本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種單鏈抗體及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在國(guó)際上，一種新型的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療技術(shù)異軍突起，這就是應(yīng)用嵌合抗原受體基因修飾的t細(xì)胞過(guò)繼性地靶向性治療腫瘤的研究，該研究在臨床上取得了非常顯著的進(jìn)展。最為代表性的是以cd19為靶向的car-t細(xì)胞治療cd19陽(yáng)性的b細(xì)胞白血病和淋巴瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。june等發(fā)表在nejm的報(bào)道顯示：應(yīng)用cd19car-t細(xì)胞治療難治、復(fù)發(fā)性急性淋巴白血病患者取得顯著的效果，完全緩解率高達(dá)90％以上。

目前，全球至少有20多個(gè)研究小組在進(jìn)行此臨床治療研究。但是，在實(shí)體腫瘤的治療方面，car-t細(xì)胞顯現(xiàn)出有限的治療效果。主要有以下幾個(gè)原因：(1)靶抗原在正常組織中表達(dá)，脫靶毒性是car-t細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的主要障礙。(2)由于腫瘤的異質(zhì)性使car-t只能產(chǎn)生短暫的腫瘤消退，因?yàn)樽詈蟀锌乖幮缘哪[瘤細(xì)胞將占優(yōu)勢(shì)。(3)最重要的是，由腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制細(xì)胞因子同調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等抑制性細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞周?chē)纬傻拿庖咭种莆h(huán)境顯著抑制了car-t細(xì)胞的歸巢能力。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)能夠應(yīng)用于實(shí)體腫瘤治療的car-t細(xì)胞治療方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種單鏈抗體及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種單鏈抗體，所述抗體的氨基酸序列如seqidno.:2所示。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白中含有本發(fā)明第一方面所述的單鏈抗體作為融合蛋白的構(gòu)成元件。

在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白還含有選自下組的構(gòu)成元件：

(a)抗體的恒定區(qū)；

(b)cd28的跨膜結(jié)構(gòu)域；

(c)cd137元件(即4-1bb)；

(d)cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。

在另一優(yōu)選例中，所述的跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)閏d28的跨膜結(jié)構(gòu)域。

在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白在其n端具有信號(hào)肽元件。

在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白在抗體的恒定區(qū)與cd28的跨膜結(jié)構(gòu)域之間還設(shè)有抗體的鉸鏈區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗體的鉸鏈區(qū)為igd的抗體鉸鏈區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白為嵌合抗原受體。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體從n端至c端，依次具有以下元件：

任選的信號(hào)肽元件－本發(fā)明第一方面所述的單鏈抗體－抗體的恒定區(qū)－cd28的跨膜結(jié)構(gòu)域－cd137元件(4-1bb)－cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種嵌合抗原受體(car)，所述嵌合抗原受體的胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)榘被嵝蛄腥鐂eqidno.:2所示的單鏈抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體還含有以抗體恒定區(qū)、抗體的絞鏈區(qū)、cd28跨膜區(qū)及cd137和cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體從n端至c端，依次具有以下元件：

任選的信號(hào)肽元件－本發(fā)明第一方面所述的單鏈抗體－抗體的恒定區(qū)－cd28的跨膜結(jié)構(gòu)域－cd137元件(4-1bb)－cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第一方面所述的單鏈抗體、或含所述單鏈抗體的融合蛋白、或本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體。

在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸的序列如seqidno.:1所示。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第四方面中 所述的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述載體為慢病毒載體。

在本發(fā)明的第六方面，提供了一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞中含有本發(fā)明第五方面中所述的載體或染色體中整合有外源的本發(fā)明第四方面中所述的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞為t細(xì)胞(car-t細(xì)胞)。

在本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有(a)藥學(xué)上可接受的載體以及(b)本發(fā)明第一方面中所述的單鏈抗體、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第四方面所述的核酸分子、本發(fā)明第五方面所述的載體、本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞、或其組合。

在本發(fā)明的第八方面，提供了一種本發(fā)明第一方面中所述的單鏈抗體、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第四方面所述的核酸分子、本發(fā)明第五方面所述的載體、本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞的用途，用于制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤或抑制muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的藥物。

在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自下組：食道癌、腸胃癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、精囊腺癌、肺癌，三陰乳腺癌、或其組合。

在本發(fā)明的第九方面，提供了一種體外非治療性抑制腫瘤細(xì)胞的方法，包括步驟：在本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞存在的條件下，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤細(xì)胞為muc1陽(yáng)性細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤細(xì)胞包括t47d細(xì)胞。

在本發(fā)明的第十方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對(duì)象施用本發(fā)明第一方面中所述的單鏈抗體本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第四方面所述的核酸分子、本發(fā)明第五方面所述的載體、本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞、或本發(fā)明第七方面所述的藥物組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的單鏈抗體可以與muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞結(jié)合。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了p-sm3單鏈抗體氨基酸序列與sm3單鏈抗體氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。圖中，紅色氨基酸代表突變的氨基酸。

圖2顯示了嵌合抗原受體(car)的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，圖2a和圖2b分別顯示了包含原始muc1抗體a和突變后muc1單鏈抗體b的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)。

圖3顯示了muc1-car-t細(xì)胞對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞t47d的殺傷結(jié)果。其中，圖3a顯示了未轉(zhuǎn)染car的t細(xì)胞對(duì)t47d的殺傷結(jié)果，圖3b顯示了用空載體轉(zhuǎn)染的t對(duì)t47d的殺傷效果，圖3c顯示了a-car-t對(duì)t47d的殺傷結(jié)果，圖3d顯示了muc1-car-t細(xì)胞對(duì)t47d的殺傷結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入地研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)一種單鏈抗體及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種單鏈抗體、含有所述單鏈抗體的融合蛋白、含有所述單鏈抗體的嵌合抗原受體及其相關(guān)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明的含有所述單鏈抗體的嵌合抗原受體修飾的t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有很好的殺傷效果，脫靶毒性低，可以用于實(shí)體腫瘤的治療。

術(shù)語(yǔ)

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的單鏈抗體”、“本發(fā)明muc1單鏈抗體”、“muc1單鏈抗體b”指序列如seqidno.:2所示的單鏈抗體。

muc1分子

為了盡可能的降低car-t細(xì)胞的脫靶毒性，腫瘤靶點(diǎn)的選擇尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)muc1分子是一個(gè)很好的腫瘤靶點(diǎn)。主要有以下原因：一、在多達(dá)80％人類(lèi)腫瘤的腫瘤組織中，muc1會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)，muc1在食管癌，腸胃癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的異常表達(dá)。二、在腫瘤細(xì)胞上muc1的表達(dá)呈非極性分布；三、由于糖基轉(zhuǎn)移酶活性增高而導(dǎo)致muc1糖基化 不完全，暴露相關(guān)表位，成為腫瘤生物學(xué)治療的新靶點(diǎn)。

嵌合抗原受體

本發(fā)明提供了包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)，其中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有本發(fā)明的單鏈抗體作為靶-特異性結(jié)合元件。

胞外結(jié)構(gòu)域包括：靶-特異性結(jié)合元件(也稱(chēng)為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)指包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分。共刺激分子為淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的有效應(yīng)答所需要的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。

在car的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在car的胞漿結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可并入接頭。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“接頭”通常指起到將跨膜結(jié)構(gòu)域連接至多肽鏈的胞外結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。接頭可包括0-300個(gè)氨基酸，優(yōu)選地2至100個(gè)氨基酸和最優(yōu)選地3至50個(gè)氨基酸。

在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)過(guò)基因工程改造以表達(dá)car的細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)，其顯示顯著的抗腫瘤性質(zhì)。本發(fā)明的car還可以包括胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域具有融合至t細(xì)胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈(例如，cd3ζ)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的car當(dāng)在nkt細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，能夠基于抗原結(jié)合特異性改變抗原識(shí)別。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的car包括包含本發(fā)明特定信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(cd8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、cd137和cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成)。與其他方式的car相比，含有本發(fā)明單鏈抗體的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域顯著增加了抗腫瘤活性和cart細(xì)胞的體內(nèi)持久性。

絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)

對(duì)于絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)(跨膜結(jié)構(gòu)域)，car可被設(shè)計(jì)以包括融合至car的胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用天然與car中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些例子中，可選擇跨膜結(jié)構(gòu)域，或通過(guò)氨基酸置換進(jìn)行修飾，以避免將這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，從而最小化與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用。

跨膜結(jié)構(gòu)域可源于天然來(lái)源或合成來(lái)源。在天然來(lái)源中，該結(jié)構(gòu)域可源于 任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。具體用于本發(fā)明的跨膜區(qū)可源于t-細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154(即至少包括上述中的跨膜區(qū)(一個(gè)或多個(gè)))。

在本發(fā)明中，在恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)之間、以及絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)之間可以含有或不含有接頭序列(linker)。在一優(yōu)選例中，vh(重鏈可變區(qū))和vl(輕鏈可變區(qū))之間有序列為ggggsggggsggggs(seqidno.:5)的linker.

胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

本發(fā)明的car的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或另外的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是造成其中已放置car的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化的原因。術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子功能”指的是細(xì)胞的專(zhuān)有功能。例如，t細(xì)胞的效應(yīng)子功能可為包括細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞溶解活性或輔助活性。因此術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指的是轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)并指導(dǎo)細(xì)胞實(shí)施專(zhuān)有功能的蛋白部分。盡管通?？墒褂谜麄€(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在很多例子中，不必使用整個(gè)鏈。就使用細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，這種截短部分可用于代替完整的鏈，只要它轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域因此指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。

用于本發(fā)明的car的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選例子包括t細(xì)胞受體(tcr)的胞漿序列和協(xié)同行動(dòng)以在抗原受體結(jié)合后開(kāi)始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共受體，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。

已知通過(guò)tcr單獨(dú)產(chǎn)生的信號(hào)不足以完全活化t細(xì)胞，并且也需要次級(jí)或共刺激信號(hào)。因此，t細(xì)胞活化可被認(rèn)為由兩個(gè)不同類(lèi)的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列介導(dǎo)：通過(guò)tcr(初級(jí)胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列)開(kāi)始抗原-依賴(lài)性初級(jí)活化的那些和以抗原-非依賴(lài)性方式起作用以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)(次級(jí)胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列)的那些。

初級(jí)胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列以刺激方式或以抑制方式調(diào)節(jié)tcr復(fù)合物的初級(jí)活化。以刺激方式起作用的初級(jí)胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列可包含信號(hào)傳導(dǎo)基序，其已知為基于免疫受體酪氨酸的活化基序或itam。

包含在本發(fā)明中具有具體用途的初級(jí)胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列的itam的例子包括源于tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b 和cd66d的那些。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的car中的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)分子包括源于cd3ζ的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，car的胞漿結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)以本身包括cd3-ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或可與在本發(fā)明的car的內(nèi)容中有用的任何其他期望的胞漿結(jié)構(gòu)域(一個(gè)或多個(gè))聯(lián)合。例如，car的胞漿結(jié)構(gòu)域可包括cd3ζ鏈部分和共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分car。共刺激分子是淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的有效應(yīng)答所需的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。這種分子的例子包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、

nkg2c、b7-h3和與cd83特異性結(jié)合的配體等等。因此，盡管本發(fā)明主要以4-1bb作為共刺激信號(hào)傳導(dǎo)元件的例子，但其他共刺激元件也位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的car的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)部分內(nèi)的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列可以隨機(jī)或以規(guī)定的順序相互連接。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選長(zhǎng)度在2和10個(gè)氨基酸，可形成該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。

載體

本發(fā)明包括包含car序列的dna構(gòu)建體，其中該序列包括可操作地連接至信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核酸序列的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列。

編碼期望分子的核酸序列可利用在本領(lǐng)域中已知的重組方法獲得，諸如例如通過(guò)從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選文庫(kù)，通過(guò)從已知包括該基因的載體中得到該基因，或通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，從包含該基因的細(xì)胞和組織中直接分離?？蛇x地，感興趣的基因可被合成生產(chǎn)。

本發(fā)明也提供了其中插入本發(fā)明的dna的載體。源于逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載體是實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)期、穩(wěn)定的整合并且其在子細(xì)胞中增殖。

簡(jiǎn)單概括，通常通過(guò)可操作地連接編碼car多肽或其部分的核酸至啟動(dòng)子，并將構(gòu)建體并入表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)編碼car的天然或合成核酸的表達(dá)。該載體適合于復(fù)制和整合真核細(xì)胞。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和啟動(dòng)子。

該核酸可被克隆入許多類(lèi)型的載體。例如，該核酸可被克隆入如此載體， 其包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動(dòng)物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。

進(jìn)一步地，表達(dá)載體可以以病毒載體形式提供給細(xì)胞?？捎米鬏d體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機(jī)體中起作用的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、方便的限制酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)許多基于病毒的系統(tǒng)，用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便的平臺(tái)。可利用在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對(duì)象細(xì)胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實(shí)施方式中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用慢病毒載體。

額外的啟動(dòng)子元件，例如增強(qiáng)子，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的頻率。通常地，這些位于起始位點(diǎn)上游的30-110bp區(qū)域中，盡管最近已經(jīng)顯示許多啟動(dòng)子也包含起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔經(jīng)常是柔性的，以便當(dāng)元件相對(duì)于另一個(gè)被倒置或移動(dòng)時(shí)，保持啟動(dòng)子功能。在胸苷激酶(tk)啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件之間的間隔可被增加隔開(kāi)50bp，活性才開(kāi)始下降。取決于啟動(dòng)子，表現(xiàn)出單個(gè)元件可合作或獨(dú)立地起作用，以起動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

合適的啟動(dòng)子的一個(gè)例子為即時(shí)早期巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列為能夠驅(qū)動(dòng)可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子序列。合適的啟動(dòng)子的另一個(gè)例子為延伸生長(zhǎng)因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他組成型啟動(dòng)子序列，包括但不限于類(lèi)人猿病毒40(sv40)早期啟動(dòng)子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)長(zhǎng)末端重復(fù)(ltr)啟動(dòng)子、momulv啟動(dòng)子、鳥(niǎo)類(lèi)白血病病毒啟動(dòng)子、艾伯斯坦-巴爾(epstein-barr)病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子、魯斯氏肉瘤病毒啟動(dòng)子、以及人基因啟動(dòng)子，諸如但不限于肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌球蛋白啟動(dòng)子、血紅素啟動(dòng)子和肌酸激酶啟動(dòng)子。進(jìn)一步地，本發(fā)明不應(yīng)被限于組成型啟動(dòng)子的應(yīng)用。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也被考慮為本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用提供了分子開(kāi)關(guān)，其能夠當(dāng)這樣的表達(dá)是期望的時(shí)，打開(kāi)可操作地連接誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多核苷酸序列的表達(dá)，或當(dāng)表達(dá)是不期望的時(shí)關(guān)閉表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括但不限于金屬硫蛋白啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子、孕酮啟動(dòng)子和四環(huán)素啟動(dòng)子。

為了評(píng)估car多肽或其部分的表達(dá)，被引入細(xì)胞的表達(dá)載體也可包含可選擇的標(biāo)記基因或報(bào)道基因中的任一個(gè)或兩者，以便于從通過(guò)病毒載體尋求被轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群中鑒定和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其他方面，可選擇的標(biāo)記可被攜帶在單獨(dú)一段dna上并用于共轉(zhuǎn)染程序?？蛇x擇的標(biāo)記和報(bào)道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以便能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的可選擇標(biāo)記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。

報(bào)道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并用于評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)序列的功能性。通常地，報(bào)道基因?yàn)橐韵禄颍浩洳淮嬖谟谑荏w有機(jī)體或組織或由受體有機(jī)體或組織進(jìn)行表達(dá)，并且其編碼多肽，該多肽的表達(dá)由一些可容易檢測(cè)的性質(zhì)例如酶活性清楚表示。在dna已經(jīng)被引入受體細(xì)胞后，報(bào)道基因的表達(dá)在合適的時(shí)間下進(jìn)行測(cè)定。合適的報(bào)道基因可包括編碼熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因的基因(例如，ui-tei等，2000febsletters479:79-82)。合適的表達(dá)系統(tǒng)是公知的并可利用已知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。通常，顯示最高水平的報(bào)道基因表達(dá)的具有最少5個(gè)側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子區(qū)可被連接至報(bào)道基因并用于評(píng)價(jià)試劑調(diào)節(jié)啟動(dòng)子-驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力。

將基因引入細(xì)胞和將基因表達(dá)入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在表達(dá)載體的內(nèi)容中，載體可通過(guò)在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞。例如，表達(dá)載體可通過(guò)物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞。

將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包括載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。見(jiàn)例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的優(yōu)選方法為磷酸鈣轉(zhuǎn)染。

將感興趣的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用dna和rna載體。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動(dòng)物例如人細(xì)胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒i、腺病毒和腺伴隨病毒等等。

將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠；和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合 膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)傳遞工具(deliveryvehicle)的示例性膠體系統(tǒng)為脂質(zhì)體(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒傳遞系統(tǒng)的情況下，示例性傳遞工具為脂質(zhì)體?？紤]使用脂質(zhì)制劑，以將核酸引入宿主細(xì)胞(體外、離體(exvivo)或體內(nèi))。在另一方面，該核酸可與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中，散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)，經(jīng)與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相關(guān)聯(lián)的連接分子附接至脂質(zhì)體，陷入脂質(zhì)體，與脂質(zhì)體復(fù)合，分散在包含脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)聯(lián)合，作為懸浮液包含在脂質(zhì)中，包含在膠束中或與膠束復(fù)合，或以其他方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與組合物相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)、脂質(zhì)/dna或脂質(zhì)/表達(dá)載體不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。例如，它們可存在于雙分子層結(jié)構(gòu)中，作為膠束或具有“坍縮的(collapsed)”結(jié)構(gòu)。它們也可簡(jiǎn)單地被散布在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質(zhì)為脂肪物質(zhì)，其可為天然發(fā)生或合成的脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括脂肪小滴，其天然發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)以及包含長(zhǎng)鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類(lèi)、胺類(lèi)、氨基醇類(lèi)和醛類(lèi)的該類(lèi)化合物中。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述載體為慢病毒載體。本發(fā)明人研究證實(shí)，使用該慢病毒載體構(gòu)建本發(fā)明car，對(duì)t細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，且具有高度的可重復(fù)性。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述載體中還包括信號(hào)肽序列。優(yōu)選地，所述信號(hào)肽序列連接在所述抗原結(jié)核結(jié)構(gòu)域核酸序列的上游。

治療性應(yīng)用

本發(fā)明包括用慢病毒載體(lv)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(例如t細(xì)胞)。

因此，本發(fā)明也提供了刺激對(duì)哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞群或組織的t細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括以下步驟：施用給哺乳動(dòng)物表達(dá)car的t細(xì)胞，以治療muc1陽(yáng)性腫瘤。

在一優(yōu)選例中，本發(fā)明所述的腫瘤選自下組：食道癌、腸胃癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、精囊腺癌、肺癌，三陰乳腺癌、或其組合。

本發(fā)明的car-修飾的t細(xì)胞可被單獨(dú)施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分諸如il-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群結(jié)合施用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明的藥物組合物可包括如本文所述的靶細(xì)胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可 接受載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑諸如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制用于靜脈內(nèi)施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病癥、和患者疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重度——盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗(yàn)確定。

當(dāng)指出“免疫學(xué)上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時(shí)，待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定，其考慮患者(對(duì)象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度和病癥的個(gè)體差異?？赏ǔＶ赋觯喊ū疚拿枋龅膖細(xì)胞的藥物組合物可以以10⁴至10⁹個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量，優(yōu)選10⁵至10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量(包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值)施用。t細(xì)胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細(xì)胞可通過(guò)使用免疫療法中公知的注入技術(shù)(見(jiàn)例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676，1988)施用。對(duì)于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過(guò)監(jiān)測(cè)患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié)治療由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

對(duì)象組合物的施用可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括通過(guò)噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的car-t細(xì)胞組合物通過(guò)皮內(nèi)或皮下注射被施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的car-t細(xì)胞組合物優(yōu)選通過(guò)i.v.注射施用。本發(fā)明的car-t細(xì)胞的組合物可被直接注入腫瘤，淋巴結(jié)或感染位置。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的car-t細(xì)胞可與以下結(jié)合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和fk506，抗體或其他免疫治療劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺結(jié)合(例如，之前、同時(shí)或之后)而施用給患者。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象可經(jīng)歷高劑量化療的標(biāo)準(zhǔn)治療，之后進(jìn)行外周血干細(xì)胞移植。在一些實(shí)施方式中，在移植后，對(duì)象接受本發(fā)明的擴(kuò)展的免疫細(xì)胞的注入。在一個(gè)額外的實(shí)施方式中，擴(kuò)展的細(xì)胞在外科手術(shù)前或外科手術(shù)后施用。

施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病癥的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐實(shí)施。通常，每次治療或每個(gè)療程，可將1×10⁶個(gè)至1×10¹⁰個(gè)本發(fā)明經(jīng)修飾的t細(xì)胞，通過(guò)例如靜脈回輸?shù)姆绞?，施用于患者?/p>

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(a)本發(fā)明的單鏈抗體對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞具有極好的識(shí)別能力。

(b)本發(fā)明的muc1-car-t細(xì)胞在體外對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系具有顯著地殺傷效果。

(c)本發(fā)明的muc1-car-t細(xì)胞的脫靶毒性比較低。

(d)本發(fā)明的muc1-car-t細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)muc1陽(yáng)性的腫瘤病灶具有顯著的殺傷作用。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例1

muc1單鏈抗體序列的突變實(shí)驗(yàn)

提供一原始的muc1抗體a，其氨基酸序列如seqidno.:4所示，核苷酸序列如seqidno.:3所示。利用分子生物學(xué)方法對(duì)該原始抗體a的序列進(jìn)行氨基酸突變，共突變六個(gè)氨基酸序列，得到氨基酸序列如seqidno.:2所示的muc1單鏈抗體b。

圖1顯示了原始抗體a的氨基酸序列及muc1單鏈抗體b的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，紅色氨基酸代表突變的氨基酸。其中a,q,c三個(gè)突變點(diǎn)位于cdr區(qū)。

實(shí)施例2

car-t細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn)

用實(shí)施例1中得到的muc1單鏈抗體b的序列構(gòu)建muc1-car-慢病毒載體，進(jìn)行病毒包裝，轉(zhuǎn)染t細(xì)胞，制備muc1-car-t細(xì)胞后進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)。靶細(xì)胞 為muc1陽(yáng)性的t47d細(xì)胞，效靶比為5:1，殺傷時(shí)間為12小時(shí)。

相同方法用原始抗體a構(gòu)建a-car-t細(xì)胞并與muc1-car-t細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)。

嵌合抗原受體(car)的結(jié)構(gòu)如圖2所示，圖2a和圖2b分別顯示了包含原始抗體a和突變muc1單鏈抗體b的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)。其中，a-scfv為原始抗體a的序列，b-scfv為突變的muc1單鏈抗體序列，fc為鉸鏈區(qū)，cd28和cd137(4-1bb)分子為t細(xì)胞活化共刺激分子，cd3分子為t細(xì)胞活化第一信號(hào)分子。

結(jié)果如圖3所示，與利用原始抗體a制備的a-car-t細(xì)胞(＜40％殺傷效果)相比，muc1-car-t細(xì)胞對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞t47d有更強(qiáng)的體外殺傷效果(＞50％的殺傷結(jié)果)。以未轉(zhuǎn)染car的t細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞作為對(duì)照組(殺傷效率＜20％)。

上述結(jié)果表明，用muc1單鏈抗體b構(gòu)建的car-t細(xì)胞對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞有更好的殺傷能力。

實(shí)施例3

muc1-car-t的臨床試驗(yàn)

對(duì)一例精囊腺癌病人用muc1-car-t進(jìn)行治療，顯示出了顯著的治療效果。具體地，分別用muc1-car-t細(xì)胞和a-car-t細(xì)胞對(duì)兩個(gè)大小及生物學(xué)形態(tài)類(lèi)似的腫瘤病灶進(jìn)行了瘤內(nèi)注射，其他治療措施完全相同。

結(jié)果顯示，用a-car-t治療的腫瘤病灶沒(méi)有顯現(xiàn)出壞死現(xiàn)象，但是用muc1-car-t細(xì)胞治療的腫瘤病灶出現(xiàn)明顯的腫瘤壞死現(xiàn)象，上述結(jié)果表明，與原始抗體a相比，muc1單鏈抗體b對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤病灶有更好的殺傷作用。

實(shí)施例4

muc1-car-t的臨床試驗(yàn)

用muc1-car-t細(xì)胞和a-car-t細(xì)胞分別對(duì)兩個(gè)大小及生物學(xué)形態(tài)類(lèi)似的精囊腺癌病灶進(jìn)行了瘤內(nèi)注射，治療后對(duì)兩個(gè)腫瘤病灶進(jìn)行免疫組織化學(xué)及其它分析。

結(jié)果顯示，用muc1-car-t治療的腫瘤病灶muc1陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，腫瘤病灶有明顯的壞死現(xiàn)象，而且有明顯的cd4+及cd8+淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)。用a-car-t治療的腫瘤病灶沒(méi)有發(fā)現(xiàn)muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞有明顯的減少，也沒(méi)有 明顯的淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)現(xiàn)象。結(jié)果表明與原始抗體a的序列構(gòu)建的a-car-t細(xì)胞相比，用muc1單鏈抗體b構(gòu)建的muc1-car-t細(xì)胞對(duì)muc1陽(yáng)性腫瘤病灶具有明顯的殺傷效果。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。