相關(guān)申請本申請要求保護(hù)2006年8月25日提交的美國臨時申請?zhí)?0/840,093和2006年8月28日提交的美國臨時申請?zhí)?01840,755的權(quán)益，所述兩份文獻(xiàn)因而公開地在此處通過引用的方式完整并入。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于穩(wěn)定整合外源DNA序列至MVA基因組內(nèi)的插入位點(diǎn)。相關(guān)技術(shù)的描述痘病毒科的成員具有編碼數(shù)百種蛋白質(zhì)的龐大雙鏈DNA基因組(《費(fèi)氏病毒學(xué),第五版》Moss,B.2007“痘病毒科：病毒及其復(fù)制”("Poxviridae:TheVirusesandTheirReplication"inFieldsVirology,5thEd)(D.M.Knipe,P.M.Howley,D.E.Griffin,R.A.1Lamb,M.A.Martin,B.Roizman和S.E.Straus,Eds),LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA)。已知高度減毒的痘苗病毒株-修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因組序列(Sutter,G.和Moss,B.1992美國科學(xué)院院報(ProcNatlAcadSciUSA)89:10847-10851；和Sutter,G.等1994疫苗(Vaccine)12:1032-1040)，其中所述的修飾的安卡拉痘苗病毒不能生長在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中并且是重組疫苗載體的良好候選物。修飾的安卡拉痘苗病毒已經(jīng)在雞胚成纖維細(xì)胞中傳代超過570次，在此期間相對于宿主范圍嚴(yán)格限制的親代野生型Ankara株而言，6個重大缺失已經(jīng)出現(xiàn)(Meyer,H.等1991普通病毒學(xué)雜志(JGenVirol)72:1031-1038)。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于整合外源序列至痘苗病毒基因組的基因間區(qū)(IGR)內(nèi)的新插入位點(diǎn)，其中所述的IGR位于該痘苗病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框(ORF)之間或者所述IGR的兩側(cè)是該痘苗病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框，并且其中所述ORF對應(yīng)于保守基因，并涉及用來插入外源DNA至痘苗病基因組內(nèi)的相關(guān)質(zhì)粒載體，并且還涉及作為藥物或疫苗的含有插入所述新插入位點(diǎn)內(nèi)的外源序列的重組痘苗病毒。附圖說明圖1.基于pol基因序列同一性的HIV-1和HIV-2的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系。SIVcpz和SIVsmm是分別從黑猩猩(chimpanzee)和白眉猴(sootymangabeymonkey)中回收的類人靈長類慢病毒。圖2.基于全長pol基因序列的具有四種不同SIVcpz分離株的HIV-1M組、N組和O組(group)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系。短棒表示遺傳距離0.1(10％核苷酸趨異性)并且星號指出基于env序列的N組HIV-1分離株的位置。圖3.HIV-1分離株的嗜性及生物學(xué)特征。圖4.HIV-編碼的蛋白質(zhì)。顯示HIV基因的位置、初級翻譯產(chǎn)物(在一些情況下是多聚蛋白)的尺寸和加工的成熟病毒蛋白。圖5.成熟HIV-1病毒粒子的示意圖。圖6.HIV-1Env糖蛋白的線性示意圖。箭頭1表示gp160切割成gp120和gp41的位點(diǎn)。在gp120中，交叉線區(qū)域代表可變結(jié)構(gòu)域(V1-V5)并且空心框描述保守序列(C1-C5)。在gp41胞外結(jié)構(gòu)域中，顯示幾個結(jié)構(gòu)域：氨基端融合肽和兩個胞外結(jié)構(gòu)域螺旋(氨基端螺旋與羧基端螺旋)?？缒そY(jié)構(gòu)域由黑色框代表。在gp41胞漿結(jié)構(gòu)域中，顯示Tyr-X-X-Leu(YXXL)內(nèi)吞基序(SEQIDNO:1)和兩個預(yù)測性螺旋結(jié)構(gòu)域(螺旋-l和螺旋-2)。氨基酸編號被標(biāo)出。圖7.pLW-73轉(zhuǎn)移載體。圖8.pLW-73轉(zhuǎn)移載體的核苷酸序列(上部鏈，SEQIDNO:2；底部鏈，SEQIDNO:3)。圖9.編碼烏干達(dá)進(jìn)化枝DEnv蛋白(分離株A07412)的核苷酸序列(SEQIDNO:4)。圖10.編碼烏干達(dá)進(jìn)化枝Dgagpol蛋白(分離株A03349)的密碼子變異的核苷酸序列(SEQIDNO:5)。圖11.重組MVA的生成和對所插入基因的穩(wěn)定性的分析。A)將env和gagpol分別插入DelII和DelIII位點(diǎn)的示意圖例。B)通過免疫染色法評價穩(wěn)定性。圖12.MVA/65A/Genv中env突變的類型和頻率。圖13.在DelIII中插入EnvinI8R/G1LIGR和GagPol。圖14.修飾A/G構(gòu)建體以增加穩(wěn)定性。圖15.蝕斑傳代后的Env的表達(dá)。圖16.各個克隆的PCR和蛋白質(zhì)印跡分析。圖17.通過雙重重組MVA(doublerecombinantMVA)表達(dá)A/Genv。圖18.表達(dá)來自烏干達(dá)HN-1分離株的env和gagpol的重組病毒。圖19.MVA/UGD4a-無著色env蝕斑的分析。圖20.對重組MVA中UGDenv基因的修飾圖21.MVA/UGD4b-無著色gag蝕斑的分析。*，成段4-6個G或C殘基的位置。圖22.對重組MVA中UGDgagpol基因的修飾。圖23.構(gòu)建表達(dá)UGDenv和gagpol的穩(wěn)定重組MVA。圖24.由MVA/UGD4d激發(fā)的細(xì)胞應(yīng)答。圖25.由MVA/UGD4d激發(fā)的抗體應(yīng)答。微生物的保藏以下微生物已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約條款以所示日期保藏于弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC):微生物登錄號日期MVA1974/NIH克隆1PTA-50952003年3月27日MVA1974/NIH克隆1以ATCC登錄號：PTA-5095在2003年3月27日保藏于美國弗吉尼亞州20110-2209，馬納薩斯，Blvd大學(xué)，10801，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(布達(dá)佩斯條約)的條款進(jìn)行該保藏。這確保自保藏日起維持此保藏的活培養(yǎng)物30年。ATCC將根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款使該保藏物可獲得并且該保藏物遵循申請人與ATCC之間合同，其中所述的合同確保在相關(guān)的美國專利發(fā)布時或在任何美國申請或外國申請的公眾公開時，無論誰在先，公眾可永久且不受限制地獲得該保藏物的培養(yǎng)物的子代，并且確保美國專利商標(biāo)局委員會根據(jù)35USC§122得到授權(quán)并且根據(jù)其委員會規(guī)定(包括37CFR§1.14)決定的個人可獲得所述子代。所保藏毒株的可獲得性不得解釋為與任何政府權(quán)利機(jī)關(guān)根據(jù)其專利法所授予的權(quán)力相抵觸地許可實施本發(fā)明。優(yōu)選實施方案詳述除非另外定義，本文中所用技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。參見例如，SingletonP和SainsburyD.,微生物學(xué)與分子生物學(xué)詞典第三版(DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology.3rded.),J.Wiley&Sons,Chichester,NewYork,2001和費(fèi)氏病毒學(xué)第五版(FieldsVirology.5thEd.)編者D.M.Knipe,P.M.Howley,D.E.Griffin,RA.Lamb,M.AMartin,B.Roizman和S.E.Straus),LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA,2007。過渡態(tài)術(shù)語“包含”與“包括”、“含有”或“特征在于”是同義的，是包含性或開放的，并且不排除額外的、未提及的要素或方法步驟。過渡態(tài)短語“由……組成”排除權(quán)利要求中未詳述的任意要素、步驟或組分，但是不排除與本發(fā)明不相關(guān)的額外組分或步驟，如通常與本發(fā)明相關(guān)的雜質(zhì)。過渡態(tài)短語“基本上由……組成”將權(quán)利要求的范圍限于指定的材料或步驟和這樣的材料或步驟，其實際上不影響要求權(quán)利保護(hù)的本發(fā)明基本和新穎的特征?；诩棺祫游锖屠ハx宿主范圍，將痘病毒分成脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)和昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)。脊椎動物痘病毒亞科由8個屬組成：正痘病毒屬(Orthopoxvirus)、副痘病毒屬(Parapoxvirus)、禽痘病毒屬(Avipoxvirus)、山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)、野兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)、豬痘病毒屬(Suipoxvirus)、軟體動物痘病毒屬(Molluscipoxvirus)和亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)。正痘病毒屬的原型成員是痘苗病毒。已經(jīng)對每種脊椎動物痘病毒的至少一種成員和兩種昆蟲痘病毒報道完整基因組序列。接近100種基因是在全部脊椎動物痘病毒中保守的并且這些基因大約一半也存在于昆蟲痘病毒中?；谏鲜鰞?nèi)容，可以產(chǎn)生幾項概括：基因大多是非重疊的，傾向存在于指向基因組更近末端的模塊內(nèi)，若高度保守且涉及必需復(fù)制功能則通常位于中央?yún)^(qū)域內(nèi)，并且若可變且涉及宿主相互作用則通常位于末端區(qū)域內(nèi)。中央基因在全部脊椎動物痘病毒中的排列明顯相似。源于完整基因組測序之前并隨后用于痘苗病毒哥本哈根株完整序列的痘苗病毒基因或ORF(開放閱讀框)命名慣例組成如下：使用HindIII限制性核酸內(nèi)切酶的DNA片段字母編號，后接在該片段內(nèi)的ORF編號(從左至右)和根據(jù)ORF方向后接L或R。對此規(guī)則的一個例外是HindIIIC片段；對其ORF從右邊開始編號以避免在所述基因組的高度可變性左末端處開始。除去掉L或R之外，多肽名稱對應(yīng)于基因名稱。在大部分后續(xù)的痘病毒完整基因組序列中，對ORF從基因組的一個末端至另一個末端連續(xù)編號。然而，已經(jīng)將早期字母編號保留作為俗名以提供文獻(xiàn)連續(xù)性。在參考書中通常顯示痘苗病毒西儲(WesternReserve)(WR)株的ORF數(shù)，原因是該毒株已經(jīng)用于眾多生物化學(xué)研究和遺傳學(xué)研究中。本發(fā)明實施方案的發(fā)明人鑒定到用于插入外源DNA序列至修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因組內(nèi)的新位點(diǎn)。所述的新插入位點(diǎn)位于該病毒的基因組的基因間區(qū)(IGR)內(nèi)，其中所述的IGR依次位于MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框(ORF)之間或者所述IGR的兩側(cè)是所述MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框，并且其中所述的ORF對應(yīng)于保守基因。因此，本發(fā)明的實施方案涉及這樣的重組MVA，其包含插入該病毒基因組的IGR內(nèi)的異源DNA序列。根據(jù)該實施方案，一個或多個外源DNA序列可以插入一個或多個IGR內(nèi)。出人意料地發(fā)現(xiàn)插入MVA基因組IGR內(nèi)的外源DNA序列保持穩(wěn)定。認(rèn)為MVA的基因組是很不穩(wěn)定的。似乎對病毒增殖是非必需的基因或DNA序列受到缺失或片段化。在一方面雖然發(fā)現(xiàn)在異源DNA序列插入MVA基因組的天然存在性缺失位點(diǎn)時，獲得穩(wěn)定的重組MVA，然而另一方面發(fā)現(xiàn)有時這些重組MVA不穩(wěn)定。因此，可以得出結(jié)論：預(yù)期插入ORF間的間隔序列內(nèi)的對病毒增殖是非必需的異源DNA序列也被病毒刪除。盡管ORF的核苷酸序列編碼形成肽、多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列，然而在兩個ORF之間的IGR沒有編碼能力，不過可以包含對轉(zhuǎn)錄性控制病毒基因表達(dá)是必需或參與其中的調(diào)節(jié)元件、結(jié)合位點(diǎn)、啟動子和/或增強(qiáng)子序列。因此，IGR可以參與病毒生活周期的調(diào)節(jié)性控制。然而，本實施方案的發(fā)明人也已經(jīng)證明所述的新插入位點(diǎn)具有出乎意料的優(yōu)勢，從而外源DNA序列可以穩(wěn)定插入MVA基因組，而不影響或改變MVA的典型特征和基因表達(dá)。所述的新插入位點(diǎn)是特別有用的，因為MVA的ORF或編碼序列沒有改變。ORF的核苷酸序列規(guī)律地以起始密碼子開始并以終止密碼子結(jié)束。根據(jù)兩個相鄰ORF的方向，IGR(在這些ORF之間的區(qū)域)在兩側(cè)具有這兩個相鄰ORF的兩個終止密碼子，或這兩個相鄰ORF的兩個起始密碼子，或第一ORF的終止密碼子和第二ORF的起始密碼子，或第一ORF的起始密碼子和第二ORF的終止密碼子。因此，用于外源DNA序列進(jìn)入IGR的插入位點(diǎn)可以在第一ORF的終止密碼子下游或3'。在相鄰ORF(又稱第二ORF)與第一ORF具有相同方向的情況下，位于第一ORF的終止密碼子下游的該插入位點(diǎn)位于第二ORF的起始密碼子上游或5'。在第二ORF與第一ORF具有相對方向的情況下，這意味著兩個相鄰ORF的方向彼此相對，則該插入位點(diǎn)位于兩個ORF的終止密碼子下游。作為第三選擇，在兩個相鄰ORF以相反方向閱讀，但是這兩個相鄰ORF的方向彼此背離，這與特征如下的位置同義：這兩個ORF的起始密碼子彼此相鄰，則外源DNA相對于這兩個起始密碼子而插入上游。MVA基因組中的ORF以兩個編碼方向出現(xiàn)。因此，mRNA合成活性從左至右(即正方向)和相應(yīng)從右至左(反方向)出現(xiàn)。通過在基因組的不同HindIII限制性消化片段上的方向和位置而鑒定ORF，這是痘病毒學(xué)慣例并且變成痘苗病毒標(biāo)準(zhǔn)分類法。就該命名法而言，不同HindIII片段由對應(yīng)于其遞減大小的順次大寫字母命名。ORF在每個HindIII片段上從左至右編號并且ORF的方向由大寫L(代表轉(zhuǎn)錄從右至左)或R(代表轉(zhuǎn)錄從左至右)指示。此外，存在使用不同命名法的對MVA基因組結(jié)構(gòu)的最近出版物。簡而言之從基因組的左端至右端對ORF編號并且用大寫L或R表示其方向(Antoine,G.等1998病毒學(xué)(Virology)244:365-396)。作為實例，根據(jù)既往命名法的I8RORF對應(yīng)于根據(jù)Antoine等的069RORF。在產(chǎn)生表達(dá)HIV基因的修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)重組體作為候選疫苗的工作中，本發(fā)明人已經(jīng)觀察到HIV基因表達(dá)的不穩(wěn)定性。它們確定不穩(wěn)定性的原因之一是外來基因及MVA側(cè)翼區(qū)缺失。為解決這個問題，本發(fā)明人著手將外來基因插入保守基因之間以防止重組MVA中有效缺失發(fā)生。具有此類缺失的病毒具有生長優(yōu)勢并且因此將生長超過rMVA病毒群。若把外來基因插入痘苗病毒基因組內(nèi)的保守基因(認(rèn)為痘苗病毒復(fù)制需要這些基因并且它們因此是“必需基因”)之間，則必需基因的任何缺失會抑制病毒復(fù)制，并且因此不會生長超過重組MVA。因此，rMVA群體的穩(wěn)定表達(dá)得以維持。本發(fā)明人已經(jīng)用來產(chǎn)生重組體的MVA毒株由本發(fā)明人向美國疾病預(yù)防控制中心提供并且隨后由阿卡姆貝斯(Acambis)測序(基因庫(Genbank)登錄號AY603355)。BavarianNordic以其W0031097845公開作為基礎(chǔ)的MVA毒株是由Antoine,G.等1998Virology244:365-396測序的痘苗病毒株-修飾的安卡拉痘苗病毒(Genbank登錄號U94848)。(請注意在這兩個序列中對給定基因的基因編號是不同的)本發(fā)明人最初尋找在痘病毒科中保守的基因以及在脊椎動物痘病毒(脊椎動物痘病毒)亞科中保守的那些基因(Upton,C等2003病毒學(xué)雜志(JournalofVirology)77:7590-7600)。這些基因在互聯(lián)網(wǎng)址poxvirus.org上的痘病毒生物信息中心(PoxvirusBioinformaticsResourceCenter)內(nèi)所給出哥本哈根痘苗病毒(Genbank登錄號M35027)的命名法中列出。這些基因總計是痘病毒科中的49個保守基因和在脊椎動物痘病毒中保守的41個額外基因，產(chǎn)生總計90個保守基因。從這90個保守基因中，本發(fā)明人列出保守基因?qū)χg的基因間位點(diǎn)。在表1中列出這些基因?qū)Α?請注意不在BavarianNordicW0031097845公開中包含的基因被標(biāo)記)。這些基因的方向是可變的，一些基因向右轉(zhuǎn)錄，一些基因向左轉(zhuǎn)錄。這意味某些所述基因間位點(diǎn)含有必須在插入載體的構(gòu)建中予以保留的啟動子。此外，對于重疊性保守基因，在載體構(gòu)建期間，所述基因?qū)⒈仨毷褂昧硗獾拿艽a子加以重構(gòu)以將重復(fù)序列最小化。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明人關(guān)注這樣的保守基因，其方向為“尾對尾”，從而所述基因的3'終止密碼子彼此緊密接近。用在這些位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建由以下事實促進(jìn)，即在所述的終止密碼子之間的這個區(qū)域中沒有啟動子。若存在分隔所述終止密碼子的基因間核苷酸，則構(gòu)建插入載體是簡單明了的。若一個基因的終止密碼子位于另一個基因的3'末端內(nèi)部，則在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建期間，所述基因可以使用另外的密碼子加以重構(gòu)以將重復(fù)序列最小化，或根據(jù)重疊區(qū)的大小，在PCR中單純地修正所述側(cè)翼區(qū)，從而不重疊。表2給出滿足保守基因方向為“尾對尾”條件的基因間位點(diǎn)。以灰色突顯的那些基因間位點(diǎn)沒有重疊末端并且因而對構(gòu)建是最簡單的。本發(fā)明人特別關(guān)注沒有重疊末端的6個基因間位點(diǎn)。在這6個基因間位點(diǎn)的有效實施例中，本發(fā)明人選擇基因間位點(diǎn)071-072(I8R-G1L)來插入外來基因。除使用如上文在厄普頓出版物(Uptonpublication)中列出的保守基因條件之外，對于已經(jīng)實驗性缺失并且病毒復(fù)制在該突變體中降低達(dá)10倍的任何基因，可以視其為“必需基因”。若該基因位于另一種必需基因或保守基因近旁，則這兩個基因可以視作外來基因的不同插入位點(diǎn)。表1保守基因之間的基因間位點(diǎn)表2具有“尾對尾”方向的保守基因根據(jù)本發(fā)明，異源DNA序列可以插入兩個相鄰ORF間的一個或多個IGR內(nèi)，其中所述的兩個相鄰ORF以示例性方式或其相應(yīng)方式選自由(使用CDC/阿卡姆貝斯(Acambis)的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142和142-143所組成的組中。在優(yōu)選的實施方案中，所述異源序列插入位于具有“尾對尾”方向的兩個相鄰ORF側(cè)翼的IGR，其中所述的兩個相鄰ORF選自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122和132-133所組成的組中。在有效實施例中，所述異源DNA序列插入其中保守基因沒有071-072重疊末端的IGR。異源或外源DNA序列是這樣的序列，在自然界中通常無法找到所述序列與如本發(fā)明所用的痘病毒連接。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，所述外源DNA序列包含至少一個編碼序列。該編碼序列與轉(zhuǎn)錄控制元件、優(yōu)選與痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件有效連接。此外，也可以使用痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件間的組合和例如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。根據(jù)其它實施方案，所述的外源DNA序列也可以包含與一個或幾個轉(zhuǎn)錄控制元件連接的兩個或兩個以上編碼序列。優(yōu)選地，該編碼序列編碼一種或多種蛋白質(zhì)、多肽、肽、外來抗原或抗原表位，尤其那些有治療意義的基因。本發(fā)明有治療意義的基因可以得自作為疾病病因的病原性或感染性微生物的基因或是與其同源的基因。因此，在本發(fā)明的上下文中，此類有治療意義的基因呈遞至機(jī)體免疫系統(tǒng)以便影響、優(yōu)選誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答并且因而接種或預(yù)防性保護(hù)該機(jī)體免遭所述微生物感染。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案，所述有治療意義的基因選自感染性病毒例如-但不限于-登革病毒、乙型或丙型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒(如HIV)的基因。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所述異源DNA序列得自HIV并且編碼HIV包膜(HIVenv)，其中所述的HIVenv基因優(yōu)選地插入ORF071-072(I8R-G1L)之間的IGR內(nèi)。另外，本發(fā)明的有治療意義的基因也包含對增殖病、癌癥或代謝病具有治療效果的疾病相關(guān)基因，例如，有治療意義的基因就癌癥而言可以是具有誘導(dǎo)特異性抗癌免疫反應(yīng)的癌抗原。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，編碼序列包含至少一種標(biāo)記基因或選擇基因。選擇基因?qū)⑻囟剐赞D(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞，因而某種選擇方法變得可行。技術(shù)人員熟知可以用在痘病毒系統(tǒng)中的多種選擇基因，例如新霉素抗性基因(NPT)或磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)屬于這些選擇基因。標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中誘導(dǎo)可用來鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的顏色反應(yīng)。技術(shù)人員熟知可以用在痘病毒系統(tǒng)中的多種標(biāo)記基因。例如編碼例如P-半乳糖苷酶(P-gal)、P-葡萄糖苷酶(P-glu)、綠色熒光蛋白(EGFP)或藍(lán)色熒光蛋白的基因?qū)儆谶@些選擇基因。根據(jù)本發(fā)明的又一實施方案，所述外源DNA序列包含這樣的間隔序列，該間隔序列將痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件和/或該外源DNA序列內(nèi)的編碼序列與相鄰ORF的終止密碼子和/或起始密碼子隔開。在相鄰ORF與所插入的外源DNA序列內(nèi)編碼序列之間的這種間隔序列具有穩(wěn)定所插入外源DNA的優(yōu)勢，并且因此穩(wěn)定任意的所得重組病毒。該間隔序列的大小是可變的，只要此序列沒有自己的編碼或調(diào)節(jié)功能即可。根據(jù)其它實施方案，將痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件和/或外源DNA序列內(nèi)的編碼序列與相鄰ORF的終止密碼子隔開的間隔序列是至少1個核苷酸長。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，將痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件和/或外源DNA序列內(nèi)的編碼序列與相鄰ORF的起始密碼子隔開的間隔序列是至少30個核苷酸長度。尤其，在起始密碼子上游所鑒定的常見痘苗病毒啟動子元件的情況下，外源DNA的插入可以不將該啟動子元件與相鄰ORF的起始密碼子隔開。常見痘苗病毒啟動子元件可以通過掃描例如晚期啟動子的序列“TAAAT”(Davison和Moss1989分子生物學(xué)雜志(J.MolBiol.)；210:771-784)和晚期啟動子的A/T豐富域進(jìn)行鑒定。約30個核苷酸的間隔序列是確保位于ORF起始密碼子上游的痘病毒啟動子不受影響的優(yōu)選距離。此外，根據(jù)又一個優(yōu)選的實施方案，所插入外源DNA與相鄰ORF的起始密碼子之間的距離是約50個核苷酸并且更優(yōu)選是約100個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案，所述間隔序列包含能夠控制相鄰ORF轉(zhuǎn)錄的額外痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生重組MVA的常見MVA株是已經(jīng)以ATCC登錄號：PTA-509在2003年3月27日保藏于美國弗吉尼亞州20110-2209，馬納薩斯，Blvd大學(xué)，10801，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的MVA1974/NIH克隆1。術(shù)語本發(fā)明病毒的“衍生物”指顯示與親代病毒相同的特征子，不過在其基因組的一個或多個部分內(nèi)顯示差異的子代病毒。術(shù)語“MVA的衍生物”描述具有與MVA相比的相同功能性特征的病毒。例如，MVA1974/NIH克隆1的衍生物具有MVA1974/NIH克隆1的特征性特點(diǎn)。MVA1974/NIH克隆1或其衍生物的這些特點(diǎn)之一是其減毒作用和宿主范圍嚴(yán)格限制。本發(fā)明的重組MVA可用作藥物或疫苗。根據(jù)其它實施方案，它用于導(dǎo)入外源編碼序列至靶細(xì)胞內(nèi)，所述的序列與靶細(xì)胞的基因組是同源或異源的?？梢泽w外導(dǎo)入外源編碼序列至靶細(xì)胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗原或抗原表位。這種方法包括用本發(fā)明的重組MVA感染宿主細(xì)胞、在合適條件下培養(yǎng)感染的宿主細(xì)胞并分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽、肽、蛋白質(zhì)、抗原、表位和/或病毒。另外，用于導(dǎo)入一個或多個同源序列或一個或多個異源序列至細(xì)胞內(nèi)的方法可以用于體外和體內(nèi)療法。對于體外療法，將事先已經(jīng)用本發(fā)明重組MVA(離體)感染的分離細(xì)胞施用至活的動物體以影響、優(yōu)選誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。對于體內(nèi)療法，將本發(fā)明的重組痘病毒直接施用至活的動物體以影響、優(yōu)選誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在這種情況下，接種部位周圍的細(xì)胞以及通過例如血液使病毒運(yùn)輸至其附近的細(xì)胞直接被本發(fā)明的重組MVA感染。在感染后，這些細(xì)胞合成治療性基因的蛋白質(zhì)、肽或抗原表位，其中所述的蛋白質(zhì)、肽或抗原表位由外源編碼序列編碼并且隨后將它們或其部分呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上。免疫系統(tǒng)的特化細(xì)胞識別此類異源蛋白質(zhì)、肽或表位的呈現(xiàn)并發(fā)動特異性免疫應(yīng)答。由于MVA是高度生長受限的并且因此被高度弱化，故MVA用于治療類型廣泛的哺乳動物，包括人，所述的哺乳動物包括免疫缺陷的動物或人。本發(fā)明也提供用于誘導(dǎo)在包括人的活的動物體中免疫應(yīng)答的藥物組合物和疫苗。所述藥物組合物可以通常包括一個或多個/種藥學(xué)上可接受的和/或經(jīng)批準(zhǔn)的載體、添加物、抗生素、防腐劑、輔藥、稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。此類輔助物質(zhì)可以是水、鹽水、甘油、乙醇、濕潤或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。合適的載體一般是大體積、代謝緩慢的分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集體等。為制備疫苗，將本發(fā)明的重組痘病毒轉(zhuǎn)化成生理可接受的形式。這可以基于制備抗天花免疫接種所用的痘病毒疫苗的經(jīng)驗(如Stickl,H.等1974DtschMedWochenschr.99:2386-2392所述)進(jìn)行。例如，將純化的病毒貯存在-80℃，以5×10E8TCID50/ml的滴度配制在約10mMTris，140mMNaClpH7.4的緩沖液內(nèi)。為制備疫苗注射劑(vaccineshot)，例如凍干在100ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)內(nèi)在2％胨和1％人白蛋白存在下于安瓿、優(yōu)選優(yōu)選玻璃安瓿中10E2-10E8個顆粒的病毒。備選地，該疫苗注射劑(vaccineshot)可以通過逐步凍干在制劑中的病毒而產(chǎn)生。所述制劑可以含有額外的添加物，如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或適于體內(nèi)施用的其它助劑，如抗氧化劑或惰性氣體、穩(wěn)定劑或重組蛋白(例如人血清白蛋白)。隨后玻璃安瓿被密封并且可以在4℃與室溫之間貯存數(shù)月。然而只要無需求，則將安瓿優(yōu)選地貯存在低于-20℃的溫度。為免疫接種或治療，凍干物(lyophilisate)可以溶解在0.1-0.5ml的水溶液、優(yōu)選生理鹽水或或Tris緩沖液，并全身或局部地施用，即胃腸道外、皮下、肌內(nèi)、通過劃痕法或技術(shù)人員已知的任何其它施用途徑施用。施用模式、施用的劑量和次數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員以已知方式優(yōu)化。然而，患者最常見地在首次免疫接所述受注射劑后約1個月至6周后以第二注射劑接種。本發(fā)明還涉及可用來產(chǎn)生本發(fā)明重組MVA的質(zhì)粒載體，并且也涉及某些DNA序列。通常，位于兩個相鄰ORF之間或在兩側(cè)具有所述兩個相鄰開放閱讀框的IGR包含這樣的核苷酸序列，其包含其中可以插入目的外源DNA序列。因此，本發(fā)明的質(zhì)粒載體包含得自MVA基因組或與其同源的DNA序列，其中所述的DNA序列包含位于該病毒基因組的兩個相鄰ORF之間或在兩側(cè)具有該病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框的IGR序列的完整或部分核酸。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒載體包含在所述IGR衍生性序列內(nèi)插入的至少一個克隆位點(diǎn)，所述克隆位點(diǎn)用于插入目的外源DNA序列并優(yōu)選地用于插入與所述異源DNA序列有效連接的痘病毒轉(zhuǎn)錄控制元件。任選地，該質(zhì)粒載體包含報道基因盒和/或選擇基因盒。該質(zhì)粒載體優(yōu)選地也包含在IGR序列的所述完整片段或部分片段側(cè)翼的兩個相鄰ORF的序列。已經(jīng)鑒定到不包含核苷酸序列的一些IGR。在這些情況下，該質(zhì)粒載體包含IGR側(cè)翼序列的DNA序列，即兩個相鄰ORF的DNA序列。優(yōu)選地，向所述IGR插入用于插入異源DNA序列的克隆位點(diǎn)。該IGR側(cè)翼序列的DNA用來指導(dǎo)外源DNA序列插入MVA基因組中相應(yīng)IGR內(nèi)。此種質(zhì)粒載體可以還包含IGR序列的完整片段或部分片段，其中所述的IGR序列的完整片段或部分片段包含用于插入異源DNA序列和任選插入報道基因盒和/或選擇基因盒的克隆位點(diǎn)。兩個相鄰ORF的IGR-DNA序列以及IGR側(cè)翼序列優(yōu)選地分別選自IGR和ORF，所述的IGR和ORF以示例性方式或其相應(yīng)方式選自由(使用CDC/Acambis的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-10105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142和142-143所組成的組中。該序列更優(yōu)選地分別選自IGR和ORF，所述的IGR和ORF選自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122和132-133所組成的組中。在有效實施例中，選擇所述的IGR衍生性序列為071-072。所述DNA序列優(yōu)選地得自MVA的基因組或與其同源，其中所述的MVA以ATCC登錄號：PTA-5095在2003年3月27日保藏于美國弗吉尼亞州20110-2209，馬納薩斯，Blvd大學(xué)，10801，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。為產(chǎn)生本發(fā)明的質(zhì)粒載體，將所述序列分離并克隆至標(biāo)準(zhǔn)克隆載體，如pBluescript(Stratagene)，其中它們位于待插入MVA基因組的外源DNA的側(cè)翼。任選地，這種質(zhì)粒載體包含選擇基因盒或報告基因盒，其可以從最終重組病毒中因包含于所述表達(dá)盒內(nèi)的重復(fù)序列而被缺失。由質(zhì)粒載體導(dǎo)入外源DNA序列至MVA基因組的方法和獲得重組MVA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且還可以從1989年冷泉港實驗室出版社J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆實驗手冊》第二版(MolecularCloning,ALaboratoryManual,SecondEdition,,1，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)和JohnWileyandSonInc的《最新分子生物學(xué)實驗方法》第16章第IV部分“使用痘苗病毒載體在哺乳動物中表達(dá)蛋白質(zhì)”(CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSonInc.1998,Chapter16,sectionIV,"Expressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaviralvectors")中推導(dǎo)出來。本發(fā)明的MVA可以通過用本發(fā)明的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、用MVA感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并且隨后鑒定、分離和任選純化本發(fā)明的MVA而產(chǎn)生。本發(fā)明的DNA序列可以用來鑒定或分離本發(fā)明的MVA或其衍生物和用本發(fā)明的MVA感染的細(xì)胞或個體。所述DNA序列例如用來產(chǎn)生PCR-引物、雜交探針或用來陣列技術(shù)中。HIV及其復(fù)制獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體認(rèn)為是顯示慢病毒屬(lentivirus)典型特征的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其稱作人免疫缺陷病毒(HIV)。在圖1中顯示人慢病毒的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系。HIV-2比HIV-1與分離自野生白眉猴的病毒SIVsmm親緣關(guān)系更近。目前認(rèn)為HIV-2代表SIVsmm至人的動物性傳播。命名為SIV的來自圈養(yǎng)黑猩猩的一系列慢病毒分離株是HIV-1的密切遺傳近親。最早對HIV-1分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分析集中于源自歐洲/北美洲和非洲的樣品；從世界這兩個地區(qū)鑒定到獨(dú)立的病毒群。隨后鑒定到明顯不同的HIV-1遺傳亞型或進(jìn)化枝并將它們劃分成三個組：M(主要)；O(無關(guān)項)和N(非M或O)(圖2)。包含超過95％全部病毒分離株的HIV-1組M由基于完整病毒基因組序列的至少8個獨(dú)立進(jìn)化枝(A、B、C、D、F、G、H和J)組成。HIV-1組O的成員已經(jīng)從生活在喀麥隆、加蓬和赤道幾內(nèi)亞的個體中回收到；它們的基因組與組M病毒共有低于50％的核苷酸序列同一性。最近發(fā)現(xiàn)的組NHIV-1株已經(jīng)在感染的喀麥隆人中鑒定出來，不能在標(biāo)準(zhǔn)的完整病毒酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)中以血清學(xué)方式反應(yīng)，然而是輕易通過常規(guī)蛋白質(zhì)印跡分析法可檢測的。有關(guān)HIV-1遺傳性變異的最新知識源于研究地理來源各異的組M病毒。過去十年間收集的數(shù)據(jù)表明感染個體中存在的HIV-1群可以在核苷酸序列方面變異6％-10％。在一個進(jìn)化枝內(nèi)的HIV-1分離株可以在gag方面顯示15％核苷酸距離并且在gp120編碼序列方面顯示至多達(dá)30％的核苷酸距離。根據(jù)所分析的基因，進(jìn)化枝間遺傳性變異可以在30％與40％之間變化?？梢栽诜侵拚业紿IV-1組M的全部亞型。進(jìn)化枝A病毒具有最大的遺傳趨異性并且是在非洲早期流行中最常見的HIV-1亞型。隨著HIV-1在90年代中晚期迅速傳播至南部非洲，進(jìn)化枝C病毒已經(jīng)成為優(yōu)勢亞型并且現(xiàn)在占世界范圍HIV-1感染的48％。研究最充分的HIV-1亞型-進(jìn)化枝B病毒仍是歐洲和北美的最流行分離株。高遺傳重組率是逆轉(zhuǎn)錄病毒的標(biāo)志。最初認(rèn)為遺傳多樣性病毒株的同時感染不太可能在HIV-1風(fēng)險個體中建立。然而在1995年，顯而易見的是顯著比例的HIV-1組M全球多樣性包括進(jìn)化枝間病毒重組體?，F(xiàn)在認(rèn)為將會在地理地區(qū)如非洲、南美洲和東南亞找到HIV-1重組體，那里多種HIV-1亞型共存并且可以構(gòu)成超過10％的循環(huán)HIV-1株。從分子角度，這些重組病毒的基因組與相似拼圖嵌合體(patchworkmosaics)，具有并列的不同HIV-1亞型節(jié)段，這反映對產(chǎn)生所述拼圖嵌合體有貢獻(xiàn)的多個交叉事件。大部分HIV-1重組體源自非洲并且大多數(shù)含有最初得自進(jìn)化枝A病毒的節(jié)段。在泰國，例如，優(yōu)勢傳播株的組合體由進(jìn)化枝A的gag加pol基因節(jié)段和進(jìn)化枝E的env基因組成。因為在ThaiHIV-1株中的進(jìn)化枝Eenv基因與存在于源自中非共和國的病毒分離株中的進(jìn)化枝Eenv密切相關(guān)，故認(rèn)為原初重組事件在非洲發(fā)生，而后子代病毒進(jìn)入泰國。有趣地，迄今沒有報告全長HIV-1亞型E分離株(即具有亞型E的gag、pol和env基因)。發(fā)現(xiàn)α和β趨化因子受體作為病毒融合及進(jìn)入易感CD4+細(xì)胞的輔助受體(coreceptor)發(fā)揮作用，此發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致修改HIV-1分類方案(圖3)。現(xiàn)在，分離株可以基于在融合測定法中的趨化因子受體利用性進(jìn)行分組，在所述的融合測定法中HIV-1gp120和CD4+輔助受體蛋白在各自的細(xì)胞中表達(dá)。如圖3中所示，利用CXCR4受體的HIV-1分離株(現(xiàn)在命名為X4病毒)通常是T細(xì)胞系(TCL)嗜性合胞體誘導(dǎo)(Si)株，而排它性利用CCR5受體的那些HIV-1分離株(R5病毒)優(yōu)勢地具有巨噬細(xì)胞(M)嗜性和非合胞體誘導(dǎo)性(NSI)?？梢园ù蟛糠只颊叻蛛x株并且顯示連續(xù)嗜性表型的雙重嗜性R5/X4株常常是SI。如有復(fù)制能力的全部逆轉(zhuǎn)錄病毒那樣，均編碼結(jié)構(gòu)蛋白的3種主要HIV-1翻譯產(chǎn)物最初合成為多聚蛋白前體，該多聚蛋白前體隨后由病毒蛋白酶或細(xì)胞蛋白酶加工為成熟顆粒結(jié)合的蛋白質(zhì)(圖4)。55kdGag前體Pr55Gag被切割成基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)、核衣殼蛋白(NC)和p6蛋白。160kdGag-Pol多聚蛋白Pr160Gag-Pol的自催化作用產(chǎn)生蛋白酶(PR)、異二聚體逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)蛋白，其中細(xì)胞酶的蛋白酶水解消化作用將糖基化160kdEnv前體gp160轉(zhuǎn)化成gp120表面(SU)切割產(chǎn)物和gp41跨膜(TM)切割產(chǎn)物。HIV-1編碼的剩余6個蛋白質(zhì)(Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu和Nef)是剪接mRNA的初級翻譯產(chǎn)物。Gag如同其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的那些Gag蛋白，HIV的Gag蛋白對于形成非感染性病毒樣顆粒是必需且充分的。逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白通常合成為多聚蛋白前體；HIV-1的Gag前體已經(jīng)基于其表觀分子量進(jìn)行命名Pr55Gag。如前指出，Pr55Gag的mRNA是非剪接的9.2kb轉(zhuǎn)錄物(圖4)，其中所述的轉(zhuǎn)錄物在胞漿內(nèi)的表達(dá)需要Rev。當(dāng)polORF存在時，病毒蛋白酶(PR)在從細(xì)胞出芽期間或在其之后馬上切割Pr55Gag以產(chǎn)生成熟Gag蛋白p17(MA)、p24(CA)、p7(NC)和p6(見圖4)。在病毒粒子中，MA緊鄰病毒包膜的脂質(zhì)雙層內(nèi)部存在，CA在該顆粒的中心形成錐形核心結(jié)構(gòu)的外表部分，并且NC在所述核心內(nèi)具有病毒RNA基因組的核糖核蛋白復(fù)合體中存在(圖5)。HIVPr55Gag前體在翻譯后發(fā)生寡聚化并定向至胞漿膜，在胞漿膜處通過EM可見的尺寸和密度足夠大的顆粒裝配。Pr55Gag形成病毒樣顆粒是一個自裝配過程，而關(guān)鍵性Gag-Gag相互作用在沿Gag前體的多個結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生。病毒樣顆粒的裝配不要求基因組RNA(盡管核酸的存在似乎是必需的)、pol編碼的酶或Env糖蛋白參與，不過感染性病毒粒子的產(chǎn)生要求病毒RNA基因組包入衣殼以及并入Env糖蛋白和Gag-Pol多聚蛋白前體Pr160Gag-Pol。Polgag的下游存在HIV基因組的最高度保守區(qū)域pol基因，該基因編碼3種酶：PR、RT和IN(見圖4)。病毒RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA拷貝和病毒DNA整合至宿主細(xì)胞染色體分別需要RT和IN。PR通過介導(dǎo)成熟感染性病毒粒子產(chǎn)生而在生活周期晚期發(fā)揮重要作用。pol基因產(chǎn)物通過稱作Pr160Gag-Pol的160kdGag-Pol融合蛋白的酶切割作用而衍生。這種融合蛋白通過Pr55Gag翻譯期間的核糖體移碼作用產(chǎn)生(見圖4)。用于Gag-Pol表達(dá)的核糖體移碼機(jī)制也為眾多其它逆轉(zhuǎn)錄病毒所利用，該機(jī)制確保pol衍生性蛋白質(zhì)以低水平表達(dá)，大約是Gag水平的5％-10％。與Pr55Gag相似，Pr160Gag-Pol的氨基端經(jīng)肉豆蔻?；⒍ㄏ蛑涟麧{膜。蛋白酶用禽逆轉(zhuǎn)錄病毒開展的早期脈沖追蹤研究清楚表明逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白最初作為多聚蛋白前體合成，所述的多聚蛋白前體被切割成更小產(chǎn)物。后續(xù)研究證實加工功能由病毒蛋白酶而非細(xì)胞蛋白酶內(nèi)提供，并且Gag和Gag-Pol前體的蛋白酶水解消化對于病毒感染性是必需的。逆轉(zhuǎn)錄病毒PRD序列分析表明它們與細(xì)胞“天冬氨酸”蛋白酶(如胃蛋白酶及腎素)相關(guān)。與@相似這些細(xì)胞酶，逆轉(zhuǎn)錄病毒PR使用在活性部位處兩個靠近的Asp殘基來調(diào)整催化靶蛋白中肽鍵水解的水分子。與作為假二聚體(利用同一分子內(nèi)的兩個折疊來產(chǎn)生所述活性部位)發(fā)揮功能的細(xì)胞天冬氨酸蛋白酶不同，逆轉(zhuǎn)錄病毒PR作為真實二聚體發(fā)揮作用。來自HIV-1PR的X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)表明兩個單體部分地由一個四鏈反平行β折疊固定在一起，其中所述的β折疊從每個單體的氨基端和羧基端衍生。底物-結(jié)合位點(diǎn)位于所述兩個單體之間形成的裂隙內(nèi)。與@相似其細(xì)胞性同系物，HIVPR二聚體含有在所述結(jié)合位點(diǎn)上方懸垂并且可以穩(wěn)定裂隙內(nèi)底物的柔性“蓋板”；活性部位的Asp殘基位于所述二聚體的中央。有趣地，盡管在活性部位殘基周圍觀察到一些有限的氨基酸同源性，然而逆轉(zhuǎn)錄病毒PR的一級序列是高度趨異的，不過它們它們的結(jié)構(gòu)是非常相似的。逆轉(zhuǎn)錄酶就定義而言，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有在感染過程早期將其單鏈RNA基因組轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA的能力。催化這種反應(yīng)的酶是RT，連同其相關(guān)的RNA酶H活性。逆轉(zhuǎn)錄病毒RT具有三種酶活性：(a)RNA指導(dǎo)的DNA聚合(用于負(fù)鏈DNA合成)、(b)RNA酶H活性(用于降解DNA-RNA雜合中間體中存在的tRNA引物和基因組RNA)和(c)DNA指導(dǎo)的DNA聚合作用(用于第二鏈或正鏈DNA合成)。成熟HIV-1RT全酶是66kd和51kd亞基的異二聚體。51kd亞基(p51)通過PR以蛋白酶水解方式移去p66羧基端15kdRNA酶H結(jié)構(gòu)域而從66kd(p66)亞基中衍生(見圖4)。HIV-1RT的晶體結(jié)構(gòu)揭示一個高度不對稱性折疊，其中p66亞基和p51亞基的方向明顯不同。p66亞基可以視為一只右手，聚合酶活性部位位于手掌內(nèi)并且由手掌、手指和拇指亞結(jié)構(gòu)域形成結(jié)合模板的深裂隙。這個聚合酶結(jié)構(gòu)域由連接亞結(jié)構(gòu)域與RNA酶H連接。位于手掌內(nèi)部的活性部位含有緊密接近的3個關(guān)鍵Asp殘基(第110、185和186位)和兩個配位Mg2+離子。突變這些Asp殘基則取消RT的聚合活性。三個活性部位Asp殘基的方向與其它DNA聚合酶(例如大腸桿菌DNApolI的Klenow片段)中觀察到的活性部位Asp殘基的方向相似。p51亞基似乎是剛性的并且不形成聚合化裂隙(apolymerizingcleft)；該亞基第110、185和186位Asp埋入分子內(nèi)部。大約18個堿基對的引物-模板雙鏈體位于從該聚合酶活性部位伸展至RNA酶H結(jié)構(gòu)域的核酸結(jié)合裂隙內(nèi)。在RT-引物-模板-dNTP結(jié)構(gòu)中，雙脫氧核苷酸在引物3'末端處的存在促使恰好在攻擊正在進(jìn)入的dNTP之前所捕獲的催化性復(fù)合體可視化。與先前所得結(jié)構(gòu)的比較提出這樣的模型，其中手指握緊以便在引物3'-OH親核攻擊正在進(jìn)入的dNTP之前捕獲模板和dNTP。在添加正在進(jìn)入的dNTP至正在生長的鏈后，已經(jīng)提出所述手指采取更開放的構(gòu)象，因而釋放焦磷酸并使RT結(jié)合下一個dNTP。HIV-1RNA酶H的結(jié)構(gòu)也已經(jīng)通過射線晶體分析法測定；該結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)與大腸桿菌RNA酶H相似的整體折疊。整合酶逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的區(qū)別性特征是逆轉(zhuǎn)錄后該病毒基因組的DNA拷貝插入宿主細(xì)胞染色體。整合的病毒DNA(前病毒)充當(dāng)合成病毒RNA的模板并且作為該宿主細(xì)胞基因組的一部分維持持續(xù)感染細(xì)胞終身。整合能力缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒突變體通常不能建立生產(chǎn)性感染。病毒DNA的整合由整合酶催化，其中所述的整合酶是通過PR介導(dǎo)的HIV-1Gag-Pol多聚蛋白羧基端部分切割作用而產(chǎn)生的32kd蛋白質(zhì)(見圖4)。逆轉(zhuǎn)錄病毒IN蛋白質(zhì)由三個結(jié)構(gòu)和功能迥異的結(jié)構(gòu)域：組成氨基端、含鋅指結(jié)構(gòu)域、核心結(jié)構(gòu)域以及一個相對不保守的羧基端結(jié)構(gòu)域組成。因為其低溶解度，仍不可能使完整288個氨基酸的HIV-1IN蛋白質(zhì)結(jié)晶。然而，全部三種結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)分別由X射線晶體分析法或NMR法解析。也已經(jīng)測定禽肉瘤病毒IN的核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。通過核磁共振分光術(shù)解析其結(jié)構(gòu)的氨基端結(jié)構(gòu)域(第1-55位殘基)由含有鋅的4個螺旋組成，其中所述的鋅與氨基酸His-12、His-16、Cys-40和Cys-43配位。氨基端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與含有所謂螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序的螺旋DNA結(jié)合蛋白相似；然而，在HIV-1結(jié)構(gòu)中，該基序?qū)Χ垠w形成有貢獻(xiàn)。最初，不良溶解度阻礙核心結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的解析工作。然而當(dāng)觀察到在IN第185位殘基處將Phe改變成Lys會明顯提高溶解度而不破壞體外催化活性時，晶體學(xué)工作獲得成功。HIV-1IN核心結(jié)構(gòu)域(IN第50-212位殘基)的每個單體由側(cè)面有螺旋的一個五鏈β折疊組成；此結(jié)構(gòu)與其它多核苷?；D(zhuǎn)移酶(包括RNA酶H和噬菌體MuA轉(zhuǎn)座酶)具有令人震驚的相似性。在其它多核苷?；D(zhuǎn)移酶中的類似位置內(nèi)存在三個高度保守的殘基；在HIV-1IN中，這些殘基是Asp-64、Asp-116和Glu-152，即所謂D,D-35-E基序。在這些位置處的突變阻斷HIVIN體內(nèi)和體外功能。這三個氨基酸在禽肉瘤病毒核心結(jié)構(gòu)域及HIV-1核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)中的密切接近支持如下假設(shè)：這些殘基在催化作為整合過程核心的多核苷酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已經(jīng)通過NMR法解析其結(jié)構(gòu)的羧基端結(jié)構(gòu)域采用使人想起Src同源性3(SH3)結(jié)構(gòu)域的五鏈β桶折疊拓?fù)鋵W(xué)。最近，已經(jīng)解析了包含核心結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域的SIVIN蛋白片段和羅氏肉瘤病毒IN蛋白質(zhì)片段的X射線結(jié)構(gòu)。EnvHIVEnv糖蛋白在病毒生活周期中發(fā)揮重要作用。它們含有與CD4受體和輔助受體相互作用的決定簇，并且它們催化病毒包膜的脂質(zhì)雙層蛋與宿主細(xì)胞胞漿膜之間的融合反應(yīng)。此外，HIVEnv糖蛋白含有激發(fā)從診斷開發(fā)與疫苗開發(fā)角度看均重要的免疫應(yīng)答的表位。HIVEnv糖蛋白從單一剪接的4.3kbVpu/Env雙順反子mRNA中合成(見圖4)；翻譯在結(jié)合于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的核糖體中發(fā)生。160kd多聚蛋白前體(gp160)是通過在結(jié)構(gòu)域中的疏水性轉(zhuǎn)移終止信號而錨定至細(xì)胞膜內(nèi)的整合型膜蛋白，其中所述的結(jié)構(gòu)域必定成為成熟TMEnv糖蛋白gp41(圖6)。gp160在ER中以共翻譯方式糖基化，形成二硫鍵并且發(fā)生寡聚化。優(yōu)勢的寡聚化形式似乎是三聚體，盡管也觀察到二聚體和四聚體。gp160運(yùn)輸至高爾基體，在此處如同其它逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白前體蛋白那樣，它被細(xì)胞酶以蛋白酶水解方式切割為成熟SU糖蛋白gp120和TM糖蛋白gp41(見圖6)。負(fù)責(zé)按照高度保守Lys/Arg-X-Lys/Arg-Arg基序切割逆轉(zhuǎn)錄病毒Env前體的細(xì)胞酶是弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶，盡管其它酶也可以催化gp160加工。gp160的切割為Env誘導(dǎo)的融合活性和病毒感染性所需。切割gp160之后，gp120和gp41形成對于Env從高爾基體運(yùn)輸至細(xì)胞表面至關(guān)重要的非共價聯(lián)合。gp120-gp41的相互作用相當(dāng)微弱，并且從表達(dá)Env的細(xì)胞的表面散落大量gp120。HIVEnv糖蛋白復(fù)合體，尤其SU(gp120)結(jié)構(gòu)域，是極度糖基化的；gp160的大約一半分子量由寡糖側(cè)鏈組成。Env從ER中的合成部位運(yùn)輸至胞漿膜期間，眾多側(cè)鏈因復(fù)雜糖的添加被修飾。眾多寡糖側(cè)鏈形成可以想像為遮蔽大量gp120而免遭宿主免疫系統(tǒng)識別的糖云。如圖6中所示，gp120含有交錯的保守(C1-C5)和可變(V1-V5)結(jié)構(gòu)域。存在于不同分離株的gp120中的Cys殘基是高度保守的并且形成連接巨大環(huán)袢中的前四個可變區(qū)的二硫鍵。病毒Env糖蛋白的主要功能是促進(jìn)病毒包膜的脂質(zhì)雙層與宿主細(xì)胞膜之間的膜融合反應(yīng)。這種膜融合事件能使病毒核心進(jìn)入宿主細(xì)胞胞漿。gp120和gp41的眾多區(qū)域在Env介導(dǎo)的膜融合中具有直接或間接意義。對正粘病毒HA2血凝素蛋白與副粘病毒F蛋白的研究表明這些蛋白質(zhì)氨基端處的稱作融合肽的高度疏水性結(jié)構(gòu)域在膜融合中發(fā)揮至關(guān)重要作用。突變分析表明類似結(jié)構(gòu)域處于HIV-1、HIV-2和SIV的TM糖蛋白的氨基端(見圖6)。在gp41的這個區(qū)域內(nèi)的非疏水性置換明顯降低或阻斷合胞體形成并且導(dǎo)致產(chǎn)生非感染性子代病毒粒子。gp41融合肽的羧基端是在膜融合中發(fā)揮核心作用的兩個兩性螺旋結(jié)構(gòu)域(見圖6)。在含有拉鏈樣七肽重復(fù)基序的氨基端螺旋(稱作N-螺旋)中突變則破壞感染性和膜融合活性，并且從這些序列中衍生的肽在培養(yǎng)物中顯示強(qiáng)烈抗病毒活性。近年來兩個螺旋基序HN-1和SIVgp41的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)分析的焦點(diǎn)。通過X射線晶體分析法或核磁共振分光術(shù)對含有所述螺旋結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、從N-螺旋和C-螺旋衍生的肽的混合物或在SIV結(jié)構(gòu)的情況下來自第27-149位殘基的完整gp41胞外結(jié)構(gòu)域序列測定結(jié)構(gòu)。這些研究獲得基本上相似的三聚體結(jié)構(gòu)，其中所述螺旋結(jié)構(gòu)域以反平行方式疊壓以產(chǎn)生一個6-螺旋束。所述的N-螺旋在其中央形成一個卷曲螺旋，所述C-螺旋疊壓至外側(cè)表上面的疏水槽內(nèi)。在導(dǎo)致膜融合的步驟中，CD4結(jié)合誘導(dǎo)在Env中促進(jìn)輔助受體結(jié)合的構(gòu)象變化。在形成三重gp120/CD4/輔助受體復(fù)合體后，gp41采取允許所述融合肽插入目的脂質(zhì)雙層的假設(shè)性構(gòu)象。形成gp41的6-螺旋束(這涉及gp41的N-螺旋與C-螺旋之間的反平行相互作用)引起病毒膜和細(xì)胞膜靠近并且膜融合發(fā)生。重組MVA病毒增強(qiáng)CD+8細(xì)胞免疫應(yīng)答的用途本發(fā)明涉及生成針對抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答并且還涉及激發(fā)抗體應(yīng)答。更具體地，本發(fā)明涉及“引起和增強(qiáng)”免疫接種方案，其中通過施用引發(fā)性組合物(primingcomposition)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答因施用增強(qiáng)性組合物(boostingcomposition)而增強(qiáng)。本發(fā)明以這樣的既往實驗論證為基礎(chǔ)，即可以在用任意多種不同類型的包含重組MVA本身的引發(fā)性組合物引發(fā)后，通過使用修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)載體實現(xiàn)有效的增強(qiáng)。針對眾多病原體的免疫應(yīng)答的主要保護(hù)性組分由CD8+型T淋巴細(xì)胞(又稱作細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL))介導(dǎo)。CD8+細(xì)胞的重要功能是分泌γ干擾素(IFNγ)，并且這提供了CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的一種手段。免疫應(yīng)答的第二組分是針對該病原體的蛋白質(zhì)的抗體。本發(fā)明采用這樣的MVA，其中如既往實驗所證實，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述MVA是用于針對CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答提供增強(qiáng)作用并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的有效工具，其中使用任意多種不同類型的引發(fā)性組合物引發(fā)所述的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。值得注意的是，既往實驗工作證實使用本發(fā)明的先驅(qū)物(predecessor)為表達(dá)旨在增強(qiáng)由DNA疫苗引發(fā)的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的HIV抗原并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的重組MVA病毒創(chuàng)造條件?？梢园l(fā)現(xiàn)該MVA在免疫接種后誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。也可以證實重組MVA引發(fā)這樣的免疫應(yīng)答，其因一次或多次接種重組MVA而增強(qiáng)。有效地保護(hù)用質(zhì)粒DNA免疫并用所述MVA增強(qiáng)的非人靈長類免受用活病毒作粘膜內(nèi)攻擊的影響(Amara等20015科學(xué)(Science)292:69-74)。有利地，本發(fā)明人構(gòu)思可以采用這樣的免疫方案，該免疫方案使用真皮內(nèi)、肌內(nèi)或粘膜免疫接種以引發(fā)并增強(qiáng)，從而構(gòu)成例如在人類中適用于誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的通用免疫接種方案。本發(fā)明在多個方面和實施方案中使用編碼HIV抗原并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的MVA載體，其中所述的HIV抗原用于增強(qiáng)通過事先施用編碼該抗原的核酸所引發(fā)的針對該抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的一般方面提供MVA載體用于增強(qiáng)針對HIV抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的用途。本發(fā)明的一個方面提供在個體中增強(qiáng)針對HIV抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的方法，該方法包括在所述個體中提供包含編碼所述抗原的核酸的MVA載體，其中所述的核酸與調(diào)節(jié)序列有效連接以在該個體中通過來自所述核酸的表達(dá)而產(chǎn)生所述抗原，因而該個體中事先引發(fā)的針對該抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答被增強(qiáng)。針對HIV抗原的免疫應(yīng)答可以通過用DNA免疫接種或通過用感染性生物感染加以引發(fā)。本發(fā)明的又一方面提供在個體中誘導(dǎo)針對HIV抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的方法，該方法包括對所述個體施用包含編所述抗原的核酸的引發(fā)性組合物并且隨后施用包含MVA載體的增強(qiáng)性組合物，所述的MVA載體包括編碼所述抗原的核酸，所述的核酸與調(diào)節(jié)序列有效連接以在該個體中通過來自所述核酸的表達(dá)而產(chǎn)生抗原。如所披露，本發(fā)明的又一方面提供MVA載體的用途，用于制造施用至哺乳動物以增強(qiáng)針對HIV抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答并且也激發(fā)抗體應(yīng)答的藥物。此類藥物一般在先期施用包含編碼所述抗原的核酸的引發(fā)性組合物后施用。所述引發(fā)性組合物可以包含編碼所述抗原的DNA，這種DNA優(yōu)選地處于不能在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒形式。任何選擇標(biāo)記應(yīng)當(dāng)不是針對臨床使用的任何抗生素的抗性，例如卡那霉素抗性優(yōu)先于氨卞青霉素抗性?？乖砦贿_(dá)應(yīng)當(dāng)由哺乳動物細(xì)胞中有活性的啟動子(例如細(xì)胞巨化病毒立即早期(CMVIE)啟動子)驅(qū)動。在本發(fā)明各種方面的具體實施方案中，施用引發(fā)性組合物，隨后用增強(qiáng)性組合物或第一或第二增強(qiáng)性組合物增強(qiáng)，所述的第一和第二增強(qiáng)性組合物是彼此相同或不同的。其它增強(qiáng)性組合物仍可以使用而不脫離本發(fā)明。在一個實施方案中，三重免疫接種方案使用DNA，隨后使用腺病毒作為第一增強(qiáng)性組合物，隨后使用MVA作為第二增強(qiáng)性組合物，任選地隨后使用又一種(第三)增強(qiáng)性組合物或隨后增強(qiáng)性地施用一種或其它或兩種相同或不同載體。另一個選項是DNA，隨后是MVA，隨后是腺病毒，任選地隨后增強(qiáng)性地施用一種或其它或兩種相同或不同載體。在相應(yīng)引發(fā)性組合物和增強(qiáng)性組合物(不若使用多種增強(qiáng)性組合物)中待編碼的抗原不需要是完全相同的，不過應(yīng)當(dāng)共有至少一個CD8+T細(xì)胞表位。所述抗原可以對應(yīng)于完整抗原或其片段?？梢允褂秒谋砦换蛉斯こ纱砦唬瑥亩行У厍谐d體中抗原序列或編碼序列內(nèi)不需要的蛋白質(zhì)序列?？梢园ㄒ粋€或多個額外表位，例如由T輔助細(xì)胞識別的表位，尤其在HLA類型不同的個體中所識別的表位。由重組MVA病毒待編碼的本發(fā)明HIV抗原包括具有免疫原活性的多肽，其中所述的免疫原活性由HIVEnv、Gag、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu或Nef氨基酸序列中作為至少一個T細(xì)胞表位的氨基酸序列激發(fā)。這種氨基酸序列基本上對應(yīng)于已知HIVEnv或Pol中10-900個氨基酸的至少一個片段和/或共有序列；或已知HIVGag中10-450個氨基酸的至少一個片段和/或共有序列；或已知Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu或Nef中10-100個氨基酸的至少一個片段和/或共有序列。雖然提出全長Env前體序列用于本發(fā)明中，不過Env任選地缺失亞序列，例如，可以缺失gp120表面區(qū)和gp41跨膜切割產(chǎn)物區(qū)。雖然提出全長Gag前體序列用于本發(fā)明中，不過Gag任選地缺失亞序列，例如，可以缺失基質(zhì)蛋白(p17)區(qū)、衣殼蛋白(p24)區(qū)、核衣殼蛋白(p7)區(qū)和p6區(qū)(Gag多聚蛋白的羧基端肽)。雖然提出全長Pol前體序列用于本發(fā)明中，不過Pol任選地缺失亞序列，例如，可以缺失蛋白酶蛋白(p10)區(qū)、逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白p66/p51)區(qū)和整合酶蛋白(p32)區(qū)。這種HIVEnv、Gag或Pol可以與已知Env、Gag或Pol蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少50％的整體同一性，如50-99％同一性或其間的任何范圍或值，同時激發(fā)針對至少一株HIV的免疫原性應(yīng)答。同一性百分?jǐn)?shù)可以例如通過使用從威斯康辛大學(xué)遺傳計算機(jī)組(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWGCG))可獲得的GAP計算機(jī)程序6.0版本比較序列信息而確定。GAP程序使用Needleman和Wunsch比對方法(分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)197048:443)，后者由Smith和Waterman改進(jìn)(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(AdvApplMath)19812:482)。簡而言之，GAP程序?qū)⑼恍远x為完全相同的所比對符號(即核苷酸或氨基酸)數(shù)目除以兩個序列中較短者中符號的總數(shù)。GAP程序的優(yōu)選默認(rèn)參數(shù)包括：(1)單一比較矩陣(unitarycomparisonmatrix)(含有用于同一性的值1和用于同一性的值0)和Gribskov和Burgess加權(quán)比較矩陣(核酸研究(NuclAcidsRes)198614:6745)，如Schwartz和Dayhoff所述(編者，1979年華盛頓特區(qū)國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會《Atlas蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)》第353-358頁(AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.1979,pp.353-358)；(2)每個空位的罰分3.0和對每個空位中每個符號的額外罰分0.10；和(3)對每個空位無罰分。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Env是至少一種HIV包膜蛋白的變異形式。優(yōu)選地，該Env由gp120以及gp41跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域組成，不過缺少gp41的部分或全部胞漿結(jié)構(gòu)域。已知的HIV序列輕易地可從商業(yè)性或機(jī)構(gòu)HIV序列數(shù)據(jù)庫如基因庫(GENBANK)或可作為出版的匯編物如新墨西哥州洛斯阿拉莫斯理論生物學(xué)和生物物理學(xué)出版社Myers等1993年編輯《人逆轉(zhuǎn)錄病毒和AIDS，核酸與氨基酸序列的匯編與分析》第I和II卷(HumanRetrovirusesandAIDS,ACompilationandAnalysisofNucleicAcidandAminoAcidSequences,Vol.IandII,TheoreticalBiologyandBiophysics,LosAlamos,N.Mex.)或在互聯(lián)網(wǎng)上hiv-web.lanl.gov/處獲得。置換或插入HIVEnv、Gag或Pol以獲得由本發(fā)明重組MVA病毒中所用核酸編碼的額外HIVEnv、Gag或Pol可以包括置換或插入至少一個氨基酸殘基(例如1-25個氨基酸)?；蛘?，可以從HIVEnv、Gag或Pol序列中缺失至少一個氨基酸(例如1-25個氨基酸)。優(yōu)選地，基于安全性特征、表達(dá)水平、免疫原性和與MVA高復(fù)制速率的匹配性，鑒定此類置換、插入或缺失。在本發(fā)明HIVEnv、Gag或Pol中的氨基酸序列變異可以例如通過在DNA中突變加以制備。此類HIVEnv、Gag或Pol包含例如編碼所述氨基酸序列中不同氨基酸的核苷酸的缺失、插入或置換。顯然，在編碼HIVEnv、Gag或Pol的核酸中將產(chǎn)生的突變不應(yīng)使該序列對開放閱讀框錯位并優(yōu)選地將不產(chǎn)生可能產(chǎn)生mRNA二級結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性結(jié)構(gòu)域?；诒疚闹谐尸F(xiàn)的教授內(nèi)容和指導(dǎo)，也可以通過這樣的方式制備本發(fā)明編碼HIVEnv、Gag或Pol的核酸，即通過擴(kuò)增或位點(diǎn)定向誘變在編碼HIVEnv、Gag或Pol的DNA或RNA中的核苷酸，并且此后合成或逆轉(zhuǎn)錄所述編碼性DNA以產(chǎn)生編碼HIVEnv、Gag或Pol的DNA或RNA。本發(fā)明表達(dá)HIVEnv、Gag或Pol的重組MVA病毒包括有限套數(shù)的HIVEnv、Gag或Pol-編碼性序列作為這樣的置換核苷酸，其可以基于本文中呈現(xiàn)的教授內(nèi)容和指導(dǎo)，由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員例行地獲得，無需過多實驗。對于蛋白質(zhì)化學(xué)與結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述，參見Schulz,G.E.等,1978《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理》(PrinciplescfProteinStructure),Springer-Verlag,NewYork,N.Y.和Creighton,T.E.,1983《蛋白質(zhì):結(jié)構(gòu)與分子特點(diǎn)》(Proteins:StructureandMolecularProperties),W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,CA。對于核苷酸序列置換如密碼子偏好性的描述，參見1994年紐約州紐約Greene出版協(xié)會Ausubel等編輯《最新分子生物學(xué)實驗方法》§§A.l.l-A.1.24(CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.,NewYork,NY1994at§§A.l.l-A.1.24)和1989年冷泉港實驗室出版社Sambrook,J.等《分子克隆實驗手冊》第二版附錄C和D(MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.atAppendicesCandD)。因此，給定本文中呈現(xiàn)的教授內(nèi)容和指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會知道如何置換在HIVEnv、Gag或PolDNA或RNA的其它位置中的其它氨基酸殘基以獲得另外的HIVEnv、Gag或Pol，包括置換性、缺失性或插入性變體。在MVA載體中，用于表達(dá)編碼抗原的調(diào)節(jié)序列將包括啟動子?！皢幼印币庵高@樣的核苷酸序列，從其中可以啟動在下游有效連接的DNA轉(zhuǎn)錄(即在雙鏈DNA的有義鏈以3'方向)。“有效連接的”意指作為相同核酸分子的部分聯(lián)合，其中所述的部分處在從該啟動子中啟動的轉(zhuǎn)錄的適合位置和方向上。與啟動子有效連接的DNA處于該啟動子的“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)作用”下。按照需要，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識和習(xí)慣，可以包括其它調(diào)節(jié)序列，這包括終止子片段、聚腺苷酸化序列、標(biāo)記基因和其它序列：參見例如D.M.Knipe和P.M.Howley編輯《費(fèi)氏病毒學(xué)》第2849-2883頁Moss.B(2001).痘病毒科：病毒及其復(fù)制(Moss,B.(2001).Poxviridae:thevirusesandtheirreplication.InFieldsVirology,D.M.Knipe,andP.M.Howley,eds.(Philadelphia,LippincottWilliams&Wilkins),pp.2849-2883)。用于操作核酸的眾多技術(shù)，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測序、導(dǎo)入DNA至細(xì)胞和基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)分析在1998年JohnWiley&Sons出版社Ausubel等編輯《最新分子生物學(xué)實驗方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology,1998Ausubeletal.eds.,JohnWiley&Sons)中詳細(xì)描述。本發(fā)明的方面和實施方案中所用的啟動子可以兼容于痘病毒表達(dá)系統(tǒng)并且包括天然序列、修飾序列及合成性序列。所述引發(fā)性組合物和增強(qiáng)性組合物兩者之一或這兩者可以包含輔藥，如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或其編碼核酸。增強(qiáng)性組合物的施用通常在施用引發(fā)性組合物后約1-6個月，優(yōu)選地約1-3個月。優(yōu)選地，引發(fā)性組合物、增強(qiáng)性組合物或引發(fā)性組合物與增強(qiáng)性組合物的施用是真皮內(nèi)、肌內(nèi)或粘膜免疫接種。MVA疫苗的施用可以通過使用針頭注射該病毒的混懸劑而實現(xiàn)?？蛇x項是使用無針頭注射裝置來施用病毒混懸劑(使用例如BiojectorTM無針頭注射器)或含有該疫苗的重懸凍干粉劑，前提是制造出無需冷藏的分別制備的藥劑。這將極有利于非洲農(nóng)村地區(qū)所需要的疫苗。MVA是在人免疫接種中具有優(yōu)異安全記錄的病毒。可以簡單地完成重組病毒的產(chǎn)生，并且它們可以重復(fù)地大量制造。重組MVA病毒的真皮內(nèi)、肌內(nèi)或粘膜施用因此極適用于人抗AIDS的預(yù)防性或治療性免疫接種，其中所述的AIDS可以受CD8+T細(xì)胞應(yīng)答控制。個體可以患有AIDS，從而抗原送遞和產(chǎn)生針對該抗原的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答是有益的或具有治療有益效果。最有可能地，施用將具有預(yù)防性目的以在感染或癥狀發(fā)展之前產(chǎn)生針對HIV或AIDS的免疫應(yīng)答。本發(fā)明待施用的組分可以配制在藥物組合物中。這些組合物可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它材料。此類材料應(yīng)當(dāng)無毒并且不應(yīng)當(dāng)干擾該活性成分的效力。所述載體或其它材料的確切性質(zhì)可能依賴于施用途徑，例如靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、經(jīng)鼻、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑。如所指出，施用優(yōu)選地是真皮內(nèi)、肌內(nèi)或粘膜施用?？梢园睇}溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對于靜脈內(nèi)、皮膚、皮下、肌內(nèi)或粘膜注射或在臨近部位注射，所述活性成分將處在胃腸道外可接受的水溶液形式中，其中所述的水溶液劑無熱原并具有合適pH、等張性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠制備合適的溶液劑，使用等張性載體如氯化鈉注射液、林格(Ringer)注射液、乳酸鈉林格注射液(LactatedRinger'sInjection)。可以根據(jù)需要包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加物?？梢允褂镁忈屩苿?。在產(chǎn)生MVA顆粒并將此類顆粒任選地配制成組合物后，可以施用所述顆粒至個體，尤其人或其它靈長類?？梢允┯弥亮硪环N哺乳動物，例如嚙齒類如小鼠、大鼠或倉鼠、豚鼠、兔、綿羊、山羊、豬、馬、奶牛、猴、犬或貓。施用優(yōu)選地以“預(yù)防有效量”或“治療有效量”(如情況即為此，盡管預(yù)防可以視為治療)進(jìn)行，所述的量足以顯示出有益于此個體。實際施用量和施用的速率和時間-過程將取決于正在治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的處方(例如劑量決定等)屬于全科醫(yī)師和其它醫(yī)生或在獸醫(yī)環(huán)境中獸醫(yī)師的職責(zé)范圍，并且一般考慮待治療疾病、單個患者的體況、送遞部位、施用方法和執(zhí)業(yè)醫(yī)生已知的其它因素。上文所提及技術(shù)和方法的實例可以在1980年Osol，A.編輯的《雷明頓藥物科學(xué)第十六版》(Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,1980,Osol,A.(ed.))中找到。在一個優(yōu)選方案中，DNA以300μg-3mg/注射的劑量施用，隨后在106-109個感染性病毒顆粒/注射的劑量上施用MVA。組合物可以單獨(dú)地或與其它療法組合同時或依次地施用，這取決于待治療的疾病。送遞至非人哺乳動物無需出于治療目的，不過可以用在實驗環(huán)境下，例如在研究針對目的抗原的免疫機(jī)制中，例如針對HIV或AIDS的保護(hù)作用。穿梭質(zhì)粒、重組MVA/HIV1臨床疫苗構(gòu)建體和在重組MVA中通過外來基因的密碼子改變和在兩個痘苗病毒必需基因間插入此外來基因而保留完整該外來基因的機(jī)制本發(fā)明提供以下機(jī)制：·通過將完整外來基因插入MVA復(fù)制所必需的兩個痘苗病毒基因之間而保留所述完整外來基因。外來基因的缺失可以提供為重組MVA提供明顯生長優(yōu)勢，從而使這種重組MVA在反復(fù)傳代時與含有所述完整外來基因的MVA競爭。然而，外來基因的大部分缺失包括丟失痘苗病毒側(cè)翼DNA的一些部分。若這種痘苗病毒DNA是必需的，則帶缺失的那些病毒將不復(fù)制并且不與含有所述完整外來基因的MVA競爭。本方法學(xué)將用于產(chǎn)生必須進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增如用于臨床試驗的重組痘苗病毒，和·通過改變特定“熱點(diǎn)”而穩(wěn)定外來基因插入物，否則其中所述的熱點(diǎn)在重組病毒反復(fù)傳代后輕易地發(fā)生突變。本方法學(xué)將用于產(chǎn)生必須進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增如用于臨床試驗的重組痘苗病毒。并且描述:穿梭質(zhì)粒pLW-73，其用于將外來基因插入2個痘苗病毒必需基因之間；和重組MVA/HIV-1臨床疫苗構(gòu)建體MVA/UGD4d，它是體現(xiàn)這兩種機(jī)制用途的材料。用于生成穩(wěn)定重組MVA病毒的新方法本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生表達(dá)來自不同地理區(qū)域HIV-1分離株中的env和gagpol基因的修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)重組體。外來基因插入2個位點(diǎn)即MVA的缺失II和缺失III。證明在組織培養(yǎng)中對重組MVA反復(fù)傳代后這些基因的穩(wěn)定性是可變的。本發(fā)明人證實這種不穩(wěn)定性是因完整外來基因或一些側(cè)翼性DNA的缺失或特定點(diǎn)突變所致，其中所述的缺失或點(diǎn)突變導(dǎo)致子代病毒粒子增殖，其中所述的子代病毒粒子因不表達(dá)外來基因而具有生長優(yōu)勢。因此，本發(fā)明人描述了產(chǎn)生保留完整外來基因的重組MVA的兩種新方法。首先，本發(fā)明人構(gòu)建了指導(dǎo)外來基因在痘苗病毒基因組的保守中央?yún)^(qū)域中插入痘苗病毒的兩個必需基因之間的轉(zhuǎn)移載體。使用該位點(diǎn)插入基因則阻止含有大規(guī)模缺失的變體過度生長，其中所述的大規(guī)模缺失包含痘苗病毒必需DNA。此外，這種質(zhì)?？梢杂糜诓迦腩~外基因至重組病毒內(nèi)。其次，就點(diǎn)突變方面對分離株的分析揭示了具有單個堿基插入或缺失傾向性的某些“熱點(diǎn)”，其中所述的單個堿基插入或缺失造成翻譯期間的過早終止。本發(fā)明人證實在這些位點(diǎn)內(nèi)生成沉默突變引起所插入基因的穩(wěn)定I.新轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建和應(yīng)用新轉(zhuǎn)移載體pLW-73的構(gòu)建1.對MVA基因組的中央?yún)^(qū)域K7R-A24R檢驗1)痘病毒科或脊椎動物痘病毒亞科中保守的成對基因和2)處于相對方向從而其3'末端緊密接近的基因，因而提供不會破壞痘苗病毒啟動子的插入位點(diǎn)。選作新插入位點(diǎn)的所述位點(diǎn)位于兩個必需基因I8R與G1L之間。2.這種新載體的左側(cè)翼區(qū)以下列方式構(gòu)建；用限制酶EcoRI和XhoI切割質(zhì)粒LAS-I以除去delIIIMVA側(cè)翼區(qū)、GFP和MVA側(cè)翼區(qū)的同向重復(fù)序列。用AscI和SacI切割該插入物并分離GFP片段。PCR擴(kuò)增在I8R基因末端處的531個堿基對(包括TAA終止密碼子)，同時在PCR產(chǎn)物的末端帶EcoRI和AscI限制位點(diǎn)。用含有SacI和XhoI限制位點(diǎn)寡核苷酸進(jìn)行該同向重復(fù)序列的229堿基對(從I8R基因末端起，包括TAA終止密碼子)的PCR擴(kuò)增。連接全部四個DNA片段：1)帶EcoRI和XhoI末端的載體主鏈、2)含有I8R末端的帶EcoRI和AscI末端的新型左側(cè)翼區(qū)、3)帶AcsI和SacI末端的GFP和4)帶SacI和XhoI末端的I8R側(cè)翼區(qū)的同向重復(fù)序列以產(chǎn)生質(zhì)粒pLW-72。3.右側(cè)翼區(qū)產(chǎn)生如下：用限制酶PstI和HindIII切割質(zhì)粒LAS-I以釋放該質(zhì)粒中MVA的delIII側(cè)翼區(qū)。CR擴(kuò)增在G1L基因末端處的702個堿基對，同時在PCR產(chǎn)物的末端帶PstI和HindIII限制酶位點(diǎn)并且連接至pLW-72載體以產(chǎn)生pLW-73(圖7)。在圖8中給出pLW-73的序列。4.pLW-73的突出特征是：1)該載體設(shè)計用于在MVA基因組內(nèi)的必需基因之間插入外來基因。所述左側(cè)翼區(qū)由I8R基因的末端組成而右側(cè)翼區(qū)由G1L基因的末端組成。2)包括GFP基因以便容易地初始選擇重組病毒。3)由于GFP將在該重組病毒反復(fù)傳代時丟失，故GFP位于導(dǎo)致GFP瞬時表達(dá)的I8R基因同向重復(fù)序列的側(cè)翼。參考WO20041087201，在用于產(chǎn)生MVA/HIV重組的較早期質(zhì)粒pLAS-1和pLAS-2中也含有特征2和3。pLW-73的應(yīng)用1.將源自HIV-1進(jìn)化枝BADA分離株的env基因克隆至pLW-73并且產(chǎn)生重組MVA病毒。DNA測序證實env基因的位置和完整性。2.在MVA的缺失II位點(diǎn)中表達(dá)烏干達(dá)進(jìn)化枝D(分離株A07412)env基因的重組MVA病毒(圖9)證明是不穩(wěn)定的，即在培養(yǎng)物中反復(fù)連續(xù)傳代后，該基因從明顯比例的子代病毒中缺失。隨后將這種基因克隆至pLW-73并且產(chǎn)生重組MVA病毒及對其表征。該env基因插入在培養(yǎng)物中反復(fù)連續(xù)傳代后是穩(wěn)定的，即沒有發(fā)現(xiàn)插入的基因或MVA側(cè)翼區(qū)缺失。此外，當(dāng)該基因插入此位點(diǎn)時，沒有其它突變發(fā)生。II.對“熱點(diǎn)”的點(diǎn)突變對點(diǎn)突變的分析在MVA的缺失III位點(diǎn)中表達(dá)烏干達(dá)進(jìn)化枝D(分離株A03349)gagpol基因的重組MVA病毒證明是不穩(wěn)定的。主要的遺傳性變異是在成段4-6G或C殘基中生成單個點(diǎn)突變(表3)。此外，在源自相似重組病毒的無著色蝕斑中找到相似的點(diǎn)突變，其中所述的相似重組病毒表達(dá)來自HIV-1肯尼亞進(jìn)化枝A分離株和坦桑尼亞進(jìn)化枝C分離株的gagpol基因。熱點(diǎn)的誘變和對重組病毒中穩(wěn)定性的分析利用位點(diǎn)定向誘變，在來自HIV-1烏干達(dá)分離株的6個如此區(qū)域中產(chǎn)生沉默突變。將這種變異的基因UGD4dgagpolorf(圖10)克隆至pLAS-1并且如構(gòu)建不穩(wěn)定性病毒中所進(jìn)行那樣重組至MVA的相同缺失III位點(diǎn)內(nèi)。在培養(yǎng)物中反復(fù)連續(xù)傳代(8x)后，找到非表達(dá)性蝕斑。對第8病毒原液代的DNA測序驗證gagpol基因的完整性得到維持。III.雙重重組構(gòu)建體MVA/UGD4d病毒MVA/UGD4d病毒(表達(dá)烏干達(dá)亞型D15A07412包膜蛋白和A03349gagpol的重組病毒)以下列方式構(gòu)建：通過同源重組，利用穿梭質(zhì)粒pLW-73和pLAS-1將包膜蛋白基因和gagpol基因分別插入MVA1974/NIH克隆1。MVA/UGD4d通過在雞胚成纖維細(xì)胞中6輪蝕斑純化進(jìn)行分離并且隨后擴(kuò)增和表征?？偨Y(jié)1.構(gòu)建了指導(dǎo)外來基因在MVA基因組的保守中央?yún)^(qū)域中在兩個必需基因I8R和G1L之間重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體。證明該位點(diǎn)的使用抑制選擇到缺失所插入基因/MVA側(cè)翼區(qū)的突變病毒。2.通過位點(diǎn)定向誘變改變高度可突變性G和C殘基串并且產(chǎn)生在編碼序列中的沉默突變產(chǎn)生。證明這種變化在所述基因插入MVA的缺失III內(nèi)時使該基因穩(wěn)定。3.利用上述這兩種方法，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)烏干達(dá)進(jìn)化枝D的env和gagpol的UGD4d雙重MVA重組體。實施例1已經(jīng)產(chǎn)生表達(dá)來自不同分離株的HIV-1env和gagpol基因的重組MVA。所插入基因在組織培養(yǎng)反復(fù)傳代后的穩(wěn)定性已經(jīng)證明是可變的。這里，發(fā)明人(1)證實不穩(wěn)定性代表插入的基因自發(fā)性突變或缺失與選擇無表達(dá)突變體的組合并且(2)描述用于降低不穩(wěn)定性的新方法。概述構(gòu)建了表達(dá)來自眾多不同分離株的env和gagpol的重組MVA。每種病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行反復(fù)傳代以模擬對產(chǎn)生臨床試驗用病毒所需要的大規(guī)模擴(kuò)增。通過單個蝕斑的env和gag免疫染色法監(jiān)測插入穩(wěn)定性。對于一些重組病毒，發(fā)現(xiàn)env和/或gag表達(dá)在顯著比例的病毒群中迅速丟失。為鑒定表達(dá)丟失的機(jī)制，分離單個蝕斑并表征突變的本質(zhì)。在一些情況下，鑒定到傾向通過添加或缺失單個核苷酸而突變的特定DNA序列?？梢酝ㄟ^改變密碼子而不改變預(yù)測的翻譯產(chǎn)物而避免產(chǎn)生此類突變。在其它情況下，表達(dá)丟失由經(jīng)常延伸至側(cè)翼非必需MVA基因內(nèi)的大規(guī)模缺失所致。為防止這種情況出現(xiàn)，構(gòu)建了設(shè)計旨在將外來基因插入兩個MVA必需基因之間的新型穿梭質(zhì)粒。在所述位點(diǎn)內(nèi)的重組降低外來DNA的缺失。在一種情況下，然而，與HIVenv高水平表達(dá)相關(guān)的毒性是如此強(qiáng)烈，以至對稀有突變體的選擇仍然產(chǎn)生不穩(wěn)定的群體。在這種情況下，僅截短env的跨膜結(jié)構(gòu)域即可導(dǎo)致構(gòu)建穩(wěn)定的重組MVA。重組MVA的生成和所插入基因的穩(wěn)定性分析將Env和gagpol基因克隆至MVA穿梭載體。通過瞬時表達(dá)測定法分析表達(dá)和功能。將Gagpol重組至MVA1974/NIH克隆1。將重組MIVA經(jīng)6-8輪蝕斑純化，隨后擴(kuò)增病毒。將Env重組至MVA/gagpol分離株并且將雙重重組MVA(圖11A)經(jīng)6-8輪蝕斑純化并進(jìn)行擴(kuò)增。為評估插入物的穩(wěn)定性，將病毒在CEF細(xì)胞中使用感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)約1pfu/細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代以模擬大規(guī)模生產(chǎn)。通過確定表達(dá)env或gag的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，如通過用單克隆抗體的免疫染色法，評價穩(wěn)定性(圖11B)。重組MVA的穩(wěn)定性構(gòu)建了表達(dá)來自不同地理地區(qū)HIV-1分離株中基因的重組MVA。將env和gagpol基因分別插入MVA的缺失II和III；它們均處于修飾的H5啟動子控制下。在表4中顯示來自7種重組MVA的env和gagpol基因的穩(wěn)定性。在這7種病毒中觀察到不同程度的不穩(wěn)定性。在MVA/65A/G中，env的表達(dá)迅速丟失，到第6代僅25％的病毒粒子表達(dá)env。在MVA/UGD4a中，env和gagpol的表達(dá)隨病毒連續(xù)傳代而遞增性丟失。由于需要至少6-7次傳代以產(chǎn)生用于I期試驗的大量病毒，故認(rèn)為這兩種病毒不適用。分析MVA/65A/G的表達(dá)參照圖12，從MVA/65A/G的P3和P5中隨機(jī)挑取十三個蝕斑并且通過用T-24mAb(在a上顯示結(jié)合位點(diǎn))的免疫染色法、蛋白質(zhì)印跡法、PCR和測序法進(jìn)行分析。找到5個類型的蝕斑并且在圖12右側(cè)給出對每種類型所獲得的蝕斑的數(shù)目。蝕斑a、b和c著色，不過b和c是截短形式，原因是堿基置換(產(chǎn)生終止密碼子)(b)和缺失env基因末端和MVA側(cè)翼區(qū)(flank)的部分(c)。無著色蝕斑d和e因向一個5G段添加G而造成移碼(d)和完整env基因及部分MVA側(cè)翼區(qū)的大規(guī)模缺失(e)而產(chǎn)生。因此，堿基對的添加、置換和缺失均對MVA/65A/G中env基因的不穩(wěn)定表達(dá)有貢獻(xiàn)。挑取這種A/Genv(加以研究的最不穩(wěn)定性實施例)以研究可能增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾。對A/G構(gòu)建體增加穩(wěn)定性的修飾1.通過防止點(diǎn)突變的沉默突變除去4和5G與C段(run)而產(chǎn)生合成性包膜蛋白。2.構(gòu)建了載體I8/G1即pLW-73，其在必需基因I8R和G1L之間帶有防止發(fā)生基因和MVA側(cè)翼區(qū)缺失的插入位點(diǎn)。MVA的I8R(500bp)和G1L(750bp)基因的末端通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增并插入含有控制外來基因表達(dá)的痘苗病毒早期/晚期mH5啟動子的載體。使用這種I8/G1載體以將外來基因通過同源重組插入MVA(圖13)。缺失所插入的基因和在該插入基因側(cè)翼的MVA將是不可行的，因為將不會缺失必需基因的部分。因此，帶這些突變的病毒將不能夠生長超過具有正常生長優(yōu)勢的群體。3.通過缺失gp41的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾使A/Ggp140包膜蛋白突變，從而產(chǎn)生分泌蛋白。測試增加穩(wěn)定性的修飾如14圖中所示，用env修飾和/或使用新載體產(chǎn)生7個單一重組病毒。分離每種病毒的5個蝕斑并將其在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中獨(dú)立傳代以確定修飾是否增強(qiáng)包膜蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。傳代的蝕斑通過用mAbT-43(結(jié)合位點(diǎn)定位至env第101-125位氨基酸)的免疫染色法、蛋白質(zhì)印跡法、PCR和測序法進(jìn)行分析。蝕斑傳代后的Env表達(dá)參考圖15，上文所列7種重組體的5個獨(dú)立傳代的蝕斑分離株在第1、3、5和7代通過用mAbT-43(結(jié)合在gp120第101-125位氨基酸之間)的免疫染色法進(jìn)行表征。7種病毒中的4種病毒(圖15，a、b、c、e)在全部5個傳代蝕斑中具有不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達(dá)；(圖15f)的兩個蝕斑傳代也具有不穩(wěn)定的env表達(dá)。這些病毒包括在MVA基因組delII(圖15c)和必需基因位點(diǎn)(圖15f)內(nèi)均具有合成性env的病毒。僅含有截短分泌性gp140作為包膜蛋白的重組病毒保持穩(wěn)定表達(dá)的包膜蛋白(圖15，d和g)。蛋白質(zhì)印跡法、PCR和序列分析法從選擇的蝕斑傳代中，挑取克隆以通過蛋白質(zhì)印跡法、PCR和序列分析法分析蛋白質(zhì)表達(dá)(圖16)。對于蛋白質(zhì)印跡分析法，分別使用在進(jìn)化枝A包膜蛋白的始端和末端處結(jié)合的T-24和T-32以確定是否僅產(chǎn)生部分長度或完整長度的包膜蛋白。標(biāo)為c的對照病毒位于每個印跡物的右側(cè)。對于在MVA的缺失II中所產(chǎn)生的三種病毒(圖16a、b和c)，僅在圖16c(即gp140克隆)中均是表達(dá)在Western內(nèi)可檢測蛋白的克隆。這種蛋白質(zhì)(如由T-32測量)不是截短型的。當(dāng)通過載體I8/G1將包膜蛋白基因插入必需基因位點(diǎn)時(圖16d、e和f)，再次，僅gp140包膜蛋白在全部克隆中表達(dá)并且不是截短型的。雖然I8/G1載體的使用沒有防止env序列突變，不過它的確阻止已經(jīng)在插入delII的包膜蛋白基因中所見到的缺失。(注意陽性PCR產(chǎn)物源于I8/G1載體的全部所測試克隆，但是陰性PCR產(chǎn)物源于使用delII載體測試的克隆)。Env在進(jìn)化枝A/G雙重重組體中的表達(dá)基于用單一env分析法的先前結(jié)果，產(chǎn)生用gp140或合成性gp160基因表達(dá)gagpol的雙重重組體并且對其測試env表達(dá)的穩(wěn)定性(圖17)。如前所述，從每種病毒中分離5個蝕斑，并且對其傳代7次以分析env表達(dá)的穩(wěn)定性。在第7代上，傳代蝕斑以T-43和T-32mAb(其分別結(jié)合gp120和gp41)進(jìn)行免疫染色。借助T-43mAb，表達(dá)合成性包膜蛋白的重組體的5個克隆之一僅由無著色蝕斑組成。隨后對這些這些蝕斑進(jìn)行T-32染色，顯示另一個蝕斑具有截短包膜蛋白的表達(dá)。通過T-43和T-32免疫染色法顯示來自含有g(shù)p140包膜蛋白的雙重重組體中的全部傳代蝕斑是穩(wěn)定的。其滴度也比其它雙重重組體高2log。因此，僅可能用gp140包膜蛋白產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)包膜蛋白的進(jìn)化枝A/G雙重重組體。表達(dá)來自烏干達(dá)HIV-1分離株的env和gagpol的重組病毒如18圖中所示構(gòu)建了表達(dá)來自烏干達(dá)分離株A07412和A03349的HIV-1env與gagpol基因的重組MVA病毒。每種重組MVA病毒的4-6個獨(dú)立分離株進(jìn)行連續(xù)傳代并且發(fā)現(xiàn)這兩個基因均是不穩(wěn)定的，無論是單獨(dú)表達(dá)或聯(lián)合表達(dá)(表5)。相反，gp140的表達(dá)，而不是膜結(jié)合性gp160的表達(dá)，導(dǎo)致env基因在連續(xù)傳代后的穩(wěn)定(圖18和表5)。MVA/UGD4a–無著色env蝕斑的分析為確定不穩(wěn)定性的機(jī)制，將24個獨(dú)立的無著色蝕斑(使用MabT-43)從MVA/UGD4a第6代中分離、擴(kuò)增和表征。通過PCR擴(kuò)增和DNA測序鑒定到兩個小缺失(1.2和0.3kb)(圖19)。全部其它分離株含有延伸至MVA側(cè)翼區(qū)內(nèi)的極大規(guī)模缺失。使用來自env基因或MVA側(cè)翼區(qū)內(nèi)部的引物對鑒定到這些缺失的大致斷點(diǎn)。在重組MVA中修飾UGDenv基因為改進(jìn)UGDenv基因的不穩(wěn)定性問題，使用新載體I8/G1，將A07412env基因插入MVA，其中所述的新載體指導(dǎo)外來基因插入痘苗病毒的2個必需基因I8與G1之間并且使用修飾的H5啟動子(圖20)。將四個獨(dú)立蝕斑連續(xù)傳代并通過用MabT-43和T-32的免疫染色法在第5代對其分析env表達(dá)。在全部分離株中，A07412env基因是穩(wěn)定的(表6)。MVA/UGD4b-無著色gag蝕斑的分析為確定gag基因的不穩(wěn)定性機(jī)制，將8個獨(dú)立的無著色蝕斑(使用Mab183-H12-5C-NIAJDAIDSRepository)從MVA/UGD4b第6代中挑取、擴(kuò)增，并且將gagpol插入物測序(表7)。7個分離株中在第564-569位置處發(fā)現(xiàn)單個G殘基插入或缺失。在一個分離株中，一個C殘基從位置564-569處的序列CCCC中缺失。另外，來自MVNKEA和MVA/TZC高代原液的無著色蝕斑揭示相似的突變熱點(diǎn)，即，第564-569位置。檢驗UGDA07412gagpol基因的全序列顯示22段4個或4個以上G或C殘基(圖21)。在重組MVA中修飾UGDgagpol基因由于gag基因的不穩(wěn)定性機(jī)制主要是單個核苷酸在一段4-6G或C殘基內(nèi)插入或缺失，故改進(jìn)該基因穩(wěn)定性的策略是在這類位點(diǎn)處產(chǎn)生沉默突變。因此，在p17和p24gag中6個位點(diǎn)處采用位點(diǎn)定向誘變(表3)。證明連續(xù)傳代時，在相同位置即缺失III處插入MVA的所得密碼子變異(c.a.)的基因是穩(wěn)定的(圖22和表8)。構(gòu)建表達(dá)UGDenv和gagpol的穩(wěn)定重組MVA構(gòu)建了這樣的重組病毒，其表達(dá)在I8/G1基因座內(nèi)的UGDenv基因和在MVA的缺失III內(nèi)的密碼子變異的gagpol基因(圖23)。連續(xù)傳代證明這兩種基因均是穩(wěn)定的。另外，蛋白質(zhì)表達(dá)的水平和DNA序列在傳代期間是不改變的(表9)。結(jié)論env和gagpol插入物的不穩(wěn)定性歸因于點(diǎn)突變的生成和缺失和無表達(dá)的MVA突變體的生長優(yōu)勢。不穩(wěn)定性可以通常地通過密碼子改變和/或插入MVA基因組(MVA/UGD4d)的必需區(qū)域而降低，不過在一種情況下env必須加以改變(MVA/65A/G)。實施例2MVA/UGD4d在BALB/c小鼠中的免疫原性含10只小鼠的組用106或107感染單位的MVA/UGD4d通過免疫腹膜內(nèi)途徑免疫。各含5小鼠的組類似地用親代MVA-1974免疫。小鼠在第0和第3周進(jìn)行免疫并且在第0、3和5周放血。在第5周收集脾臟。在新鮮脾細(xì)胞中通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法測量細(xì)胞應(yīng)答。脾細(xì)胞分別用以下物質(zhì)刺激:1)免疫優(yōu)勢性gag肽(AMQMLKETI(SEQIDNO:6))、2)env肽(DTEVHNVWATHACVP(SEQIDNO:7)和QQQSNLLRAIEAQQH(SEQIDNO:8))、3)pol肽(具有HGVYYDPSKDLIAE(SEQIDNO:10)和ELRQHLLRWGLTT(SEQIDNO:9)的單一氨基酸變體的8種肽)和4)MVA。就CD4和CD8的表面表達(dá)并隨后就IFN-γ和IL2或TNF的胞內(nèi)表達(dá)對細(xì)胞染色。如24圖中所示，MVA/UGD4d激發(fā)針對gag肽、pol肽和MVA的CD8/IFN-γ應(yīng)答。gag肽應(yīng)答是多功能性的，從而表達(dá)IFN-γ和IL2或TNF。另外，激發(fā)針對env肽匯集物的CD4/IFN-γ應(yīng)答。體液應(yīng)答由ELISA測量(圖25)。針對UGDenv的強(qiáng)烈應(yīng)答在首次免疫后3周得到證實并且通過第二次免疫進(jìn)行強(qiáng)化。此外，在一次和兩次免疫后激發(fā)強(qiáng)烈的痘苗病毒應(yīng)答。表3.產(chǎn)生旨在消除成段G和C(HIV-1分離株A03349)的MVA/UGD核苷酸變化始于ATG的核苷酸#原始序列修飾的序列28-32GGGGGGGAGG70-74GGGGGGGAGG408-411GGGGGGGA530-533CCCCCACC564-569GGGGGGAGGAGG686-689GGGGGAGG表5.表達(dá)來自烏干達(dá)HIV-1分離株的env和gagpol的重組病毒表6.在重組MVA中env和gagpol基因的修飾表7.MVA/UGD4b-無著色蝕斑的分析#帶突變的單個蝕斑表8.在重組MVA中修飾UGDgagpol基因表9.構(gòu)建表達(dá)UGDenv和gagpol的穩(wěn)定重組MVA***盡管于清晰和理解的目的，本發(fā)明已經(jīng)以某些細(xì)節(jié)加以描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以在形式和細(xì)節(jié)上提出各種改變而不脫離把本發(fā)明的真實范圍。上文參考的全部圖片、表格和附注以及專利、申請和出版物因而通過引用的方式并入。當(dāng)前第1頁1 2 3