清。取3kda的蛋白超濾濃縮管濃縮蛋白至5ml左右，將其加入到1l的復(fù)性緩沖液(50mmtris-hcl，ph8.0，50mml-arg，24mmnacl，1mmkcl，1mmedta)中，用稀釋法在4℃下復(fù)性24h。用3kda的濃縮管濃縮蛋白，至20ml左右，將蛋白裝入透析袋中，在透析緩沖液(50mmtris-hcl，ph8.0，150mmnacl，1mmdtt)中透析過夜，濃縮。對(duì)獲得的蛋白過陽(yáng)離子交換柱和分子篩進(jìn)行純化。將過完分子篩后的蛋白進(jìn)行14％sds-page凝膠電泳，鑒定純化后的蛋白純度。所得電泳圖如圖2所示，蛋白大小約為13kda，與人pd-1蛋白的理論值吻合，說明成功獲得了人pd-1蛋白。

實(shí)施例5.人pd-1蛋白與本發(fā)明多肽的spr結(jié)合實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明的多肽與人pd-1蛋白的結(jié)合通過biacoret200進(jìn)行表面等離子體共振(surfaceplasmonresonances,spr)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：用10mm醋酸鈉溶液將純化好的pd-1蛋白稀釋到50μg/ml，使用氨基偶聯(lián)試劑盒將pd-1蛋白偶聯(lián)到cm5芯片上，流速為10μl/min，結(jié)合時(shí)間為420s，最后的偶聯(lián)量約為5000ru。結(jié)合實(shí)驗(yàn)是在含有0.05％的表面活性劑p20的pbs溶液(137mmnacl，2.7mmkcl，8mmna2hpo4，2mmkh2po4，ph7.4)中進(jìn)行的。實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定為25℃，流速為30μl/min，結(jié)合時(shí)間90s，解離時(shí)間120s。將多肽用運(yùn)行溶液溶解后，成倍稀釋成不同濃度，隨著運(yùn)行溶液結(jié)合到pd-1上。得到的結(jié)合數(shù)據(jù)用biaevaluation2.0軟件分析，利用穩(wěn)態(tài)擬合得到親和力kd值。本發(fā)明的多肽與人pd-1蛋白的spr結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3a-3e以及圖5a-5d所示。表1列出了本發(fā)明的多肽的序列及spr實(shí)驗(yàn)測(cè)得的kd值。

本發(fā)明人同時(shí)檢測(cè)了人pd-1蛋白與人pd-l1蛋白的結(jié)合親和力kd值，其為1.15μm(如圖3f所示)。

表1.本發(fā)明的多肽序列、分子量及它們與人pd-1蛋白結(jié)合的kd值

實(shí)施例6.人pd-l1蛋白與seqidno:1所示多肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合人pd-1蛋白的spr實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)施例5中的spr實(shí)驗(yàn)結(jié)果，seqidno:1所示多肽與人pd-1蛋白的結(jié)合親和力最高。因而，本發(fā)明人以seqidno:1所示多肽為例，探究了該肽阻斷人pd-1蛋白與人pd-l1蛋白結(jié)合的能力。人pd-l1蛋白購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先將50μg/ml人pd-l1蛋白通過氨基偶聯(lián)的方法偶聯(lián)到cm5芯片表面；然后將不同濃度的seqidno:1所示多肽(125nm，62.5nm，31.25nm，15.60nm，0nm)分別與100nm的人pd-1蛋白在冰上孵育15min，隨運(yùn)行緩沖溶液(10mm磷酸鹽緩沖液，2.7mmkcl，137mmnacl和0.05％表面活性劑p20，ph7.4)流經(jīng)芯片表面，流速為30μl/min，結(jié)合時(shí)間為90s，解離時(shí)間為120s；最后用biaevaluation2.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，隨著多肽濃度的升高，溶液中未結(jié)合的pd-1蛋白濃度逐漸下降，從而使得pd-1與pd-l1的結(jié)合減弱，響應(yīng)值隨之下降。spr實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，該結(jié)果表明seqidno:1所示多肽能夠阻斷人pd-1與pd-l1的結(jié)合。

討論：本發(fā)明提供了靶向人pd-1蛋白，即，能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合人pd-1蛋白的多肽，各多肽在特定的位置具有特定的氨基酸殘基，從而能夠具備相似的結(jié)構(gòu)。這些多肽均能與人pd-1蛋白發(fā)生良好的結(jié)合，其中，seqidno:1所示多肽與人pd-1蛋白的結(jié)合親和力最高，其kd值為1.38μm與pd-l1和pd-1的結(jié)合kd值相當(dāng)。因此，這些多肽能作為pd-1/pd-l1結(jié)合的抑制劑或調(diào)節(jié)pd-1/pd-l1結(jié)合程度的調(diào)節(jié)劑，以及為研究pd-1/pd-l1免疫檢查點(diǎn)阻斷劑和設(shè)計(jì)、開發(fā)阻斷pd-1/pd-l1通路提供了多肽類先導(dǎo)藥物。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。